胚胎植入前遺傳學(xué)診斷進展

劉嘉茵

（江蘇省人民醫(yī)院，江蘇 南京 210029）

胚胎植入前遺傳學(xué)診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）是產(chǎn)前診斷的一種早期形式，在胚胎期通過遺傳檢測技術(shù)選擇正常的或沒有發(fā)病風(fēng)險的胚胎，避免懷上有家族遺傳疾病的胎兒，減少反復(fù)流產(chǎn)的發(fā)生。因為PGD檢測的標(biāo)本在胚胎卵裂期僅為1～2個單細胞，在囊胚期為幾個滋養(yǎng)層細胞，因此，在基因擴增和檢測技術(shù)上有較高的難度。目前，PGD技術(shù)經(jīng)過20年的發(fā)展，逐漸發(fā)展成為產(chǎn)前胚胎期遺傳學(xué)診斷的常規(guī)項目。現(xiàn)代分子遺傳學(xué)技術(shù)，包括生物芯片、二代測序等高通量全基因組的檢測技術(shù)，也進入該領(lǐng)域的臨床應(yīng)用。目前的PGD助孕技術(shù)前仍需要對風(fēng)險夫婦或其家系進行準(zhǔn)確的遺傳診斷，包括染色體檢測和基因檢測，未來技術(shù)的研發(fā)，有可能會使其并非必須。

在輔助生殖技術(shù)的研究中發(fā)現(xiàn)，部分高風(fēng)險夫婦的胚胎易于出現(xiàn)染色體數(shù)目異常，造成不孕、反復(fù)流產(chǎn)、胎兒畸形等缺陷。針對這些夫婦雙方未知的染色體水平的遺傳缺陷，對胚胎進行植入前的染色體篩查，稱之為胚胎植入前非整倍體篩查（preimplantation genetic diagnosis for aneuploid screening，PGD-AS），也稱為胚胎植入前篩查（preimplantation genetic screening，PGS），PGS的臨床應(yīng)用意義目前尚存在爭議，有待于更多的臨床隨機對照研究來證實其是否具有積極的臨床意義。近年來在PGD診斷技術(shù)的主要進展包括如下方面：

1 植入前樣本的活檢

在PGD過程中，精子和卵子通過卵胞漿內(nèi)單精子注射法（intracytoplasmic sperm injection，ICSI）受精，再通過顯微操作對胚胎活檢取樣供遺傳檢測，稱之為胚胎活檢（embryo biopsy）。胚胎活檢的時期主要有3個，即受精前后（第一、第二極體活檢）、8細胞卵裂期（卵裂球活檢）和囊胚期（滋養(yǎng)外胚層活檢）。

1.1 極體活檢 是對卵母細胞的活檢，可以是減數(shù)分裂后的第一極體和（或）受精后的第二極體活檢，樣本能夠反映母源遺傳因素，活檢后遺傳診斷的時間比較充裕，但是不能反映父源遺傳因素，目前臨床應(yīng)用尚不普及。

1.2 卵裂球活檢 通常于精卵受精后第3天卵裂期胚胎，吸取1～2個卵裂球。該時期活檢取樣能夠同時反映父母源遺傳因素，目前被廣泛使用，但缺點在于卵裂球的嵌合狀態(tài)可能影響診斷的準(zhǔn)確性，以及對胚胎發(fā)育的潛能可能存在不利影響。

1.3 囊胚活檢 在受精后第5～6天，吸取胚胎滋養(yǎng)外胚層細胞團。囊胚活檢的樣本量一般為4～10個細胞，充足的細胞數(shù)能夠提高遺傳診斷的準(zhǔn)確性，并且該時期活檢對胚胎發(fā)育潛能影響較小。其缺點是胚胎成囊率較低，而且因檢測不能在囊胚孵出期前完成，需要冷凍胚胎，等待以后的自然周期或人工周期再行移植。隨著囊胚培養(yǎng)技術(shù)、胚胎冷凍和復(fù)蘇技術(shù)、以及檢測技術(shù)的日益成熟，囊胚活檢將是PGD／PGS發(fā)展的趨勢。

2 目前PGD／PGS采用的遺傳診斷技術(shù)

2.1 熒光原位雜交技術(shù) 熒光原位雜交（fluorescent in situ hybridization，F(xiàn)ISH）技術(shù)在PGD的應(yīng)用已經(jīng)有20年的歷史，主要適用于染色體異常以及性別選擇。該技術(shù)需根據(jù)不同病人易位的染色體不同選擇特定的2～3個熒光探針，經(jīng)過探針和玻片共變性、雜交、洗片、復(fù)染等步驟，在顯微鏡下觀察熒光信號，判斷胚胎染色體是否平衡或者胚胎性別。該技術(shù)長期以來一直被用于PGD臨床，臨床妊娠率約在28%～35%／每移植周期。在以往的PGS研究中，利用多色、多輪雜交可以同時分析5～12條染色體的數(shù)目異常。但是該技術(shù)在PGS中的臨床意義已經(jīng)被多項隨機對照研究所否認。其原因除了胚胎的生理因素（如嵌合體）外，F(xiàn)ISH技術(shù)本身也存在內(nèi)在的缺陷，如雜交失敗、信號模棱兩可、分析的染色體數(shù)目有限等，這也限制了FISH在PGD／PGS中的進一步應(yīng)用。

2.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR），是最早用于PGD進行性別選擇的技術(shù)，其后在性別選擇PGD的應(yīng)用中被相對簡單、準(zhǔn)確的FISH技術(shù)取代。目前PCR在PGD中的應(yīng)用主要是針對單基因病的診斷。PCR具有高敏感性，能夠精確分析到單個堿基的改變。PCR結(jié)合限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、微測序（minisequencing）常被用于點突變的快速、直接檢測。由于單細胞PCR存在擴增失敗、污染、等位基因脫扣（allelic drop out，ADO）、優(yōu)勢擴增等問題，臨床檢測中常常采用多重PCR（multiplex polymerase chain reaction，M-PCR）同時分析多個短串聯(lián)重復(fù)序列（short tandem repeat，STR）進行連鎖分析以提高診斷的準(zhǔn)確性。熒光PCR（fluorescent polymerase chain reaction，F(xiàn)-PCR）結(jié)合毛細管電泳分析因具有更高的敏感性和分辨率已經(jīng)廣泛應(yīng)用于單基因病PGD中。

2.3 單細胞全基因組擴增技術(shù) 單細胞直接PCR能夠檢測的遺傳位點有限，且只有一次擴增機會。單細胞全基因組擴增（whole genome amplification，WGA）能夠?qū)渭毎械膯慰截怐NA進行全基因組擴增放大，DNA的量由pg級放大到μg級，能夠為下游的遺傳檢測提供充足的樣本。常用的WGA技術(shù)主要有：①基于PCR原理的WGA技術(shù)，如簡并寡核苷酸引物PCR（degenerate oligonucleotide primer PCR，DOP-PCR）、擴增前引物延伸反應(yīng)（primer extension preamplification，PEP）等；②非基于PCR原理的WGA技術(shù)，如多重置換擴增（multiple displacement amplification，MDA）、基于引物酶的全基因組擴增（primase-based whole genome amplification，p WGA）。最近，美國自然雜志介紹了一種全新的WGA方法——多次退火環(huán)狀循環(huán)擴增技術(shù)（multiple annealing and looping based amplification cycles，MALBAC），能夠為單細胞提供高保真的全基因組擴增，具有覆蓋率高、擴增偏倚小的特點，具有巨大的應(yīng)用前景。

2.4 微陣列比較基因組雜交技術(shù) 微陣列比較基因組雜交（array-based comparative genomic hybridization，aCGH）是一種高通量的分子細胞遺傳學(xué)檢測技術(shù)，近些年隨著WGA技術(shù)的發(fā)展，開始應(yīng)用于染色體異常PGD及PGS診斷。aCGH技術(shù)是將待檢樣本和標(biāo)準(zhǔn)參考品標(biāo)記不同的熒光信號后，與芯片上的微陣列分布的探針進行競爭雜交，通過分析兩者的信號強度，來判斷染色體組的缺失和重復(fù)。aCGH在染色體異常PGD中的應(yīng)用優(yōu)勢在于為不同患者不同染色體異常提供了一種通用的檢測方法，不需要針對不同個體設(shè)計不同的探針，大大節(jié)約了實驗室的工作時間和簡化了實驗室工作流程，與此同時還可以全面地分析胚胎其它染色體的異常。

2.5 單核苷酸多態(tài)微陣列技術(shù) 單核苷酸多態(tài)微陣列芯片技術(shù)（single nucleotide polymorphism-based array，SNP array）的基本原理是應(yīng)用已知的核苷酸序列作為探針與熒光標(biāo)記的靶核苷酸序列進行雜交，通過對信號的檢測進行SNP定性與定量分析。SNP array與aCGH比較，在染色體異常PGD上具有相似的檢測效能，目前SNP array和aCGH均已開始漸進取代FISH技術(shù)，越來越多的用于染色體異常PGD和PGS。值得注意的是，SNP array可以通過對胚胎樣本及家系進行SNP分型，建立SNP單體型圖，從而可以作為單基因病PGD的通用檢測手段，這也是SNP array的一個潛在的應(yīng)用前景。

3 PGS的臨床應(yīng)用價值

對高齡、反復(fù)種植失敗、習(xí)慣性流產(chǎn)、既往有非整倍體胚胎形成史等患者，過去采用FISH方法，對胚胎卵裂球染色體組進行雜交，篩查出染色體數(shù)目的異常，以提高妊娠率和種植率。但是經(jīng)過對國際多個中心的資料分析，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)并不能真正提高臨床妊娠率和活產(chǎn)率，并因為患者的胚胎數(shù)目和評分較低，取消率較高，2006年的美國生殖年會基本否定了該技術(shù)的臨床應(yīng)用價值。但是近年來，經(jīng)過數(shù)個獨立研究的數(shù)據(jù)證明，經(jīng)過PGS的胚胎其臨床妊娠率和活產(chǎn)率均有顯著提高。

特別是近年來在臨床推廣應(yīng)用的aCGH技術(shù)，同時能篩查24條染色體的數(shù)目，大大提高了PGS的準(zhǔn)確性和臨床妊娠率，而并不降低原FISH技術(shù)診斷的可移植胚胎數(shù)目。在本中心的小樣本研究中，對有多次反復(fù)種植失敗和流產(chǎn)史的7名患者的PGS檢測中，有6名獲得移植，其中4名獲得持續(xù)妊娠和活產(chǎn)。提示該項技術(shù)的發(fā)展可能在臨床上有一定的應(yīng)用價值。

PGD的發(fā)展伴隨著分子遺傳診斷技術(shù)的發(fā)展，各種遺傳診斷技術(shù)都有其適用范圍及優(yōu)缺點，穩(wěn)定的、準(zhǔn)確的、高通量的分子遺傳診斷技術(shù)是PGD的發(fā)展趨勢，目前aCGH／SNP array已經(jīng)在PGD中取得良好的應(yīng)用成果。最近，單細胞高通量測序技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)，即表現(xiàn)出前所未有的應(yīng)用前景，并成為PGD的一個巨大的潛在的檢測手段。