布魯氏菌病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)的研究進(jìn)展

趙洪進(jìn)，屠益平，沈素芳，孫泉云，夏爐明，唐文紅，劉佩紅

（上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

布魯氏菌病是由布魯菌引起的一種重要人獸共患病，在世界各地廣泛流行。近年來，我國(guó)畜間和人間布魯氏菌病均呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，給畜牧業(yè)和人民身體健康造成了巨大損失。及時(shí)準(zhǔn)確診斷是防治布魯氏菌病的一個(gè)有效手段，100多年來，各國(guó)學(xué)者進(jìn)行了大量研究和探索，其中實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)得到了快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。本文就布魯氏菌實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究進(jìn)展作一簡(jiǎn)要綜述。

1 病原學(xué)診斷

1.1 染色鏡檢

采集流產(chǎn)胎衣、絨毛膜水腫液、肝、脾、淋巴結(jié)、胎兒胃內(nèi)容物等組織，制成抹片，用柯茲羅夫斯基染色法染色，鏡檢，布魯氏菌為紅色球桿狀小桿菌，而其它菌為藍(lán)色。該方法常應(yīng)用于對(duì)流產(chǎn)物質(zhì)的分析，但不具有特異性，因?yàn)橐恍?dǎo)致流產(chǎn)的病原體如流產(chǎn)衣原體以及貝氏立克次氏體也能夠被染成紅色。

1.2 分離培養(yǎng)

布魯氏菌可以用胰蛋白胨瓊脂、血液瓊脂、肝湯瓊脂等培養(yǎng)基進(jìn)行分離培養(yǎng)，通過菌體形態(tài)、染色特征、菌落形態(tài)、生長(zhǎng)特性、生化反應(yīng)特點(diǎn)以及布魯氏菌多克隆抗體凝集試驗(yàn)等方法進(jìn)行鑒定。布魯氏菌的分離培養(yǎng)是診斷布魯氏菌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但是由于布魯氏菌的分離率較低、所需時(shí)間較長(zhǎng)（至少3～8天，有時(shí)甚至達(dá)45天）、生物安全要求較高，因此不適合普遍應(yīng)用。

1.3 分子生物學(xué)檢測(cè)

布魯氏菌分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)是近年來的研究熱點(diǎn)，它可以從多方面揭示布魯氏菌各型之間的區(qū)別和關(guān)聯(lián)，目前主要有DNA同源性測(cè)定、多種PCR分析、核酸探針、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增等技術(shù)。

1.3.1 DNA同源性測(cè)定 布魯氏菌最早通過測(cè)DNA（G+C）mol%值以及染色體大小的方法來區(qū)分。對(duì)微生物來說，DNA（G+C）mol%值和染色體大小一般是恒定的。經(jīng)過測(cè)定發(fā)現(xiàn)布魯氏菌各型之間表現(xiàn)為高度同源性，甚至有學(xué)者提出布魯氏菌只有一個(gè)種屬。通過這種檢測(cè)方法只能確定菌屬，對(duì)于布魯氏菌各型的區(qū)分則無能為力，加之方法繁瑣、費(fèi)用高，不適合普通實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。但是這些方法是布魯氏菌基因研究的一些基礎(chǔ)工作，為后來的分子生物學(xué)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。

1.3.2 PCR技術(shù) 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR技術(shù)逐步成為布魯氏菌檢測(cè)的重要手段。自1990年Feteke等[1]首次應(yīng)用PCR技術(shù)診斷布魯氏菌病以來，該項(xiàng)技術(shù)得到了快速發(fā)展。PCR研究方法很多，可以歸納為單對(duì)引物PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)PCR等。單對(duì)引物PCR較早用于布魯氏菌屬的檢測(cè)，檢測(cè)所使用的擴(kuò)增模版和手段很多，常選用的有16SrRNA、IS711、VirB8、bcsp31、外膜蛋白 omp2b、omp2a、omp31和omp25等。Imaoka等[2]以bcsp31基因和三種外膜蛋白基因（omp2b，omp2a，omp31）為靶基因，設(shè)計(jì)4對(duì)引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，對(duì)羊種布魯氏菌、牛種布魯氏菌、豬種布魯氏菌及犬種布魯氏菌進(jìn)行了檢測(cè)。Ouahrani-Bettache等[3]根據(jù)IS6501在不同種及生物型布魯氏菌基因中的位置及數(shù)目不同，設(shè)計(jì)了IS6501錨定PCR，該方法不僅可以區(qū)分不同的布魯氏菌種，而且可以區(qū)分野毒株和A19疫苗株，對(duì)于流行病學(xué)調(diào)查有著非常重要的意義。盡管單對(duì)引物PCR可以檢測(cè)到任何含有布魯氏菌DNA的標(biāo)本，應(yīng)用范圍較傳統(tǒng)血清學(xué)方法和微生物方法更為廣泛，但是對(duì)于布魯氏菌的生物型，只使用單對(duì)引物是無法做到完全區(qū)分的，有的甚至是不能區(qū)分的。單對(duì)引物方法具有局限性，而擁有多個(gè)引物的多重PCR可以將布魯氏菌鑒定到生物型的水平。Bricker等[4]建立了AMOS（abortus melitensis ovis suis）PCR，是最早建立的多重PCR方法。該試驗(yàn)可以鑒別牛種1、2和4型，羊種1、2、3型，綿羊副睪種和豬種1型布魯氏菌。后來Ewalt等[5-6]兩次改進(jìn)了AMOS PCR，使該法可以鑒別的菌種類型進(jìn)一步完善。國(guó)內(nèi)鐘旗等[7]應(yīng)用AMOS PCR開展了布魯氏菌種型鑒定研究，結(jié)果表明該方法的特異性、敏感性均高于細(xì)菌分離和血清學(xué)診斷方法，且能區(qū)分各種和部分生物型。實(shí)時(shí)（Real-time）PCR是新近發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)，其最突出特點(diǎn)是快速、無需電泳并能避免污染。Redkar等[8]于2000年應(yīng)用Real-time PCR鑒別了牛種、羊種、豬種布魯氏菌3個(gè)種。劉志國(guó)等[9]建立的基于TaqMan探針的多重實(shí)時(shí)熒光PCR方法能快速檢測(cè)布魯氏菌的同時(shí)并可以確定是否為牛種或羊種布魯氏菌。PCR技術(shù)除了可以應(yīng)用于布魯氏菌種屬的區(qū)分鑒別以外，還可以根據(jù)某些特定的序列描述新種和菌株特征。Cloeckaert等[10]用PCR方法擴(kuò)增布魯氏菌的BP26基因，得到1 029 bp和1 900 bp，1 029 bp是所有布魯氏菌的6種共有的序列，而1900bp是海洋種布魯氏菌特有的產(chǎn)物。他還檢測(cè)了7個(gè)LPS-O鏈合成的相關(guān)基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在粗糙型布魯氏菌中不存在有意義的差異，據(jù)此他們認(rèn)為omp2位點(diǎn)的RFLPPCR是一個(gè)首選的區(qū)分和鑒別布魯氏菌以及描述新種和菌株特征的序列[11]。

1.3.3 核酸探針技術(shù) 依據(jù)核苷酸的嚴(yán)格配對(duì)發(fā)展起來的核酸探針雜交技術(shù)具有靈敏度高，特異性好，一次性可以檢測(cè)大量樣本的優(yōu)點(diǎn)，該方法操作簡(jiǎn)便，不需要特殊的儀器設(shè)備，適合用于臨床樣本的檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。探針可以重復(fù)多次利用，大大降低了檢測(cè)的成本。該方法不僅可以診斷布魯氏菌病還可以鑒定布魯氏菌的不同種型，是臨床應(yīng)用的一種重要的診斷方法。Fernander等[12]以牛種布魯氏菌16SrRNA序列制備熒光寡核苷酸探針，對(duì)所有種型的代表菌株以及9株不同的臨床分離株進(jìn)行雜交檢測(cè)，結(jié)果該方法可將豬種布魯氏菌2、3、4、5生物型與其它種型布魯氏菌鑒別區(qū)分開。

1.3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）LAMP和PCR技術(shù)一樣也是通過擴(kuò)增布魯氏菌的特異的序列對(duì)檢測(cè)的病原作出診斷鑒定，但是PCR技術(shù)需要特殊的儀器設(shè)備，無法滿足基層的要求，而LAMP以其簡(jiǎn)便、靈敏、快速、特異的優(yōu)勢(shì)被大量研究，并在多種病原微生物的感染診斷中得到了成功應(yīng)用。新型可視化LAMP的出現(xiàn)使該方法的應(yīng)用更加簡(jiǎn)便、安全，直接可以通過肉眼觀察判定結(jié)果，很多實(shí)驗(yàn)室在LAMP應(yīng)用于布魯氏菌病的診斷中也進(jìn)行了大量的探索。潘文等[13]根據(jù)布魯氏菌種特異的omp25基因建立了應(yīng)用于布魯氏菌病檢測(cè)的新型可視化LAMP，并用所建立的方法對(duì)布魯氏菌S19株、S2株和M5株3株弱毒疫苗進(jìn)行檢測(cè)，均顯示陽性擴(kuò)增結(jié)果。許鄒亮等[14]建立的LAMP最低檢出限約為17 fg布魯氏菌基因組DNA，顯示了良好的靈敏性?？梢暬疞AMP方法的特異性和靈敏性均比較高，陽性結(jié)果會(huì)直接產(chǎn)生顏色變化，檢測(cè)結(jié)果無需開蓋分析即可用肉眼觀察獲得，一步即可完成LAMP擴(kuò)增及結(jié)果的判定，降低了布魯氏菌造成的生物安全威脅，適合在基層廣泛推廣應(yīng)用。

2 免疫學(xué)診斷

在布魯氏菌病大規(guī)模檢疫診斷中，免疫學(xué)方法仍是最常用的技術(shù)。目前常用免疫學(xué)方法主要包括虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）、全乳環(huán)狀試驗(yàn)（MRT）、試管凝集試驗(yàn)（SAT）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、熒光偏振測(cè)試（FPA）、膠體金免疫層析法（GICA）等。

2.1 虎紅平板凝集試驗(yàn)（RBT）

在免疫學(xué)方法中，RBT是最簡(jiǎn)單的方法。虎紅平板凝集抗原是用抗原性較好的流產(chǎn)布魯氏菌經(jīng)培養(yǎng)、滅活并用虎紅染色液染色，懸浮于乳酸緩沖液中制成，該方法靈敏度高，價(jià)格便宜，操作方便，檢測(cè)快速，適于動(dòng)物群體布魯氏菌病的普查。在國(guó)際貿(mào)易中是牛、羊、豬布魯氏菌病檢測(cè)的指定試驗(yàn)。

2.2 全乳環(huán)狀試驗(yàn)（MRT）

MRT以染色的布魯氏菌全菌作為診斷抗原，可用其檢測(cè)混合奶樣，當(dāng)存在布魯氏菌抗體時(shí)，紅色的抗原抗體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到乳脂層，形成有色乳脂環(huán)（紅色為紫紅色）。MRT被認(rèn)為缺乏敏感性，但由于檢測(cè)成本低廉，這種缺陷可通過反復(fù)檢測(cè)來加以彌補(bǔ)。OIE規(guī)定MRT只能用于奶牛檢測(cè)。

2.3 試管凝集試驗(yàn)（SAT）

早在1897年SAT就已應(yīng)用，時(shí)隔一百多年，該方法仍是免疫學(xué)診斷布魯氏菌病的基石，在幾個(gè)已宣稱為“無布病”國(guó)家的布病根除運(yùn)動(dòng)中都得到了良好的應(yīng)用，也是我國(guó)法定的診斷布魯氏菌病的方法。該方法準(zhǔn)確性高，可以半定量，具有較高的敏感性和特異性。但該方法繁瑣費(fèi)事，不適于現(xiàn)場(chǎng)操作，而且和RBT一樣，容易出現(xiàn)假陽性或假陰性[15]。

2.4 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（CFT）

CFT用于檢測(cè)由抗布魯氏菌抗體激活的補(bǔ)體，也是我國(guó)診斷布魯氏菌病的法定診斷方法。該方法特異性較強(qiáng)，對(duì)于診斷牛、羊布魯氏菌病的臨床診斷有很高的價(jià)值，由于豬的補(bǔ)體會(huì)干擾豚鼠補(bǔ)體的作用，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的敏感性降低，因此補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)不適合豬布魯氏菌病的檢測(cè)。該方法的實(shí)驗(yàn)條件要求很高，過程十分復(fù)雜，難于標(biāo)準(zhǔn)化，正逐漸被ELISA所取代。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

ELISA是20世紀(jì)70年代發(fā)展起來的一種新型布魯氏菌病快速檢測(cè)技術(shù)，具有很強(qiáng)的敏感性和特異性，敏感性比SAT高10～100倍，2000年，國(guó)際貿(mào)易組織將其列為檢測(cè)牛布魯氏菌病的指定診斷方法。目前常用的ELISA方法有間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（iELISA）、競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（cELISA）和斑點(diǎn)酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（Dot-ELISA）。Vanzini等[16]應(yīng)用iELISA方法對(duì)奶牛布魯氏菌病診斷效果進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明，奶樣敏感性為99.6%，特異性為99.1%；血清的敏感性為99.6%，特異性為98.6%。雖然iELISA是高度敏感的方法，但是它的缺點(diǎn)是不能分辨出接種牛種布魯氏菌S19或羊種Rev1疫苗與自然感染產(chǎn)生的抗體[17]。因此，iELISA更多的應(yīng)用于非免疫家畜普查檢測(cè)而不是免疫家畜的診斷方法。競(jìng)爭(zhēng)性抗體能有選擇地抑制結(jié)合疫苗所產(chǎn)生的抗體而不是野毒株所產(chǎn)生的抗體，可消除因接種疫苗而產(chǎn)生的殘余抗體所引起的大部分反應(yīng)。Weynants等[18]以辣根過氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體12G12和羊種布魯氏菌疫苗株Rev1的光滑型LPS建立了cELISA，并對(duì)936 份血清樣本檢測(cè)，結(jié)果證明其特異性高于CFT和RBT。2004 年，cELISA方法以其高特異性和敏感性的優(yōu)點(diǎn)被OIE列為診斷和清除牛布魯氏菌病的推薦方法。Chand等[19]將布魯氏菌超聲裂解抗原點(diǎn)在硝酸纖維素膜上作Dot-ELISA 檢測(cè)牛布魯氏菌抗體，結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)單、快速、敏感性高，而且結(jié)果易于判定，適宜在廣大基層單位應(yīng)用。

2.6 熒光偏振測(cè)試（FPA）

FPA是一種利用物質(zhì)分子在溶液中旋轉(zhuǎn)速度與分子量大小呈反比的特點(diǎn)，定量檢測(cè)抗原或抗體的一種分析方法。王玉玲等[20]應(yīng)用熒光偏振檢測(cè)方法對(duì)出口牛進(jìn)行了布氏桿菌病檢測(cè)，結(jié)果顯示FPA從敏感性和特異性上都優(yōu)于或等于目前主要采用的RBT、SAT、CFT、ELISA檢測(cè)方法。FPA方法簡(jiǎn)便、快速、通量大，適合于大批量布氏桿菌病的檢疫、篩查和疫病監(jiān)控。FPA已用于北美和歐洲的布病根除運(yùn)動(dòng)，是OIE規(guī)定的“貿(mào)易適用”方法。

2.7 膠體金免疫層析法（GICA）

GICA是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物，應(yīng)用于抗原抗體反應(yīng)中的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)。用該技術(shù)檢測(cè)組織切片中的菌體抗原，敏感性高于ELISA和PCR，最小檢出量可達(dá)200 CFU/mL。朱曉東等[21]將布魯氏菌可溶性抗原結(jié)合于硝酸纖維素膜上，結(jié)合羊抗人IgG 做標(biāo)記抗體，建立斑點(diǎn)免疫金滲濾測(cè)定法，檢測(cè)布魯氏菌感染者血清抗體，結(jié)果免疫滲濾法敏感性為98%，特異性為100%。GICA 特異性、敏感性較高，而且簡(jiǎn)便快速，除試劑外不需任何儀器，比較適合于流行病學(xué)調(diào)查及野外現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

3 結(jié)語

綜上所述，目前國(guó)內(nèi)外布魯氏菌病的診斷方法較多，各種診斷方法也不能相互取代，但法定的檢測(cè)手段仍以細(xì)菌學(xué)和常規(guī)免疫學(xué)檢測(cè)為主。隨著ELISA和分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，以其敏感性高、特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便快速的特點(diǎn)，逐漸成為布魯氏菌病檢測(cè)的重要手段，逐步在布魯氏菌病防治方面發(fā)揮越來越大的作用。

[1]Fekete A，Bantle JA，Hailing SM，et al.Preliminary development of a diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction[J].Appl Bacteriol，1990，69（2）：216-227.

[2]Imaoka K，Kimura M，Suzuki M，et al.Simultaneous detection of the genus Brucella by combinatorial PCR[J].Jpn J infect dis，2007，60（2/3）：137-139.

[3]Ouahrani-Bettache S，Soubrier MP，Liautard JP.IS6501-anchored PCR for the detection and identification of Brucella species and strains[J].J Appl Bacteriol，1996，81（2）：154-160.

[4]Bricker BJ，Halling SM.Differentiation of Brucella abortus bv.1，2，and 4，Brucella melitensis，Brucella ovis，and Brucella suis bv.1 by PCR[J].J Clin Microbiol，1994，32（11）：2660-2666.

[5]Ewalt DR，Bricker BJ.Validation of the abbreviated Brucella AMOS PCR as a rapid screening method for differentiation of Brucella abortus field strains，19 and RB51[J].J Clin Microbiol，2000，38（8）：3085-3086.

[6]Bricker BJ，Ewalt DR，Olsen SC，et al.Evaluation of the Brucella abortus species specific polymerase chain reaction assay，an improved version of the Brucella AMOS polymerase chain reaction assay for cattle[J].J Vet Diagn Invest，2003，15（4）：374-378.

[7]鐘旗，范偉興，何倩倪，等.用AMOS-PCR對(duì)布魯氏桿菌種型鑒定的研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2007，23（7）：683-686.

[8]Redkar R，Rose S，Bricker B，et al.Real-time detection of Brucella bortus，Brucella melitensis and Brucella suis[J].Mol Cell Probes，2001，15（1）：43-52.

[9]劉志國(guó)，羅成旺，張利，等.多重?zé)晒舛縋CR方法鑒定布魯氏菌屬及牛羊種布魯氏菌研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2012，28（9）：869-874.

[10]Cloecaert A，Crayon M，Grepinet O，et al.An IS711 Element Downstream of the bp26 Gene Is a Specific Marker of Brucella spp.Isolated from Marine Mammals[J].Clin Diagn Lab Immunol，2000，7（5）：835-839.

[11]Cloecaert A，Crayon M，Verger J M，et al.Conservation of Seven Genes Involved in the Biosynthesis of the Lypopolysacchride O-side Chain in Brucella spp[J].Res Microbio，2000，151（3）：209-216.

[12]Farnander LL，Vallejo FJ，Trujilano I，et al.Fluorecent Wholecell Hybridization with 16S rRNA-targated Oligonucleotide Probes to Identify Brucella spp.by Flow Cytomety[J].Clin Microbiol，2000，38（7）：2768-2771.

[13]潘文，李珊珊，趙明秋，等.新型可視化LAMP檢測(cè)布魯氏菌方法的建立及初步應(yīng)用[C]//中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)生物制品學(xué)分會(huì).第三屆中國(guó)獸藥大會(huì)學(xué)術(shù)論壇論文集.北京：中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)生物制品學(xué)分會(huì)，2010：336-341.

[14]許鄒亮，南文龍，周潔，等.布魯氏菌環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）可視化檢測(cè)方法的建立[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2011，28（8）：37-40.

[15]范偉興，鐘旗，何倩倪，等.幾種布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法的比較研究[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2006，23（6）：31-33.

[16]Vanzini V R，Aguirre W，Lugaresi C I，et al.Evaluation of an indirect ELISA for the diagnosis of bovine brucellosis in milk and serum samples in dairy cattle in Argentina[J].Prev Vet Med，1998，36（3）：211-217.

[17]Nielsen KJ，Cherwonogrodsky RD.Enzyme immunoassay for the differentiation of antibody response of Brucella abortus infected and vaccinated cattle[J].Am J Vet Res，1989，50（1）：5-9.

[18]Weynants V，Gilson D，Cloeckaert A，et al.Characterization of a monoclonal antibody specific for Brucella smooth lipopolysaccharide and development of a competitive enzymelinked immunosorbent assay to improve the serological diagnosis of brucellosis[J].Clin Diagn Lab Immunol，1996，3（3）：309-314.

[19]Chand PJ，Sadana HV，Batra RN，et al.Comparison of dot enzyme-linked immunosorbent assay（Dot-ELISA）with other serological tests for the detection of brucella antibodies in bovine sera[J].J Vet Med Series B，1989，36（5）：346-352.

[20]王玉玲，柴銘駿，劉紅梅.應(yīng)用熒光偏振檢測(cè)方法對(duì)出口牛進(jìn)行布氏桿菌病檢測(cè)[J].中國(guó)動(dòng)物檢疫，2012，29（5）：51-52.

[21]朱明東，徐衛(wèi)民，洪林娣，等.斑點(diǎn)金免疫滲濾法快速診斷布魯桿菌病的研究[J].中國(guó)地方病學(xué)雜志，2006，25（3）：326-327.