前列腺切除術(shù)后尿道修復(fù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

唐小虎羅光恒

1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003；貴州省人民醫(yī)院泌尿外科，貴州 貴陽(yáng) 550002

前列腺切除術(shù)后尿道修復(fù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

唐小虎1羅光恒2

1.遵義醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563003；貴州省人民醫(yī)院泌尿外科，貴州 貴陽(yáng) 550002

目的：探討前列腺切除術(shù)后前列腺部尿道再上皮化來(lái)源、過(guò)程、機(jī)制，以及前列腺部相關(guān)干細(xì)胞是否參與修復(fù)過(guò)程。方法：建立2微米激光犬前列腺切除模型，術(shù)后3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、12周在膀胱鏡下觀察前列腺部尿路上皮的修復(fù)過(guò)程，在創(chuàng)面部位取活檢標(biāo)本，行HE染色以及免疫組化（PSA、CK34、P63、CD133和UPS），在顯微鏡下觀察尿路上皮的修復(fù)過(guò)程。結(jié)果：膀胱鏡和顯微鏡下均未發(fā)現(xiàn)前列腺切除術(shù)后創(chuàng)面周?chē)Ｄ蚵飞掀は騽?chuàng)面爬行生長(zhǎng)，而尿路上皮再生的主要細(xì)胞來(lái)源于前列腺細(xì)胞。再生的尿路上皮隨著修復(fù)的進(jìn)行逐漸表達(dá)UPS、P63、CK34、CD133，但不表達(dá)PSA。結(jié)論：前列腺切除術(shù)后前列腺部尿道的再上皮化來(lái)自于創(chuàng)面周?chē)５哪蚵飞掀た赡苄孕?，尿道再上皮化的重要?xì)胞來(lái)源可能是前列腺組織細(xì)胞，而前列腺部的相關(guān)干細(xì)胞可能參與修復(fù)過(guò)程。

尿路上皮；再上皮化；良性前列腺增生；干細(xì)胞

良性前列腺增生切除術(shù)后前列腺部存在著術(shù)后創(chuàng)面、尿道水腫、壞死組織，前列腺部的尿路上皮再生后有助于創(chuàng)面的封閉，使尿道的結(jié)構(gòu)和功能都逐漸恢復(fù)至正常。尿路上皮再生是良性前列腺增生術(shù)后尿道修復(fù)的關(guān)鍵。

傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為良性前列腺增生切除術(shù)后膀胱頸口的正常尿路上皮是前列腺尿路上皮再上皮化的主要來(lái)源。但前列腺切除術(shù)后的修復(fù)方式目前還沒(méi)有統(tǒng)一的結(jié)論，Eduardo［1］等就認(rèn)為尿道再上皮化的原因是由于殘余的腺泡和導(dǎo)管上皮組織增生的細(xì)胞遷移而來(lái)，同時(shí)他們的研究還表明激光熱凝固和TURP是部分皮層損傷，類(lèi)似于II度皮膚燒傷。

成體干細(xì)胞已經(jīng)在很多成體組織中發(fā)現(xiàn)，包括表皮干細(xì)胞［2］、間充質(zhì)干細(xì)胞［3］、造血干細(xì)胞［4］等。同樣，目前的研究也表明前列腺部也可能存在著成體干細(xì)胞，它的位置可能位于前列腺基底細(xì)胞層，并且可能與良性前列腺增生和前列腺腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)［5－6］。前列腺成體干細(xì)胞有可能參與前列腺切除術(shù)后尿道修復(fù)的過(guò)程。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 成年未去勢(shì)雄性家犬30只，年齡大小約6歲，體重18～22kg，遵義醫(yī)學(xué)院本部校區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供。

1.2 設(shè)備 德國(guó)產(chǎn)的Revolix 2μm連續(xù)波醫(yī)用激光手術(shù)治療系統(tǒng)，功率120W，通過(guò)550微米的光纖傳輸能量。24F 12°激光電切鏡（德國(guó)Wolf公司）。灌洗液為無(wú)菌等滲平衡液。

1.3 建立前列腺切除術(shù)后模型 家犬10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉后仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，下腹部正中切口暴露膀胱。于膀胱前壁預(yù)置一荷包縫合線，在荷包縫合中央切開(kāi)膀胱壁，插入激光電切鏡，然后收緊荷包縫合線。以生理鹽水作為沖洗液，直視下電切鏡由尿道內(nèi)口進(jìn)入前列腺部尿道，手術(shù)方式模擬體內(nèi)汽化切除術(shù)，持續(xù)移動(dòng)光纖，完成弧形汽化切除，精確切割時(shí)將光纖頭埋于前列腺組織中，潛行切割，深約1～2mm，切除前列腺部全部尿路上皮和大部分前列腺組織，避免損傷前列腺包膜。術(shù)畢縫合膀胱，關(guān)閉腹腔。術(shù)后均不留置導(dǎo)尿管。

1.4 方法 術(shù)后3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周和12周電切鏡觀察并序貫取材，完成前列腺部尿路上皮 HE染色，觀測(cè)尿路上皮病理變化和分子標(biāo)記（UPS、PSA、CD34和CD133）的表達(dá)變化。

2 結(jié)果

2.1 術(shù)后前列腺部尿路上皮修復(fù)過(guò)程 創(chuàng)面從蒼白逐漸變紅潤(rùn)，滲血逐漸停止，血塊逐漸消失，大量蒼白壞死組織覆蓋在術(shù)后創(chuàng)面上并突向尿道腔，隨著修復(fù)的進(jìn)行逐漸脫落，創(chuàng)面逐漸覆蓋正常尿路上皮，創(chuàng)面和正常尿路上皮由分界明顯變?yōu)榉纸缒：?，未?jiàn)前列腺部遠(yuǎn)端正常尿道或膀

胱頸口正常尿路上皮向創(chuàng)面爬行生長(zhǎng)。

2.2 前列腺部尿路上皮細(xì)胞組織形態(tài)學(xué)變化 術(shù)后創(chuàng)面尿路上皮缺損，無(wú)新生上皮細(xì)胞形成，有凝固性壞死組織附在創(chuàng)面上，創(chuàng)面周?chē)植加写罅垦仔约?xì)胞 （中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞），離創(chuàng)面越近炎性細(xì)胞越密集，隨著修復(fù)的進(jìn)行，炎性細(xì)胞逐漸減少，創(chuàng)面上逐漸出現(xiàn)新生上皮細(xì)胞，由點(diǎn)狀逐漸連成片狀，進(jìn)而覆蓋整個(gè)創(chuàng)面，并逐漸增厚、出現(xiàn)極性，能表達(dá)尿路上皮特殊的蛋白。

2.3 前列腺部尿道免疫組化結(jié)果

2.3.1 P63在正常尿路上皮的表達(dá) P63是核蛋白，陽(yáng)性染色區(qū)在尿路上皮的細(xì)胞核，陽(yáng)性代表細(xì)胞是上皮來(lái)源。正常前列腺部尿路上皮連續(xù)的基底細(xì)胞細(xì)胞核被染成黃褐色。

2.3.2 P63在前列腺切除術(shù)后尿路上皮的表達(dá) 術(shù)后3天未見(jiàn)前列腺切除術(shù)后的尿道創(chuàng)面出現(xiàn)表達(dá)P63陽(yáng)性的細(xì)胞；術(shù)后1周見(jiàn)術(shù)后創(chuàng)面出現(xiàn)新生的表達(dá)P63陽(yáng)性的細(xì)胞，呈島狀分布；術(shù)后2周術(shù)后創(chuàng)面新生的表達(dá)P63陽(yáng)性的細(xì)胞呈線性覆蓋整個(gè)創(chuàng)面，和周?chē)５哪蚵飞掀は噙B續(xù)；術(shù)后3周至12周表達(dá)P63陽(yáng)性的基底細(xì)胞都成線性覆蓋在創(chuàng)面上并逐漸成熟。

2.3.3 CK34在正常尿路上皮的表達(dá) CK34是一組高分子細(xì)胞角蛋白，在前列腺基底細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，而在分泌上皮細(xì)胞不表達(dá)。

2.3.4 CK34在前列腺切除術(shù)后尿路上皮的表達(dá) 術(shù)后3天未見(jiàn)前列腺切除術(shù)后的尿道創(chuàng)面出現(xiàn)表達(dá)CK34陽(yáng)性的細(xì)胞；術(shù)后1周見(jiàn)術(shù)后創(chuàng)面出現(xiàn)新生的表達(dá)CK34陽(yáng)性的細(xì)胞，呈島狀分布；術(shù)后2周術(shù)后創(chuàng)面新生的表達(dá)CK34陽(yáng)性的細(xì)胞呈線，覆蓋整個(gè)創(chuàng)面，和周?chē)５哪蚵飞掀は噙B續(xù)；術(shù)后3周至12周表達(dá)CK34陽(yáng)性的基底細(xì)胞都成線性覆蓋在創(chuàng)面上并逐漸成熟。

2.3.5 PSA在正常尿道的表達(dá) PSA是前列腺腔面腺管上皮細(xì)胞分泌的胞質(zhì)蛋白，在前列腺腺泡、腺管上皮胞質(zhì)表達(dá)，在尿路上皮中不表達(dá)。

2.3.6 PSA在前列腺切除術(shù)后尿路上皮的表達(dá) 術(shù)后創(chuàng)面新生的尿路上皮中均不表達(dá)PSA。

2.3.7 UPS在正常尿路上皮的表達(dá) 尿斑蛋白是尿路上皮最顯著的結(jié)構(gòu)，是它的標(biāo)志蛋白，它們覆蓋大約80%的尿路上皮腔面，另外尿路上皮細(xì)胞漿的膜泡也含有大量的這種斑塊樣膜結(jié)構(gòu)，在尿路上皮的細(xì)胞漿中表達(dá)。

2.3.8 UPS在前列腺切除術(shù)后尿路上皮的表達(dá) 術(shù)后3天未見(jiàn)前列腺切除術(shù)后的尿道創(chuàng)面出現(xiàn)表達(dá)UPS陽(yáng)性的細(xì)胞；術(shù)后1周見(jiàn)術(shù)后創(chuàng)面出現(xiàn)新生的表達(dá)UPS陽(yáng)性的細(xì)胞，呈島狀分布，厚度約1～2層細(xì)胞；術(shù)后2周術(shù)后創(chuàng)面新生的表達(dá)UPS陽(yáng)性的細(xì)胞厚度繼續(xù)增加，覆蓋整個(gè)創(chuàng)面，和周?chē)５哪蚵飞掀は噙B續(xù)；術(shù)后3周至12周表達(dá)UPS陽(yáng)性細(xì)胞逐漸成熟并出現(xiàn)極性，且接近尿道腔面的細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng)。

3 討論

3.1 前列腺部尿路上皮修復(fù)過(guò)程 激光熱凝固是部分皮層損傷，類(lèi)似于II度皮膚燒傷［7］，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中也觀察到尿路上皮修復(fù)過(guò)程也類(lèi)似皮膚燒傷過(guò)程分為三個(gè)階段，即炎癥反應(yīng)期、組織形成期、基質(zhì)重建期，這三個(gè)階段在時(shí)間和空間上相互重疊［8，9］。

前列腺部尿路上皮再上皮化過(guò)程：

術(shù)后3天：創(chuàng)面上未見(jiàn)新生尿路上皮。

術(shù)后1周：島狀新生上皮細(xì)胞形成，1～2層。

術(shù)后2周：新生尿路上皮完全覆蓋創(chuàng)面，大多數(shù)新生上皮欠均勻，厚度4－6層，缺乏極性。

術(shù)后3周：新生上皮厚度較均勻，為6～8層，細(xì)胞初具極性，細(xì)胞體積增大。

術(shù)后4周：新生上皮厚度較均勻，為6～8層，細(xì)胞極性較前更加顯著，細(xì)胞體積增大。

術(shù)后6周：新生上皮厚度較均勻，為6～8層，細(xì)胞極性較前更加顯著，細(xì)胞體積增大。

術(shù)后8周：新生上皮厚度均勻，多為6～10層，細(xì)胞極性明顯，但細(xì)胞體積仍較大。

術(shù)后12周：新生上皮厚度均勻，多為6～10層，細(xì)胞極性明顯，細(xì)胞正常。

3.2 前列腺部尿路上皮修復(fù)機(jī)制的探索 從前列腺切除術(shù)后尿道再上皮化的過(guò)程中可以看出上皮從殘存的前列腺再生并分化為尿路上皮的可能性較大。尿路上皮最靠近尿道腔面的一層細(xì)胞是傘狀細(xì)胞，最顯著結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是其特異的表面膜結(jié)構(gòu)，被稱(chēng)為尿斑蛋白，這些尿斑蛋白在維持傘細(xì)胞功能上起著重要作用，是尿路上皮細(xì)胞分化的標(biāo)志蛋白［10］。尿路上皮的各層細(xì)胞逐漸出現(xiàn)并極化，經(jīng)過(guò)約12周的時(shí)間恢復(fù)正常并在再上皮化的過(guò)程中逐漸分化出特異性的尿斑蛋白。所以，前列腺切除術(shù)后前列腺部創(chuàng)面的尿路上皮再生修復(fù)可能來(lái)源于手術(shù)未切除的前列腺組織。

3.2.1 前列腺組織細(xì)胞是前列腺部尿路上皮再生的細(xì)胞來(lái)源之一 前列腺切除術(shù)后3天在創(chuàng)面上未見(jiàn)表達(dá)尿斑蛋白陽(yáng)性的細(xì)胞；術(shù)后1周后殘余的前列腺組織接近創(chuàng)面的腺泡狀細(xì)胞和創(chuàng)面新生的細(xì)胞均表達(dá)尿斑蛋白陽(yáng)性，創(chuàng)面新生的細(xì)胞呈島狀分布，約1～2層；隨著進(jìn)一步修復(fù)，新生尿路上皮細(xì)胞層逐漸增厚，并出現(xiàn)明顯的極性，且表達(dá)尿斑蛋白陽(yáng)性最強(qiáng)的細(xì)胞總是位于接近尿道腔面的細(xì)胞層。所以我們推測(cè)新生的尿路上皮可能來(lái)源于殘余的前列腺組織細(xì)胞。

3.2.2 前列腺相關(guān)干細(xì)胞可能是術(shù)后前列腺部尿路上皮再生的細(xì)胞來(lái)源之一 人們已經(jīng)在個(gè)體生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)階段以及多個(gè)成體組織中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞，前列腺組織也可能存在發(fā)揮重要作用的干細(xì)胞。通過(guò)對(duì)鼠的研究發(fā)現(xiàn)位于前列腺導(dǎo)管的近端存在著一種具有干細(xì)胞特征的細(xì)胞群［11－12］，以及Lin VK［13］發(fā)現(xiàn)前列腺基質(zhì)部有一種具有自我更新能力的、來(lái)源于良性前列腺增生組織的前列腺基質(zhì)細(xì)胞亞群。

干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增值分化能力，Taylor RA［14］等建立了上皮細(xì)胞和人類(lèi)胚胎干細(xì)胞相互作用的模型，培養(yǎng)出了人類(lèi)前列腺組織，在第8～12周時(shí)它就能表達(dá)前列腺特異性抗原。其后，Leong KG［15］等從成年老鼠前列腺中分離出具有多項(xiàng)分化潛能、能自我更新的細(xì)胞，移植入體內(nèi)后能分化增殖為具有分泌功能的前列腺。

在實(shí)驗(yàn)中我們使用了具有特異性標(biāo)記物來(lái)觀察前列腺細(xì)胞參與尿道修復(fù)的過(guò)程，其中包括P63、CK34、CD133？：

①P63：p63是核蛋白，P63基因被認(rèn)為是P53基因家族的新成員［16］。它在尿路上皮細(xì)胞等均有表達(dá)［17］。SIGNORETI等［18］較早發(fā)現(xiàn)P63在前列腺發(fā)育過(guò)程中起重要作用，并證實(shí)其在前列腺基底細(xì)胞中表達(dá)。P63缺如的鼠上皮會(huì)有各種各樣的缺陷［19－21］。P63陽(yáng)性染色區(qū)在尿路上皮的細(xì)胞核。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)殘余的前列腺腺泡基底細(xì)胞就參與尿路上皮的再生過(guò)程，新生的尿路上皮細(xì)胞從一開(kāi)始就表達(dá)P63陽(yáng)性，這提示殘余的前列腺組織中的腺泡基底細(xì)胞可能參與前列腺部尿路上皮的再生修復(fù)過(guò)程；②CK34：細(xì)胞角蛋白是細(xì)胞骨架蛋白的一種。CK34是前列腺基底細(xì)胞的一種特異性標(biāo)記物［22］，CK34蛋白為胞漿著色，在顯微鏡下觀察較P63更加直觀，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)CK34和P63的表達(dá)呈現(xiàn)出類(lèi)似的表達(dá)規(guī)律；③CD133：它是一個(gè)五次跨膜糖蛋白，其生物學(xué)功能尚不十分清楚。在生物體液中 （如神經(jīng)管液、尿液、唾液等），與CD133相關(guān)的膜顆粒隨微絨毛的退化及胚胎神經(jīng)上皮細(xì)胞多形突起物的形成而脫落，說(shuō)明CD133維持干細(xì)胞特性。CD133是間質(zhì)干細(xì)胞的陽(yáng)性標(biāo)記物［23］，同樣是造血干細(xì)胞標(biāo)志物，可能是某些腫瘤的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志［24］。CD133陽(yáng)性染色區(qū)在基底細(xì)胞胞質(zhì)、胞核，腺體細(xì)胞的胞質(zhì)。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)增生的前列腺腺泡細(xì)胞和再生的尿路上皮均表達(dá)CD133，它不能直接提示前列腺干細(xì)胞參與尿路上皮的修復(fù)。

關(guān)于前列腺相關(guān)干細(xì)胞參與尿路上皮的再生，我們可以假設(shè)在正常情況下，由于尿路上皮具有的通透屏障作用，這些具有前列腺干細(xì)胞特征的細(xì)胞在前列腺切除后暴露在和之前不同的外環(huán)境下，如直接接觸尿液、炎癥刺激。在這些因素的刺激下前列腺干細(xì)胞從它處于相對(duì)靜止的狀態(tài)轉(zhuǎn)入活躍的狀態(tài)，開(kāi)始在特定的調(diào)控機(jī)制下分化增殖，在體內(nèi)特殊的外環(huán)境下向尿路上皮分化增殖，尿路上皮各層細(xì)胞逐漸增殖、成熟，最后在形態(tài)和功能上都和正常的尿路上皮一樣。

4 結(jié)論

前列腺切除術(shù)后創(chuàng)面附近正常的尿路上皮爬行生長(zhǎng)覆蓋創(chuàng)面的可能性小，尿液中脫落的尿路上皮細(xì)胞是否參與尿路上皮的修復(fù)目前尚不能證實(shí)，而再生的尿路上皮主要來(lái)源于前列腺殘余組織，而在前列腺組織中存在的前列腺干細(xì)胞可能是這一修復(fù)過(guò)程的主要參與細(xì)胞，目前尚無(wú)發(fā)現(xiàn)前列腺干細(xì)胞的相關(guān)證據(jù)，但前列腺部具有干細(xì)胞相關(guān)功能的細(xì)胞是否為前列腺干細(xì)胞，能否分離后純化在體外特殊的環(huán)境下分化出尿路上皮，注射到前列腺切除術(shù)后創(chuàng)面能否加快新生尿路上皮的再生，以及前列腺干細(xì)胞需要怎樣的增殖分化條件，我們都將進(jìn)一步探討。

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The Discussion of Urethral Repair Mechanism after Prostatectom y

TANG Xiao－h(huán)u，Luo Guang－h(huán)eng
1.Zunyi Medical College，Zunyi563003，China；2.Guizhou Provincial People's Hospital，Guiyang 550002，China

Objective：Discuss the source，process，mechanism of urethra prostate epithelial regeneration，and whether prostate stem cells participate in the repair process.Methods：Establish the model of2 micron dogs’prostatectomy，after3 days，1 week，2 weeks，3 weeks，5 weeks，6 weeks，4 weeks，8 weeks and 12 weeks observed prostate urinary epithelial repair process under cystoscope，take biopsy specimen in the wound site，adopt HE staining and immunohistochem（PSA，CK34，P63，CD133 and UPS），observed urinary epithelial repair process under the microscope.Results：Under cystoscope and microscope，do not found normal urinary tract epithelium around the wound crawl to the wound after prostatectomy，and urinary tract epithelial regeneration cells mainly comes from prostate cells.Regeneration of the epithelium of the urinary tract as repair to express UPS，P63，CK34，CD133，but do not express the PSA.Conclusion：After the prostatectomy，it’s impossible of prostate urethra epithelial regeneration come from the normal urinary tract epithelium around the wound，the vital source of cells for urinary tract epithelial regeneration may be prostate cells，and prostate stem cells may participate in the repair process.

urothelium；re－epithelization；prostatic hyperplasia；Stem Cell

R697＋.3

A

1007－8517（2013）12－0056－03

2013.03.28）