人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療小腦萎縮

應(yīng)奇 王毛毛 張風(fēng)林 徐小龍 郭子寬 許志方

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）最初是在骨髓中發(fā)現(xiàn)的，近年來人們從胎兒臍帶中也分離出MSCs，即人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（Human umbilical-cord mesenchymal stem cells，hUMSCs）。 有研究表明，MSCs具有高度增殖、自我更新和多向分化潛能，可能成為治療某些神經(jīng)退行性疾病的有效手段[1-2]。本研究從健康新生兒臍帶中分離采集MSCs，連續(xù)體外擴(kuò)增，取得較大數(shù)量的hUMSCs，采用鞘內(nèi)注射結(jié)合靜脈注射的方法,治療小腦萎縮（cerebellar atrophy，CA）患者 57例，取得了較好的臨床效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本組57例CA患者為我院神經(jīng)外科2011年7月至2012年3月收治的患者。本組中，男性24例，女性33例，年齡14～66歲（平均37歲）。其中，30歲以下26例，30～59歲29例，60歲以上2例。病程2～12年（平均4.5年）。有家族史者19例，外傷史者1例，吸毒史者1例，煤氣中毒史者1例，病因不詳者35例。所有患者均有明顯的小腦萎縮癥狀及體征，表現(xiàn)為共濟(jì)失調(diào)、姿勢及步態(tài)障礙、構(gòu)音障礙、咽反射減弱及動(dòng)態(tài)功能（指鼻動(dòng)作、輪替動(dòng)作）差等，并均經(jīng)MRI及MRA檢查，診斷明確。治療前以《世界神經(jīng)病聯(lián)合會(huì)國際合作共濟(jì)失調(diào)量表》（International Cooperative Ataxia Rating Scale，ICARS）[3]進(jìn)行評分，20分及以下者4例，21～50分者33例，51～70分者18例，71分及以上者2例。

1.2 hUMSCs的制備

制備及培養(yǎng)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射與輻射研究所實(shí)驗(yàn)血液室進(jìn)行。將健康新生兒臍帶在無菌條件下，采用酶消化法分離，用hUMSCs專用培養(yǎng)體系制成細(xì)胞懸液 1.0×105cells/mL，并按 5.0×105cells/cm2底面積接種于培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每周換液2次，每隔5～7 d傳代1次，至細(xì)胞總數(shù)達(dá)1.5×107以上時(shí)（一般需14～20 d，傳代<5代），收集細(xì)胞，制成生理鹽水細(xì)胞懸液，經(jīng)檢定合格后，登記、配發(fā)臨床使用。

1.3 治療方法

本組患者術(shù)前均接受常規(guī)檢查，排除其他疾病，簽署知情同意書，并報(bào)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。采取腰穿鞘內(nèi)注射結(jié)合靜脈滴注的方法，每次移植的細(xì)胞總量約為 1.0×108個(gè)細(xì)胞，1/4（2.5×107/5 mL）鞘內(nèi)注射，3/4（7.5×107/100 mL）靜脈滴注。 治療前常規(guī)予地塞米松5 mg、頭孢曲松鈉2.0 g靜注?；颊吒鶕?jù)病情的嚴(yán)重程度和改善情況，分別接受1～3次治療，每次治療間隔1～2周。

1.4 評定標(biāo)準(zhǔn)

所有患者分別于治療后3個(gè)月、6個(gè)月進(jìn)行隨訪。依據(jù)臨床癥狀的改善及ICARS進(jìn)行評分。顯效：評分下降20分以上、飲食嗆咳消失。有效：評分下降5～19分、飲食嗆咳好轉(zhuǎn)。無效：評分下降小于5分，臨床癥狀無變化。

2 結(jié)果

本組57例CA患者治療過程順利，未出現(xiàn)出血、感染、神經(jīng)損傷等嚴(yán)重并發(fā)癥。7例次移植治療后24h內(nèi)出現(xiàn)發(fā)熱（<38℃）和/或輕微頭痛等癥狀，均未予特殊處理，自行緩解。平均治療后出院時(shí)間為3 d。

治療后3個(gè)月隨訪結(jié)果表明，本組中顯效18例（31.6%），有效 23例（40.4%），無效 16 例（28.0%），總有效率為72.0%；治療后6個(gè)月隨訪發(fā)現(xiàn)，本組中顯效 18例（31.6%），有效 27例（47.4%），無效 12例（21.0%），總有效率為79.0%。顯效患者中有12例在出院時(shí)就出現(xiàn)明顯的癥狀改善，表現(xiàn)為行走穩(wěn)定性和肢體動(dòng)作協(xié)調(diào)性增強(qiáng)，發(fā)音及飲食嗆咳癥狀改善。隨訪中未發(fā)現(xiàn)患者出現(xiàn)癥狀加重和其他遠(yuǎn)期并發(fā)癥。隨訪發(fā)現(xiàn)，年紀(jì)輕、病程短的患者療效優(yōu)于年長、病程長的患者，有外傷、吸毒、中毒史者療效較差。

3 討論

小腦萎縮是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種退行性病變，以共濟(jì)失調(diào)為主要臨床表現(xiàn)。病理表現(xiàn)為小腦半球及蚓部、小腦中下腳部神經(jīng)細(xì)胞的萎縮、變性，髓鞘的脫失，膠質(zhì)細(xì)胞增生，浦肯野細(xì)胞消失；嚴(yán)重者可以波及腦干和脊髓；亦可見到大腦皮質(zhì)、基底核、丘腦、橋腦基底核等腦干部分核團(tuán)的變性。小腦萎縮的病因不明，部分患者有家族傾向，目前尚無有效的治療方法。近年來，有報(bào)道采用胚胎神經(jīng)干細(xì)胞[4]及臍血源神經(jīng)干細(xì)胞[5]治療小腦萎縮，取得一定的臨床療效，提示干細(xì)胞可能有助于小腦萎縮的治療。

MSCs是一種成體干細(xì)胞，也是一種多能干細(xì)胞，具有多向分化、高度增殖、抗原性低等特性，能在一定條件下大量增殖，在適合的環(huán)境下向特定的組織細(xì)胞誘導(dǎo)分化并且向損傷或病變部位聚集，形成所謂“歸巢效應(yīng)”。有研究證明，間充質(zhì)干細(xì)胞能在體外和動(dòng)物體內(nèi)分化形成神經(jīng)元樣細(xì)胞[6]。Zhang等[7]實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hUMSCs能顯著改善小腦萎縮大鼠模型的運(yùn)動(dòng)能力。馬曉偉等[8]認(rèn)為，人自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療橄欖-橋腦-小腦萎縮具有一定療效。本實(shí)驗(yàn)中，MSCs在體外進(jìn)行大量的分裂、增殖，經(jīng)腰穿注入腦脊液并通過腦脊液循環(huán)進(jìn)入小腦及周圍，在局部微環(huán)境的誘導(dǎo)下分化形成相應(yīng)的細(xì)胞，以替代受損或變性的細(xì)胞。同時(shí)，進(jìn)入腦脊液和靜脈的MSCs還能分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)保護(hù)因子，促進(jìn)細(xì)胞的修復(fù)，“喚醒”處于休眠狀態(tài)的神經(jīng)細(xì)胞，減緩神經(jīng)細(xì)胞受損或變性的過程。本組有部分病例治療后3 d即有癥狀改善，可能就與這些細(xì)胞因子啟動(dòng)了機(jī)體本身的修復(fù)機(jī)制有關(guān)。

本方法對患者損傷極小。由于MSCs抗原性極低，異體移植并不需要配型。臍帶是嬰兒出生后的廢棄物，從中分離提取MSCs不涉及倫理方面的問題，來源比較充分，技術(shù)難度不大，也避免了從自體骨髓或外周血中提取MSC增加患者痛苦、存在病毒感染風(fēng)險(xiǎn)、需要骨髓動(dòng)員等弊端。本組57例患者治療后無一出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，而療效較傳統(tǒng)的藥物、康復(fù)理療等明顯提高，說明該方法是安全、有效的。當(dāng)然，MSCs治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病目前還處于臨床探索階段，其遠(yuǎn)期療效尚待觀察。本方法的部分機(jī)理亦尚未得到闡明，如MSCs分化的神經(jīng)元細(xì)胞是如何與機(jī)體原有的神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行整合并發(fā)揮功能的，以及MSCs分泌的細(xì)胞因子是如何起作用的，都需要進(jìn)一步的研究和證實(shí)。

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