發(fā)酵床陳化墊料腐解復(fù)合微生物菌劑篩選

尹紅梅，陳文輝，王 震，劉 標，杜東霞，賀月林

（湖南省微生物研究所，湖南長沙410009）

隨著養(yǎng)殖業(yè)特別是規(guī)?；?、集約化養(yǎng)殖的迅猛發(fā)展，畜禽糞尿造成環(huán)境污染問題越來越嚴重，加強畜禽糞尿污染的防治已迫在眉睫［1］。發(fā)酵床技術(shù)是為了實現(xiàn)畜禽糞尿原位降解的新型養(yǎng)殖技術(shù)［2－4］。發(fā)酵床在使用過程中，其墊料有一定使用壽命，如何對廢棄的陳化墊料進行處理是發(fā)酵床養(yǎng)豬技術(shù)中一個急需解決的關(guān)鍵問題。目前對陳化墊料處理方式有再生和堆肥2 種，最主要的處理方式為堆肥。

堆肥處理是依靠堆肥中含有各類微生物在分解有機物中交替出現(xiàn)，使堆溫上升、下降，從分解水溶性有機物開始，逐漸分解難分解和抗分解的有機物并轉(zhuǎn)化為腐殖物質(zhì)的生物化學(xué)過程［5］。發(fā)酵床陳化墊料主要由沒有完全分解的豬糞與纖維素、木質(zhì)素含量高的鋸木屑和稻殼組成。由于腐殖質(zhì)在木質(zhì)纖維素腐解過程中形成，加強木質(zhì)纖維素的腐解便成為堆肥充分腐熟的關(guān)鍵。就生物降解難易而言，纖維素屬難分解物質(zhì)，木質(zhì)素屬抗分解物質(zhì)。自然界只有少數(shù)微生物能分解木質(zhì)素，其徹底分解需幾個月甚至1～2年時間。因此，探討加速陳化墊料堆肥有機物腐解，縮短堆肥時間，具有重要的實用意義。

1 材料與方法

1.1 菌劑

①Kc∶Kn∶Gf＝1∶1∶1，活菌數(shù)為1.0×109cfu／mL；②Kn∶Gf＝1∶1，活菌數(shù)為1.0×109cfu／mL；③Kc∶Kn ＝1∶1，活菌數(shù)為1.0×109cfu／mL；④Kc∶Gf＝1∶1，活菌數(shù)為1.0×109cfu／mL。以上菌種均為實驗室分離保存：Kc為枯草芽孢桿菌（產(chǎn)蛋白酶能力強，在發(fā)酵液中反應(yīng)24 h后，蛋白酶活達806 U／mL），Kn為康寧木霉（產(chǎn)纖維素酶能力強，在發(fā)酵液中反應(yīng)24h后，纖維素酶活達215 U／mL），Gf為高溫放線菌（耐高溫，最適生長溫度為50 ℃），三菌株之間無拮抗作用。

1.2 試驗材料

本試驗中，陳化料與豬糞來自湖南新五豐韶山分公司養(yǎng)豬場（主要成分見表1）。陳化墊料與豬糞混合比例為3∶2（重量比），C／N 比為25∶1，水分含量55%左右。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 堆肥池規(guī)格 堆肥池的長1.0 m、寬1.0 m、高1.5m。

1.3.2 試驗分組 試驗分5組，處理1、處理2、處理3、處理4分別接種0.2%的①、②、③、④微生物菌劑，CK 為對照組，不接種微生物菌劑，通氣方式采用人工翻堆。

1.4 樣品采集

分別在第0d、5d、10d、15d、20d、25d采樣，采樣點位于墊料表層下30cm 處，分前、后、左、右、中5點，每次采5個混合樣，取其平均值。

表1 試驗原料主要成分Table 1 Initial conditions and composition of the material composting

1.5 測定指標與方法

試驗期內(nèi)每天11∶00～12∶00，測定發(fā)酵料表面下30cm 處溫度及pH；有機質(zhì)采用灼燒法測定；全氮采用凱氏定氮法測定；木質(zhì)素采用酸性洗滌灼燒法測定；纖維素采用濃酸水解灼燒法測定；大腸菌群采用煌綠乳糖膽鹽發(fā)酵MPN 計數(shù)法；種子發(fā)芽率測定參照文獻［6］方法進行：將鮮樣用蒸餾水按水肥比10∶1充分震蕩1h，30 ℃浸提1晝夜，用紗布過濾，濾液以3 000rpm 離心10min，吸取8mL 上清液加到鋪有1張濾紙的12cm 培養(yǎng)皿內(nèi)，每個培養(yǎng)皿均勻點播20粒飽滿的蘿卜種子，放置在（25±1）℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第72h測種子發(fā)芽率.每個處理重復(fù)3次，對照為清水。計算公式：發(fā)芽率指數(shù)＝［（浸提液中的種子發(fā)芽率×種子根長）／（蒸餾水中的種子發(fā)芽率×種子根長）］×100%。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進行單因子方差分析，并用Duncan新復(fù)極差法進行多重比較。

2 結(jié)果與討論

2.1 溫度變化

溫度是判定堆肥能否達到無害化要求的最重要指標之一。堆肥過程中，堆體溫度應(yīng)控制在45～65℃，但在55～60 ℃時較好［7］。如圖1所示，各試驗組溫度變化趨勢基本相同，均可分為3個時期即升溫期、高溫期、降溫腐熟期。處理組都在1～3d進入高溫堆肥階段（＞50℃），但在50℃以上維持時間不同，其中處理1時間最長為13d，隨后依次為處理3、處理4、處理2，高溫保持的時間分別為10d、10 d、6d，而對照組CK 僅為4d。統(tǒng)計分析表明：4個處理組之間堆肥過程中平均溫度無顯著差異（P＞0.05），處理1、處理3、處理4與處理2、CK 之間堆肥過程中平均溫度差異顯著（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，接種微生物菌劑有利于延長堆肥高溫時間，有利于微生物的生長和繁殖，從而更好地促進有機質(zhì)降解。

2.2 pH 變化

由圖2可知，堆肥過程中，所有試驗組pH 均維持在7.5～9.0之間。全程而言，pH 變化有一個先上升后下降趨勢。至堆肥結(jié)束時，所有處理組pH在8.0～9.0之間，符合腐熟堆肥pH 應(yīng)在8.0～9.0的標準［8］，對照組CK 的pH 為7.68，沒有達到堆肥腐熟標準。統(tǒng)計分析表明：4個處理組之間平均平均pH 差異不顯著（P＞0.05），但均與CK 組差異顯著（P＜0.05）。

2.3 C／N 變化

各堆肥組C／N 變化如圖3示。堆肥過程中氮相對含量隨著堆制天數(shù)的延長有增加的趨勢，有機質(zhì)含量隨著堆制天數(shù)的延長逐漸降低。分析表明，氮和有機質(zhì)含量的變化主要發(fā)生在堆肥后第5d至第20d之間，此后漸趨穩(wěn)定，這表明堆肥降溫腐熟期是氮、有機質(zhì)含量發(fā)生變化的主要時期。此期微生物不斷以碳源物質(zhì)為能源，利用堆肥基質(zhì)中的各種養(yǎng)分合成自身所需物質(zhì)，碳源物質(zhì)含量不斷下降，全氮絕對含量減少，但相對含量增加。堆肥結(jié)束時，4個處理組及CK 碳氮比分別為18.5、19.9、19.3、19.2、20.9。統(tǒng)計分析表明：堆肥結(jié)束時，各組碳氮比差異不顯著（P＞0.05）。在堆肥過程中，處理1的C／N 比下降最快，可能是因為處理1添加的微生物菌劑最利于促進堆肥中有機質(zhì)的分解。

圖1 堆溫變化Fig.1 Changes of temperature during the composting

圖2 pH 變化Fig.2 Changes of pH values during the composting

2.4 木質(zhì)素與纖維素降解率

各試驗組對纖維素與木質(zhì)素降解率如圖4、圖5所示。由圖4、5可知，所有試驗組的變化趨勢相似，在前期幾乎沒有降解，到中后期才表現(xiàn)出較強的降解效果。試驗結(jié)束時，4個處理組對纖維素的降解率分別為47.6%，38.7%，43.1%，43.5%，而對照組CK 纖維素降解率只有19.7%；4個處理組對木質(zhì)素的降解率分別為30.2%，23.8%，25.9%，27.5%，而對照組CK 木質(zhì)素降解率只有13.6%。統(tǒng)計分析表明：試驗結(jié)束時，4個處理組與CK之間的木質(zhì)素與纖維素降解效率差異均顯著（P＜0.05），其他各組之間無顯著差異（P＞0.05）。其中處理1對木質(zhì)素與纖維素的降解率均最高。

圖3 C／N 變化Fig.3 Changes of C／N ratio during the composting

圖4 纖維素降解率Fig.4 The degradation rate of cellulose during the composting

2.5 種子發(fā)芽率

用生物學(xué)方法測定堆肥的毒性，是檢驗有機質(zhì)腐熟度的一種直接且有效的方法［9］。種子發(fā)芽率不但能檢測堆肥樣品的毒性，而且能預(yù)測堆肥毒性的發(fā)展［10］。如果GI＞50%，則可認為基本無毒性，當GI達到80%～85%時，這種堆肥就可以認為是對植物沒有毒性［11］。從圖6可以看出，不同堆制時間對種子發(fā)芽的抑制作用不同。堆制初期的堆肥幾乎完全抑制種子發(fā)芽，這種抑制作用隨堆制時間的延長而逐漸降低，種子發(fā)芽率逐步上升，20d左右種子發(fā)芽率的變化趨于穩(wěn)定。堆肥至20d時，處理13～10d，這種下降表現(xiàn)最為明顯，亦即堆肥的高溫期是殺滅病原菌的最主要時期。而對照組CK 由于發(fā)芽率指數(shù)達82.1%，其他處理組在80%以下。至堆肥結(jié)束時，處理1、處理2、處理3、處理4、CK 種子發(fā)芽率指數(shù)分別為98.5%、81.2%、88.5%、89.3%、62.3%。統(tǒng)計分析表明：堆肥結(jié)束時，處理1、處理2、處理3、處理4之間發(fā)芽率指數(shù)差異不顯著（P＞0.05），均與對照組差異顯著（P＜0.05）。從種子發(fā)芽率指數(shù)來看，堆肥結(jié)束時除對照組CK 沒有腐熟外，其他試驗組堆肥都已腐熟，其中處理1 在20d時，發(fā)芽率指數(shù)達82.1%，腐熟時間最短。

圖5 木質(zhì)素降解率Fig.5 The degradation rate of lignin during the composting

圖6 發(fā)芽率指數(shù)的變化Fig.6 Changes of GI during the composting

2.6 大腸菌群

如表2所示，隨著堆肥進程的延長，所有試驗組大腸菌群表現(xiàn)出明顯的下降趨勢。特別在堆肥的前整個堆肥時期高溫維持時間短，雖所含大腸菌群呈逐步下降趨勢，但至堆肥結(jié)束時大腸菌群含量維持在103cfu／g，仍達不到糞便無害化標準；而所有處理組在堆肥后3～10d時已基本維持在101～102堆肥的數(shù)量級，符合糞便無害化標準，尤其處理1與處理4在堆肥結(jié)束時，檢測不出大腸菌群。

表2 大腸菌群的最可能數(shù)Table 2 Most probable number of coliform cfu／g

3 小結(jié)

C／N、種子發(fā)芽率是較好地反映堆肥的腐熟進程的生化指標，當C／N 降至20∶1以下、種子發(fā)芽率大于70%時，可判定堆肥已腐熟。依據(jù)上述指標，并結(jié)合糞便無害化標準，可得出本研究中除對照組CK外，其余各試驗組在第18～25d時堆肥已腐熟。

在添加微生物菌劑的的各試驗組中，處理1效果最好，高溫保持的時間為13d，至堆肥結(jié)束時對纖維素、木質(zhì)素的降解率分別為47.6%，30.2%，種子發(fā)芽率指數(shù)為98.5%，大腸桿菌未檢測出。

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