異種骨去抗原處理的研究進展

張承旻(綜述)，廖文波(審校)

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 骨二科，貴州 遵義 563099)

·綜述·

異種骨去抗原處理的研究進展

張承旻(綜述)，廖文波(審校)

(遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 骨二科，貴州 遵義 563099)

異種骨；免疫原性；抗原；脫細胞骨基質(zhì)

創(chuàng)傷、腫瘤、感染及其它因素可以導致骨缺損，而骨移植是治療骨缺損最有效的方法之一[1]。用于骨移植的材料有：自體骨、同種異體骨、異種骨及組織工程化骨等。自體骨及同種異體骨是目前臨床主要應(yīng)用的骨移植材料，但均有其不足之處[2-5]。近年來的研究表明，異種骨具有天然的三維孔隙結(jié)構(gòu)、恰當?shù)拟}磷比例、骨誘導能力及生物力學與人相似[6-7]，是理想骨移植材料的來源。但其為異種材料，植入人體內(nèi)可引起急性排斥反應(yīng)。因此,如何降低異種骨免疫原性是其成為骨移植代替材料的關(guān)鍵。現(xiàn)就目前異種骨去抗原處理方法的研究進展進行詳細綜述。

1 異種骨抗原分布及免疫反應(yīng)類型

異種骨主要含有抗原：α-半乳糖基抗原(α-Gal)、主要組織相容性抗原(MHC)、膠原蛋白及骨髓和血液成分[8-9]。異種材料植入人體后，與人體血液直接接觸，激活血液內(nèi)含有的α-半乳糖基天然抗體，其所介導的細胞毒效應(yīng)，引起移植物血管內(nèi)皮細胞溶破、血栓形成及炎癥反應(yīng)，導致超急性排斥反應(yīng)；但是異種骨移植后并不直接暴露于血液中，所以異種骨移植后并不出現(xiàn)明顯的超急性排斥反應(yīng)。由于異種材料與人體的MHC分子差異較大，細胞因子及其受體不匹配，難以通過直接識別途徑激發(fā)免疫應(yīng)答，所以排斥反應(yīng)主要通過間接識別途徑而發(fā)生。通過CD4+Th細胞識別自身抗原提呈細胞提呈的異種MHC-II單態(tài)和多態(tài)決定簇，通過Th1、Th2細胞作用，發(fā)生急性排斥反應(yīng)。較同種排斥相比，其反應(yīng)更強烈，不易被免疫抑制劑所抑制。目前認為異種骨移植引起排斥反應(yīng)主要是α-Gal抗原[10-11]和MHC抗原[12]，通常認為I型膠原蛋白各種屬之間差別不大，并沒有很強的抗原性。其中α-Gal、MHC-I抗原表達于骨髓細胞及骨細胞、成骨細胞細胞膜上及哈弗氏管周圍，MHC-II抗原表達于骨髓細胞。所以如何更好的制備脫細胞異種骨支架材料是降低異種骨免疫原性的主要方式。

2 異種骨去抗原處理方法

異種骨去抗原主要是通過脫細胞處理，處理目的是有效的去除所有細胞及核質(zhì)，并將對支架的組成成份、生物活性和機械完整性的干擾減到最弱以保留基質(zhì)成分[13]。目前任何處理脫細胞處理方式都將影響支架材料的生物特性，常用的方法包括物理、化學方法[14-16]。物理方法分為：高溫煅燒、低溫冷凍、機械攪拌及聲波降解等方法，這些方法破壞細胞膜使細胞內(nèi)成份釋放，然后進一步從支架上去除細胞內(nèi)成分。但是，僅僅應(yīng)用物理方法并不能完全去除細胞，一般需聯(lián)合化學方法。此外，蛋白酶可以水解細胞與細胞、細胞與支架之間的纖連蛋白、彈性蛋白和黏多糖等連接成分，使細胞與支架分離，從而達到脫細胞目的[17]。目前對異種去抗原處理方法通常采用不同的物理、化學及酶方法聯(lián)合使用，但是各種方式對異種骨支架的脫細胞處理同時也不同程度的影響到了異種骨材料天然生物特性。如H2O2可以有效的降低異種骨的免疫原性，但是在免疫原性減低的同時異種骨的強度、彈性模量也受到了影響，其彈性變形能力較差，脆性增加。

2.1 物理方法 異種骨物理處理方法有高溫煅燒、低溫冷凍及超聲等方法。高溫煅燒骨是將異種骨脫脂脫蛋白處理后在經(jīng)過高溫煅燒，除去了膠原等有機成分使異種骨的免疫原性減低。經(jīng)過煅燒的異種骨主要成分是高純度的羥基磷灰石，因為有機成分都被除去，所以高溫煅燒后可使骨力學強度低、脆性大、可降解。Kim等應(yīng)用高溫煅燒骨在體外及動物體內(nèi)誘導成骨，認為其具有較強的骨傳導性，但是無骨誘導性[18]。Lin等將異種骨放入焦磷酸鈉溶液中浸泡后高溫煅燒，骨中的羥基磷灰石與焦磷酸鈉反應(yīng)轉(zhuǎn)變成為磷酸鈉三鈣，提高了高溫煅燒骨的生物降解性與細胞相容性[19]。由于高溫煅燒降低了骨的力學性能，所以一般不用于負重部位植骨，因其可誘導骨生成，常作為填充材料。

低溫冷凍是一種常用的脫細胞處理方法，一般推薦溫度低于-70～-80 ℃。低溫冷凍使異種骨免疫原性減低，其機制并不十分明確，有學者認為低溫時細胞內(nèi)生成的冰晶，可以破壞細胞膜引起細胞的溶解，從而降低了異種骨的免疫原性[20]。于洪波等將兔成骨細胞液氮凍存3月后復(fù)蘇，比較凍存前后細胞的MHC分子的表達，發(fā)現(xiàn)凍存后細胞的MHC-I分子的表達減低，認為凍存可以降低細胞的免疫原性。但是，低溫冷凍方法對異種骨材料的生物力學影響具有爭議，Kang等通過實驗認為低溫冷凍及反復(fù)凍融對牛皮質(zhì)骨條生物力學無明顯的影響[21]。

超聲生物技術(shù)包括超聲碎細胞和超聲洗滌等技術(shù)，在生物研究領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。超聲波可以引發(fā)強烈的震動，同時還有高速化、空化效應(yīng)和攪拌作用。在一定的強度和頻率條件下超聲波在液體中傳播產(chǎn)生許多微小氣泡，暴露在聲場中的氣泡先迅速膨脹到最大半徑，然后被迅速壓縮并瞬間崩潰閉合產(chǎn)生瞬時的高溫、高壓及強烈的沖擊波與激射流將細胞擊碎。目前的研究尚沒有一個統(tǒng)一的頻率和強度來破壞細胞[22]，趙自平等采用20kHz的較低頻率進行超聲碎細胞處理，然后采用40kHz的頻率清除細胞碎片，經(jīng)過聯(lián)合化學法脫脂脫蛋白處理，所制備的異種骨脫細胞支架經(jīng)過檢測，生物力學與傳統(tǒng)方法相比生物力學沒有差異，經(jīng)過體外及動物體內(nèi)檢測，經(jīng)過超聲處理的異種骨脫細胞支架免疫原性低、細胞相容性好。較常規(guī)方法，超聲方法協(xié)助處理脫細胞更徹底，而且縮短了異種骨支架材料制備周期，不影響支架材料的生物力學性能[23]。探索超聲去除異種松質(zhì)骨抗原的最佳頻率與強度，這是研究該應(yīng)用技術(shù)的關(guān)鍵和重點。

2.2 化學方法 化學方法對異種骨支架材料進行脫脂、脫蛋白或脫細胞處理，主要是采用不同化學試劑浸泡異種骨，如：甲醇、氯仿、乙醚、過氧化氫。通過不同試劑共同作用制備部分脫蛋白骨、完全脫脂脫蛋白骨及脫細胞骨基質(zhì)等。常用的脫脂化學試劑有乙醚、氯仿、甲醇及甲醛等有機溶劑，脫蛋白試劑有過氧化氫、乙二胺等。

1937年首次出現(xiàn)脫蛋白骨應(yīng)用于臨床后[24]，化學法脫脂脫蛋白技術(shù)在不斷更新，其中完全脫脂脫蛋白骨：Bio-oss骨、Oswestry骨等已應(yīng)用于臨床并取得了一定的效果，但是都未能廣泛應(yīng)用[25-26]。完全脫脂脫蛋白通常將異種骨浸泡于過氧化氫液或乙二胺中，從而提取其中蛋白成分。經(jīng)過完全脫脂脫蛋白處理后異種骨的免疫原性明顯下降，實驗證明移植后不會引起強烈的排斥反應(yīng)，但是同時因為骨支架中的有機成分幾乎全部被清除掉，經(jīng)過處理的支架材料幾乎沒有骨誘導性。在成骨方面受到了限制。Kiel骨是一種脫脂部分脫蛋白的異種骨，其采用新鮮牛骨，機械方式去除軟組織及骨髓，浸泡于H2O2中去除部分蛋白，再用乙醇脫脂處理后干燥獲得。經(jīng)過處理后的骨支架材料免疫原性低，因為部分脫蛋白，支架材料上仍保留部分蛋白成分，提高了支架材料的骨誘導作用。在歐洲Kiel骨已經(jīng)商品化應(yīng)用與臨床[27]。

在脫脂脫蛋白處理中，采用H2O2進行脫蛋白處理非常普遍，但是實驗發(fā)現(xiàn)H2O2作用時間越長，異種骨支架的免疫原性也就越低，但是支架材料的生物力學強度也明顯的降低[28]。在骨基質(zhì)中氨基酸總量隨著H2O2處理時間的延長并沒有明顯的變化，沒有出現(xiàn)大量蛋白質(zhì)被去除的現(xiàn)象。所以目前認為H2O2作用機制可能是其強氧化作用使得支架材料上的蛋白發(fā)生變性，并沒有起到脫蛋白的作用。異種骨中的主要有機成分I型膠原蛋白是維持骨韌性重要成分，其在H2O2作用下發(fā)生變性，可使得異種骨的脆性增加，強度降低[29]。

非離子洗劑Triton X-100是一種廣泛使用的脫細胞洗劑，作用時間根據(jù)不同的組織從幾個小時到兩周。它主要是通過破壞脂類之間和脂類與蛋白之間的相互作用，經(jīng)過處理后除去了基質(zhì)材料上的脂類，有效保留了蛋白物質(zhì)。用Triton X-100處理血管可以有效的除去血管內(nèi)的細胞并保存血管的結(jié)構(gòu)。王昊等采用Triton X-100處理異種骨，經(jīng)過免疫組織化學檢測異種骨中膠原蛋白被保留；HE染色間骨陷窩空虛，骨細胞被除去；力學檢測經(jīng)過處理的異種骨支架材料與正常骨相似[30]。但是Triton X-100脫細胞處理的過程中同時除去了支架材料中的黏多糖成分，不利于細胞的粘附[31]。

采用化學法降低異種骨材料的免疫原性主要是通過將異種骨浸泡于不同的試劑中，但是單純的浸泡一方面提取液不易達到異種骨內(nèi)部，另一方面提取液隨著作用時間的延長，其濃度降低。一般采用物理攪拌、震蕩及超聲等方法與化學法聯(lián)合應(yīng)用，可以明顯提高化學試劑的作用效率，縮短處理時間。

2.3 酶消化法 胰酶為蛋白酶的一種，作為消化酶而起作用。是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷，從而起到消化酶的作用。胰酶可以使細胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。經(jīng)常作為一種脫細胞的處理方法。何創(chuàng)龍等采用蛋白酶代替H2O2等強氧化劑處理異種骨，有效的保留了膠原蛋白[32]。但是胰酶等蛋白酶長時間作用會清除異種骨中的連蛋白、纖連蛋白、彈性蛋白和黏多糖等成分。此外，使用蛋白酶需要控制提取液的pH值及溫度等條件，使得蛋白酶可以有效的發(fā)揮其作用。

3 展望

異種骨來源廣泛可以大量提供，天然的骨結(jié)構(gòu)及其孔隙有利于細胞的粘附及增殖，生物力學與人骨相似，較其它來源的植骨材料有著其自身的優(yōu)勢，可成為理想的骨替代材料[33]。現(xiàn)有的物理、化學及酶的處理方式可以有效的降低異種骨的免疫原性，但同時影響了異種骨的骨傳導性、骨誘導性及生物力學性能等天然特性。由于這個原因，異種骨在作為骨代替材料的應(yīng)用上受到了明顯的限制。因此，目前需要解決的首要問題是如何有效的降低異種骨免疫原性，并且最大限度的保護異種骨的天然特性。

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[收稿2012-09-26;修回2012-12-28]

(編輯：王福軍)

R683

A

1000-2715(2013)02-0170-04

廖文波,男,博士,教授,碩士生導師,研究方向:骨質(zhì)疏松, E-mail:wenbo600@sina.com。