肉毒桿菌及肉毒毒素研究進(jìn)展

趙思俊，李雪蓮，曹旭敏，王 娟，王玉東，王君瑋，曲志娜

（1.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032；2.青島易邦生物工程有限公司，山 東青島 266032）

2013年8月4日，國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局通報(bào)了我國(guó)4家進(jìn)口新西蘭恒天然公司受“肉毒桿菌”污染乳制品的企業(yè)名單，食品安全，尤其是嬰幼兒食品安全再一次引起人們高度關(guān)注。肉毒桿菌作為一種致命病菌，能引起肉毒中毒癥，引起全社會(huì)的高度關(guān)注。現(xiàn)就肉毒桿菌及肉毒毒素的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為加強(qiáng)食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支持。

1 肉毒桿菌

肉毒桿菌（Bacillus botulinus），又稱肉毒梭狀芽胞桿菌（Clostridium botulinum），是一種革蘭氏陽性厭氧芽孢菌，廣泛分布于自然界中，其芽胞在江河湖海的淤泥沉積物、塵土和動(dòng)物的糞便中都有存在，水和土壤中的芽胞，是造成食物污染的主要來源。厭氧環(huán)境中，該菌分泌強(qiáng)烈的肉毒毒素，能引起特殊的神經(jīng)中毒癥狀，對(duì)人類和動(dòng)物的致死率很高，是毒性最強(qiáng)的蛋白質(zhì)之一。因此，這種毒素還可用于制造生化武器。

肉毒毒素（Botulinum neurotoxin，BoNT）最早是由E.van Ermengen在1897年調(diào)查比利時(shí)Ellezelles暴發(fā)的一次食源性傳染性時(shí)發(fā)現(xiàn)[1]，隨后，在世界各地都陸續(xù)報(bào)道過肉毒毒素中毒事件[2-4]。由于它具有厭氧生長(zhǎng)、低溫生長(zhǎng)產(chǎn)毒的特點(diǎn)，使其在日益普及的真空包裝、冷凍食品及罐裝食品中具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，從而成為這類食品中毒的主要原因之一。

2 肉毒毒素——具有生物學(xué)意義的菌體產(chǎn)物

肉毒桿菌的致病性在于所產(chǎn)生的神經(jīng)毒素——肉毒毒素，這些毒素能引起人和動(dòng)物的肉毒中毒。根據(jù)肉毒毒素的抗原性，肉毒桿菌至今已有A、B、C（Cα和Cβ）、D、E、F、G等7個(gè)型，各型的肉毒桿菌分別產(chǎn)生相應(yīng)型的毒素。其中，A、B、E、F型可引起人群中毒，C、D型毒素主要是畜、禽肉毒中毒的病原，對(duì)人不致病。G型肉毒桿菌極少分離，未見G型菌引起人群中毒報(bào)道。我國(guó)肉毒桿菌食物中毒大多是由A型引起的，其他型相對(duì)較少。

肉毒桿菌屬于中溫菌，生長(zhǎng)最適溫度25～37℃，產(chǎn)毒最適溫度20～35℃，最適pH為6～8.2，當(dāng)pH低于4.5和超過9時(shí)，溫度低于15℃或超過55℃時(shí)，肉毒桿菌不能繁殖和形成毒素。另外，食鹽能抑制該菌的生長(zhǎng)和毒素的產(chǎn)生，但是不能破壞已形成的毒素。提高食品中酸度也能抑制該菌的生長(zhǎng)和毒素的產(chǎn)生。

肉毒毒素是目前已知的化學(xué)毒物與生物毒素中毒性最強(qiáng)烈的一種，其小鼠LD50為0.00625 ng，少至0.1～1.0 μg的肉毒毒素就可導(dǎo)致人中毒死亡。肉毒毒素是一種大分子蛋白質(zhì)，A、B、E、F各型毒素均含有兩種蛋白質(zhì)成分：神經(jīng)毒素和無毒性的紅細(xì)胞凝集素。結(jié)構(gòu)研究表明：肉毒毒素由輕鏈（L鏈，氨基端，50 KDa）與重鏈（H鏈，羧基端，100 KDa）通過一個(gè)二硫鍵連接[5]。其中重鏈與肉毒毒素的受體特異結(jié)合有關(guān)，其羧基端分子量約50 KDa的片段（Hc）是肉毒毒素的受體結(jié)合區(qū)（RBD），存在受體結(jié)合位點(diǎn)[6]，但是對(duì)受體結(jié)合區(qū)哪些片段在與受體的相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用還缺乏足夠了解，研究還發(fā)現(xiàn)Hc片段是肉毒毒素的主要保護(hù)性抗原，含有中和性B細(xì)胞表位[7]。

肉毒毒素對(duì)消化酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶）、酸和低溫很穩(wěn)定，對(duì)堿和熱敏感，易于被破壞失去毒性。在正常胃液中24 h尚不能將毒素破壞。故吃了含有毒素的食品，毒素可以被胃腸道吸收。各種肉毒毒素的致病性雖相同，但一種毒素只能被其產(chǎn)生的抗毒素所中和，無交叉免疫，這在抗毒素血清治療上有重要意義。

3 肉毒毒素的致病機(jī)制

肉毒毒素的作用包括結(jié)合、定位和麻痹3個(gè)階段[8]。一旦毒素與神經(jīng)細(xì)胞受體或具有內(nèi)吞作用的間接受體結(jié)合后，抗體就不能中和毒素。接著內(nèi)涵體的酸性發(fā)生變化，啟動(dòng)毒素轉(zhuǎn)運(yùn)區(qū)域構(gòu)象發(fā)生變化，同時(shí)囊泡腔在囊泡膜質(zhì)子泵ATP酶作用下酸化，暴露出一個(gè)疏水區(qū)域，在膜上產(chǎn)生一個(gè)離子通道，L鏈通過此通道進(jìn)入胞液。在胞內(nèi)，毒素分解三種蛋白釋放Ach，導(dǎo)致肌 肉松弛或痙攣麻痹[9]。

輕鏈和重鏈的N端結(jié)構(gòu)由1個(gè)保守的二硫鍵連接，在二硫鍵存在的狀態(tài)下，毒素重鏈HN結(jié)構(gòu)域形成一條環(huán)形結(jié)構(gòu)，將深陷于輕鏈表面裂縫中的鋅離子催化部位遮蔽，從而不表現(xiàn)酶活性[10]。在雙鏈毒素進(jìn)入神經(jīng)細(xì)胞后，二硫鍵被還原，釋放出的輕鏈才能表現(xiàn)出酶活性，催化部位能夠容納底物16個(gè)氨基酸殘基。與催化部位的鋅離子形成配位鍵的除了2個(gè)組氨酸殘基的咪唑環(huán)、1個(gè)結(jié)合于保守谷氨酸的水分子外，還有1個(gè)谷氨酸羧基，1個(gè)色氨酸分子也可能參與了配位。毒素輕鏈的這種獨(dú)特的配位形式、空間結(jié)構(gòu)與已知的金屬蛋白酶并不相同，屬于一個(gè)新型的金屬蛋白酶家族[11]。

4 肉毒毒素中毒的主要類型

肉毒毒素中毒根據(jù)其傳播途徑不同可分為3個(gè)類型，分別是食源性肉毒毒素中毒、嬰兒肉毒毒素中毒、創(chuàng)傷性肉毒毒素中毒[12-14]。在目前己知的病例中，食源性肉毒毒素中毒占絕對(duì)多數(shù)，其次是嬰兒肉毒毒素中毒。

4.1 食源性肉毒毒素中毒

食源性肉毒毒素中毒主要是由于進(jìn)食了含有肉毒毒素的食品所引起，也是人類肉毒毒素中毒最普遍的一種形式。

食品在制作過程中被肉毒桿菌芽孢所污染，制成后未徹底滅菌，芽孢可在厭氧環(huán)境中發(fā)芽繁殖、產(chǎn)生毒素，食前又未加熱烹調(diào)，已產(chǎn)生的毒素被食后引起食物中毒，多見于罐頭食品、乳制品、真空包裝食品和冷凍食品等，在我國(guó)，肉毒中毒大多由發(fā)酵的豆制品和面制品所致。

4.2 嬰兒肉毒毒素中毒

嬰兒肉毒毒素中毒由于新生兒正常菌群缺乏，其食入的肉毒桿菌芽孢可以萌發(fā)、繁殖、產(chǎn)生毒素，從而引起嬰兒中毒。

嬰兒的發(fā)病年齡通常在2周到8個(gè)月，年齡在9個(gè)月以上的嬰兒未見相關(guān)報(bào)道。嬰兒中毒A型多于B型，F(xiàn)型極為罕見。1歲以下的嬰幼兒不宜食用蜂蜜，因?yàn)槊鄯湓诓杉ǚ坩劽鄣倪^程中，很容易把被肉毒桿菌污染的花粉和蜜帶回蜂箱，導(dǎo)致蜂蜜中含有的肉毒桿菌較多，容易引起嬰兒肉毒毒素中毒。芽孢在人體內(nèi)一般不能出芽，但由于嬰兒腸道的特殊環(huán)境，可能引起感染和中毒。臨床表現(xiàn)為先是便秘，繼而出現(xiàn)頭頸部肌肉軟松、吮乳無力、吞咽困難、眼簾下垂、全身肌肉松弛減退，可持續(xù)8周以上。只要注意營(yíng)養(yǎng)和護(hù)理，一般可在1-3月內(nèi)自然恢復(fù)，嚴(yán)重者亦可因呼吸麻痹而導(dǎo)致嬰兒猝死。嬰兒肉毒病是肉毒桿菌感染后在體內(nèi)繁殖產(chǎn)生毒素所致，屬于感染性中毒，與單純性中毒不同。

4.3 創(chuàng)傷性肉毒癥

創(chuàng)傷性肉毒中毒，類似破傷風(fēng)，由于傷口處污染的肉毒桿菌芽孢繁殖、產(chǎn)毒，毒素從傷口進(jìn)入血液循環(huán)，隨血流到達(dá)神經(jīng)系統(tǒng)后引起肉毒中毒而導(dǎo)致。

5 肉毒毒素中毒的臨床癥狀

肉毒中毒的臨床表現(xiàn)與其他食物中毒不同，胃腸道癥狀少見，主要為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末梢麻痹。臨床表現(xiàn)包括因肌肉活動(dòng)不協(xié)調(diào)而出現(xiàn)肢體歪斜，舌外伸，食物的取用、咀嚼、吞咽出現(xiàn)困難。意識(shí)正常，如果未出現(xiàn)繼發(fā)感染，體溫仍保持正常。

該病潛伏期18～72 h，先有一般不典型的乏力、頭痛等癥狀，隨后眼肌麻痹，開始出現(xiàn)復(fù)視、斜視、眼瞼下垂等，后來發(fā)展至咽喉部肌肉麻痹，吞咽、咀嚼困難，進(jìn)而隔膜麻痹、呼吸困難，重者可死于呼吸困難與衰竭，病死率在30%以上。

6 肉毒桿菌和肉毒毒素的檢測(cè)方法

由于肉毒桿菌的致病性主要在于其產(chǎn)生的外毒素，并且由于肉毒桿菌屬于厭氧菌，培養(yǎng)條件要求高，一般實(shí)驗(yàn)室不具備這樣的條件，所以檢測(cè)的重點(diǎn)主要是對(duì)肉毒毒素的檢測(cè)。目前實(shí)驗(yàn)室中常用的檢測(cè)肉毒毒素的方法是基于抗原抗體反應(yīng)、針對(duì)毒素蛋白的檢測(cè)，還有小鼠致死及中和實(shí)驗(yàn)、膠體金免疫層析法等，另外，也有少量采用分子生物學(xué)方法檢測(cè)肉毒毒素基因的報(bào)道[15-18]。

6.1 肉毒桿菌的厭氧分離培養(yǎng)與鑒定

將可疑食物或嘔吐物煮沸1 h可以殺滅非芽胞桿菌，接種于血瓊脂平板厭氧培養(yǎng)；或?qū)⒖梢刹牧显?5～80℃條件下加熱30 min，然后37℃培養(yǎng)24 h，涂片檢查細(xì)菌形態(tài)，并作生化鑒定。對(duì)于E型菌的芽孢還需要用溶菌酶處理，用血瓊脂平板在厭氧條件下培養(yǎng)。根據(jù)生化反應(yīng)和毒素的產(chǎn)生進(jìn)行鑒定，可采用免疫熒光方法鑒定某些代謝群的菌株，還可編碼各種毒素的基因設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

6.2 小鼠毒素中和試驗(yàn)

對(duì)于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，小白鼠腹腔注射法是目前對(duì)肉毒毒素活性與定性的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。該方法靈敏度高，但檢測(cè)周期長(zhǎng)，至少需要4天；另外還存在使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物帶來高成本的缺點(diǎn)，同時(shí)需要較復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)操作。因而，近年來主要研究利用被動(dòng)血凝反應(yīng)測(cè)定、放射免疫測(cè)定、凝膠擴(kuò)散測(cè)定、酶聯(lián)免疫測(cè)定、肽鏈內(nèi)切酶酶聯(lián)免疫測(cè)定等，大多采用免疫法，檢測(cè)單個(gè)樣品的時(shí)間可以縮短到幾個(gè)小時(shí)。由于免疫法主要基于分子識(shí)別，在肉毒毒素失活或部分失活的情況下，也可能檢出。也就是說，免疫方法只能測(cè)定是否存在肉毒毒素分子，而不能測(cè)定其活性，在測(cè)定活性或毒力時(shí)，仍需要采用小白鼠腹腔注射法。

6.3 其他檢測(cè)方法

康彥等[19]采用毛細(xì)管電泳激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)聯(lián)用技術(shù)分離檢測(cè)肉毒毒素A與其人工合成多肽底物反應(yīng)后的產(chǎn)物來對(duì)其活性進(jìn)行分析，該方法具有需要樣品量少，分析速度快等優(yōu)點(diǎn)。蘇裕心等利用SmartCycler系統(tǒng)，建立了一種高敏、特異、簡(jiǎn)便、快速的檢測(cè)肉毒桿菌等多種食源性致病菌的熒光定量PCR方法[20]。

近年來，基因芯片法以其具有集成化、微型化、自動(dòng)化、高通量等特點(diǎn)，被廣泛用于病原菌的檢測(cè)。金大智等[21]以16S rDNA和23S rDNA基因作為檢測(cè)靶片段，選取15種常見腸道致病菌作為基因芯片檢測(cè)的靶細(xì)菌，設(shè)計(jì)和篩選通用性引物和特異性探針，優(yōu)化兩重PCR反應(yīng)體系，并探討核酸提取方法、引物不對(duì)稱比例、鎂離子濃度、退火溫度、退火時(shí)間、雜交溫度、雜交液成分等因素對(duì)基因芯片雜交的影響。成功建立了包括肉毒桿菌在內(nèi)的15種腸道致病微生物的基因芯片檢測(cè)法，并用于臨床診斷。

7 肉毒毒素的預(yù)防和治療

肉毒毒素的防治，主要采用疫苗預(yù)防和使用保護(hù)性抗體進(jìn)行被動(dòng)免疫治療。疫苗是預(yù)防肉毒中毒的最有效的方法。臨床診斷往往不能有效區(qū)分中毒的肉毒毒素類型，治療時(shí)多使用多價(jià)的馬血清抗毒素[22-23]。

7.1 肉毒毒素疫苗

目前肉毒毒素疫苗的類型主要有：肉毒毒素的類毒素疫苗、肉毒毒素亞單位疫苗、肉毒毒素的DNA疫苗等。目前國(guó)外使用較多的肉毒毒素的類毒素疫苗是福爾馬林滅活的五價(jià)疫苗。但該疫苗只含有七個(gè)血清型中的5種（A-E），不能抵抗F和G型肉毒毒素的攻擊[24]。研究表明，肉毒毒素的Hc片段包含保護(hù)性抗原基本決定簇，作為免疫原能引發(fā)顯著保護(hù)性免疫應(yīng)答，A和B型毒素Hc重組蛋白的高效表達(dá)也有一定的進(jìn)展[25-26]。

7.2 肉毒毒素的治療

7.2.1 肉毒毒素拮抗劑：小分子化合物和肽類物質(zhì)對(duì)肉毒毒素的毒性可以起到一定的抑制作用，毒素拮抗劑成為肉毒毒素中毒防治的新途徑[27-28]。

肉毒毒素拮抗劑的靶目標(biāo)主要是：1）膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末端的表面結(jié)合位點(diǎn)。肉毒毒素的H鏈?zhǔn)紫扰c膽堿能神經(jīng)末梢的突觸前膜上的受體結(jié)合；2）毒素的中和抗原表位；3）毒素輕鏈的活性部位。阻斷毒素與膽堿能運(yùn)動(dòng)神經(jīng)末端受體的結(jié)合相對(duì)困難，與之相比，抑制毒素與中和抗原表位的結(jié)合顯得更加有效，能夠延緩機(jī)體死亡，而不能有效防治癱瘓。研究發(fā)現(xiàn)，一些鋅離子試劑、金屬蛋白酶抑制劑等可以抑制肉毒毒素輕鏈的活性。

7.2.2 肉毒毒素抗毒素：常用的方法是以福爾馬林類毒素免疫小鼠以制備單克隆抗體，然而研究表明無論作為免疫原或抗原，肉毒毒素類毒素和毒素之間存在顯著的差異。目前，研究者正致力于新型抗毒素的研究。Cenci[29]以體外表達(dá)肉毒毒素輕鏈片段為免疫原制備鼠單克隆抗體，雖然在體內(nèi)不能抑制毒素的毒性，但是可以防止毒素引起的神經(jīng)遞質(zhì)釋放的抑制。Pless等[30]用毒素Hc片段制備了單克隆抗體，從而確定了A型肉毒毒素的Hc中至少有2個(gè)不同的中和抗原表位。其他研究也表明用單抗封閉毒素Hc上的表位，也可在一定程度上有效預(yù)防和治療肉毒毒素中毒。

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