組織工程支架材料在膀胱修復(fù)中的應(yīng)用進(jìn)展

趙陽 張明 綜述 王忠 盧慕峻 審校

腫瘤、結(jié)核、神經(jīng)源性膀胱以及一些先天性膀胱疾病都可導(dǎo)致膀胱缺損，需進(jìn)行修復(fù)重建。利用胃腸道替代膀胱是目前臨床中最常用的方法，存在著諸多并發(fā)癥，且會(huì)造成新的損傷。組織工程技術(shù)為膀胱修復(fù)與重建開辟了一條嶄新的途徑。近年來，利用組織工程技術(shù)進(jìn)行膀胱修復(fù)重建的實(shí)驗(yàn)和臨床研究逐年增加。

目前組織工程膀胱重建有兩種方法：一種是利用單純支架材料重建，另一種是種子細(xì)胞復(fù)合支架材料進(jìn)行膀胱修復(fù)。目前的研究表明，后者在構(gòu)建膀胱解剖結(jié)構(gòu)、恢復(fù)膀胱功能方面要遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于前者[1]。目前絕大部分膀胱組織工程重建實(shí)驗(yàn)都采用種子-細(xì)胞復(fù)合支架材料的重建方法。

支架材料的研究是組織工程膀胱修復(fù)重建的重要基礎(chǔ)。近些年來，支架材料的研究發(fā)展迅速。理想的膀胱修復(fù)材料應(yīng)具有以下性能：良好的生物相容性，可靠的機(jī)械性能，能抵抗腹膜內(nèi)及腹膜外感染，不影響正常腎功能，具有良好的收縮能力，并通過神經(jīng)和膀胱平滑肌再生后具有自主排尿功能等[2]。

1 天然生物材料

1.1 天然細(xì)胞外基質(zhì)

細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matricx，EMC）是由細(xì)胞自身合成并分泌到胞外，分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子物質(zhì)，主要含有膠原蛋白、纖維蛋白黏連素、層黏連蛋白等。目前，在泌尿系統(tǒng)中應(yīng)用最多的是膠原（Collagen）。Engelhardt等[3]將人膀胱平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞分別種植在可塑壓縮膠原支架內(nèi)部和表面。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，材料表面和內(nèi)部出現(xiàn)了高效的細(xì)胞種植及細(xì)胞增殖，認(rèn)為可塑壓縮膠原支架具有組織工程膀胱修復(fù)的巨大潛能。

膠原本身無毒性，組織相容性好，還可刺激移植組織產(chǎn)生新的膠原，且降解產(chǎn)物也可被機(jī)體吸收。但其機(jī)械強(qiáng)度較差，在體內(nèi)降解過快，不同批次制備的膠原生化性質(zhì)也有著較大的差異，這些都限制了膠原支架材料的進(jìn)一步應(yīng)用。

1.2 脫細(xì)胞基質(zhì)

脫細(xì)胞基質(zhì)材料是利用同種或異種組織，通過機(jī)械和化學(xué)方法去除組織中的細(xì)胞、抗原等成分，僅保留細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。具有多種天然細(xì)胞外成分，有利于細(xì)胞的黏附、增殖和分化，并具有一定的力學(xué)強(qiáng)度。目前在膀胱修復(fù)過程中應(yīng)用較多的脫細(xì)胞基質(zhì)材料，是膀胱黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)（Bladder acellular matrix graft，BAMG）和小腸黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)（Small intestinal submucosa，SIS）。

BAMG來源于膀胱組織，與人膀胱組織結(jié)構(gòu)最接近，生物相容好，具有修復(fù)膀胱組織的獨(dú)特優(yōu)勢，是較為理想的天然生物支架。盧慕峻等[9]發(fā)現(xiàn)，尿路上皮細(xì)胞、膀胱平滑肌細(xì)胞與BAMG體外構(gòu)建，能夠形成類似膀胱壁的結(jié)構(gòu)。Liu等[10]通過體外實(shí)驗(yàn)比較不同組織來源的生物學(xué)性能，發(fā)現(xiàn)不同組織來源的細(xì)胞外基質(zhì)材料都具有很好的生物相容性，而與其他細(xì)胞外基質(zhì)相比，BAMG則表現(xiàn)出更好的吸水性、抗生物降解性、機(jī)械性能及干細(xì)胞吸附能力。Zhu等[11]用BAMG修補(bǔ)缺損不同的膀胱（A組30%～40%缺損，B組60%～70%缺損），24周后，發(fā)現(xiàn)A組膀胱容量達(dá)到原容量的95%左右；組織學(xué)上，尿路上皮和平滑肌細(xì)胞生長良好，規(guī)則分布，接近完全再生。而B組膀胱容量僅達(dá)到原容量的65%左右；組織學(xué)上，尿路上皮和平滑肌細(xì)胞生長不均，分布雜亂。由此可見，BAMG是修補(bǔ)膀胱缺損的良好支架材料，但并不適用于修補(bǔ)缺損較大的膀胱。

SIS是一種源于小腸的新型脫細(xì)胞基質(zhì)材料，保留有天然的膠原纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并含有多種生長因子[4-5]。更為重要的是，SIS可以開啟特定部分的組織重建，并指引周圍細(xì)胞增殖、分化以及新血管的形成[6]。SIS的上述結(jié)構(gòu)和特點(diǎn)，使其受到極大關(guān)注。韓平等[5]將膀胱平滑肌細(xì)胞種植在SIS上，發(fā)現(xiàn)SIS促進(jìn)了膀胱平滑肌細(xì)胞黏附和增殖；進(jìn)一步研究證實(shí)，這與小腸黏膜下層特殊的三維支架結(jié)構(gòu)以及所含的生長因子有密切關(guān)系。而Kropp等[7]指出，并非所有的SIS材料都適用于膀胱重建，只有大于3歲母豬遠(yuǎn)段回腸的SIS才具有穩(wěn)定可靠的組織再生能力。John等[8]發(fā)現(xiàn)，SIS在體內(nèi)也會(huì)引起炎癥反應(yīng)。去細(xì)胞不完全的SIS材料可能引起嚴(yán)重的免疫反應(yīng)。所以，優(yōu)化SIS的制備方法，篩選出修復(fù)能力穩(wěn)定可靠的SIS，是今后研究的重要方向。

1.3 羊膜

由羊膜上皮、基底膜及基質(zhì)三部分組成。脫細(xì)胞羊膜富含膠原，無細(xì)胞毒性，具有較好的機(jī)械性能和低免疫原性，且來源廣泛，易加工處理，無倫理學(xué)問題。Kazuyoshi等[12]使用脫細(xì)胞羊膜和小腸黏膜進(jìn)行體外膀胱修復(fù)的比較，發(fā)現(xiàn)兩者作為膀胱支架的作用基本相同，人羊膜上也生長出了足夠的上皮細(xì)胞、逼尿肌纖維和神經(jīng)纖維，形成了有功能的膀胱，表明脫細(xì)胞羊膜可以作為組織工程膀胱的替代修補(bǔ)材料。但羊膜存在感染潛在疾病的風(fēng)險(xiǎn)。

膠原、膀胱黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)和小腸黏膜下脫細(xì)胞基質(zhì)及羊膜等，作為天然的生物材料，具有與人體最接近的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)、活性因子和多種信號(hào)分子，因此易被人體組織識(shí)別，建立信號(hào)連接，引發(fā)自身修復(fù)機(jī)制，實(shí)現(xiàn)材料降解與組織器官再生同步化，顯示出人工合成支架材料無可比擬的優(yōu)勢。但天然生物材料也存在一些問題[13]，如機(jī)械強(qiáng)度較差，無法規(guī)模化、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，在體內(nèi)降解較快，易感染潛在疾病等，限制了它們的廣泛應(yīng)用。

2 人工合成高分子聚合材料

人工合成高分子聚合材料種類繁多，包括聚乳酸（PLA）、聚羥基乙酸（PGA）、聚己內(nèi)酯（PCL）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）、聚乳酸-己內(nèi)酯共聚物（PLCL）、聚氨酯（PU）等。這些材料可根據(jù)不同需求，制備成不同形狀與結(jié)構(gòu)的三維支架，并精確地控制其機(jī)械性能、降解率、孔隙率和孔徑。人工合成高分子聚合材料具有極好的應(yīng)用前景。

盧慕峻等[14]將膀胱平滑肌細(xì)胞和尿路上皮細(xì)胞植入PGA支架中，在體外成功構(gòu)建出類似復(fù)層膀胱壁的結(jié)構(gòu)，認(rèn)為PGA具有作為組織工程膀胱修復(fù)支架的可行性。Feng等[15]研究了PLGA和水性聚氨酯（WBPU）支架，并比較了膀胱平滑肌細(xì)胞（BSMc）在PLGA和WBPU上的黏附、增殖及BSMC-α-肌動(dòng)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，WBPU優(yōu)于PLGA，認(rèn)為WBPU材料是一種新的優(yōu)良的組織工程膀胱修復(fù)支架。

人工合成高分子聚合材料，雖然得到了廣泛的應(yīng)用，但生物相容性差，生物活性低，缺少細(xì)胞外基質(zhì)中的各種生物信號(hào)及功能基團(tuán)，直接影響到種子細(xì)胞的黏附、分化。為改善人工合成材料的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和表面特性，復(fù)合材料以及經(jīng)修飾和改性等預(yù)處理的材料成為了當(dāng)下研究的熱點(diǎn)。

3 復(fù)合支架材料

復(fù)合支架材料是由兩種或兩種以上的材料優(yōu)化組合而成。在組織工程膀胱修復(fù)中，由天然生物材料和人工合成材料組成的復(fù)合材料最為多見。天然生物材料具有較好的組織相容性，無毒，為細(xì)胞生長、黏附、分化提供了最接近于人體的微環(huán)境，但缺乏足夠的力學(xué)強(qiáng)度，降解較快，無法規(guī)?；?、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。而大部分人工合成材料都屬于 “生物惰性材料”，生物活性弱，缺乏細(xì)胞識(shí)別位點(diǎn)，不能支持細(xì)胞在材料表面的黏附、增殖、分化，但卻具有良好的力學(xué)特性，能大規(guī)模生產(chǎn)。天然生物材料和人工合成材料的復(fù)合，可彌補(bǔ)單一材料的缺點(diǎn)，能滿足組織工程膀胱修復(fù)與重建的各種需求。

Stankus等[16]分別制備了可降解的聚（酯-聚氨酯）-尿素（PEUU）支架和豬ECM支架，并結(jié)合成UBM-PEUU復(fù)合支架。結(jié)果表明，與單純PEUU相比，復(fù)合支架體外降解增加，并具有較強(qiáng)的細(xì)胞黏附、滲透、增殖能力；與單純ECM支架相比，其機(jī)械強(qiáng)度和柔韌性都顯著增加，并能誘導(dǎo)組織重塑，是一種較為理想的支架材料。Engelhardt等[17]將人類膀胱平滑肌和上皮細(xì)胞在膠原-PLAC復(fù)合支架上體外培養(yǎng)2周。結(jié)果表明，與單獨(dú)PLAC相比，膠原-PLAC復(fù)合支架在體內(nèi)炎癥反應(yīng)較少，表現(xiàn)出高效的細(xì)胞種植、增殖和良好的機(jī)械性能。

Atala等[18]將尿道上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞種植到單純BAMG支架及膠原-PGA復(fù)合支架上。結(jié)果顯示，與單純BAMG支架組相比，膠原-PGA復(fù)合材料組膀胱功能獲得持續(xù)改善，其平均最大膀胱容量、平均膀胱順應(yīng)性、平均膀胱漏尿點(diǎn)壓、最大平均日間無尿漏間隔等方面均更具有優(yōu)勢。用膠原-PGA復(fù)合材料進(jìn)行的膀胱重建術(shù)首次在臨床試驗(yàn)中獲得成功，顯示了復(fù)合材料應(yīng)用于膀胱修復(fù)的巨大潛力。

4 材料的預(yù)處理

已有的組織工程支架材料各有優(yōu)缺點(diǎn)，為了更好地發(fā)揮支架材料的作用，針對材料進(jìn)行預(yù)處理，以使其更符合組織構(gòu)建的要求。

Liu等[19]把尿路上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞種植到經(jīng)氧化處理過的豬膀胱脫細(xì)胞黏膜下層上，并植入體內(nèi)。發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)處理的支架相比，經(jīng)氧化處理過的支架孔隙率和孔徑增大，拉伸強(qiáng)度增加，細(xì)胞的滲透能力也顯著增強(qiáng)。Mondalek等[20]把透明質(zhì)酸-聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米微粒 （HA-PLGA NPs）加入豬小腸黏膜下層（SIS）修飾后，發(fā)現(xiàn)其穩(wěn)定了SIS的多孔結(jié)構(gòu)，提高了表面的生物相容性和組織修復(fù)能力。與未修飾的SIS相比，其血管再生能力顯著增強(qiáng)。另有研究表明，添加堿性成纖維生長因子以及網(wǎng)膜包裹預(yù)置等預(yù)處理也能顯著增加修復(fù)部位的血管化，有效促進(jìn)組織修復(fù)再生[21-22]。

經(jīng)過預(yù)處理，可進(jìn)一步優(yōu)化這些支架材料，使其表現(xiàn)出一些新的性質(zhì)，擴(kuò)大了應(yīng)用范圍。

5 納米材料

隨著納米生物技術(shù)的快速發(fā)展，納米材料也開始應(yīng)用于組織工程膀胱修復(fù)。納米材料是指在三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍（1～100 nm），或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料。納米支架材料具有表面積/體積比大、孔徑大、孔隙率高、擴(kuò)散能力強(qiáng)等特點(diǎn)，能促進(jìn)細(xì)胞黏附、遷徙和增殖。

納米材料憑借著傳統(tǒng)材料無可比擬的生物學(xué)性能，正成為最具發(fā)展?jié)摿Φ闹Ъ懿牧?。Miller等[23]發(fā)現(xiàn)，和普通PLGA支架相比，具有納米結(jié)構(gòu)的PLGA支架增加了對纖連蛋白和玻連蛋白的吸附，納米支架上的細(xì)胞黏附和生長明顯優(yōu)于普通支架，認(rèn)為納米材料的結(jié)構(gòu)可能有利于改善支架的生物相容性。Harrington等[24]將納米級的縮氨酸涂在PGA支架上，經(jīng)體外培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，與單純PGA支架相比，生長在納米復(fù)合物上的BSM密度更大，說明納米復(fù)合材料支架促進(jìn)了BSM的生長、增殖。

利用組織工程技術(shù)進(jìn)行膀胱的修復(fù)重建是一種理想的重建方法，而支架材料的選擇極為重要，是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。隨著材料科學(xué)和其他相關(guān)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展，目前應(yīng)用于膀胱組織工程構(gòu)建的各種材料，將得到進(jìn)一步的完善，從而使得組織工程膀胱構(gòu)建能真正應(yīng)用于臨床。

[1] Zhang YY,Kropp BP,Lin HK,et al.Bladder regeneration with cell-seeded small intestinal submucosa[J].Tissue Eng,2004,10(1-2):181-187.

[2] Maurer S,Feil G,Stenzl A.In vitro stratified urothelium and its relevance in reconstructive urology[J].Urologe A,2005,44(7):738-742.

[3] Engelhardt EM,Stegberg E,Brown RA,et al.Compressed collagen gel:a novel scaffold for human bladder cells[J].J Tissue Eng Regen Med,2010,4(2):123-130.

[4] Campodonico F,Benelli R,Michelazzi A,et al.Bladder cell culture on small intestinal submucosa as bioscaffold:experimental study on engineered urothelial grafts[J].Eur Urol,2004,46(4):531-537.

[5] 韓平,楊志明,智偉,等.膀胱平滑肌細(xì)胞與小腸黏膜下層體外復(fù)合培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國修復(fù)重建外科雜志,2007,21(12):1366-1370.

[6] Luo JC,Chen W,Chen XH,et al.A multi-step method for preparation of porcine small intestinal submucosa(SIS)[J].Biomaterials,2011,32(3):706-713.

[7] Kropp BP,Cheng EY,Lin HK,et al.Reliable and reproducible bladder regeneration using unseeded distalsmallintestinal submucosa[J].J Urol,2004,172(4 Pt 2):1710-1713.

[8] John TT,Aggarwal N,Singla AK,et al.Intense inflammatory reaction with porcine small intestine submucosa pubovaginal sling or tape forstress urinary incontinence[J].Urology,2008,72(5):1036-1039.

[9] 盧慕峻,王忠,周廣東,等.組織工程化膀胱壁復(fù)層結(jié)構(gòu)的體外構(gòu)建[J].中華泌尿外科雜志,2007,27(suppl):67-70.

[10] Liu L,Li D,Wang Y,et al.Evaluation of the biocompatibility and mechanical properties of xenogeneic(porcine)extracellular matrix (ECM) scaffold for pelvic reconstruction [J].Int Urogynecol J,2011,22(2):221-227.

[11] Zhu WD,Xu YM,Feng C,et al.Different bladder defects reconstructed with bladder acellular matrix grafts in a rabbit model[J].Urologe,2011,50(11):1420-1425.

[12] Iijima K,Igawa Y,Imamura T,et al.Transplantation of peserved human amniotic membrane for bladder augmentation in rats[J].Tissue Eng,2007,13(3):513-524.

[13] 孫天成,孔清泉,楊志明.天然生物支架材料在軟骨修復(fù)中的研究進(jìn)展[J].中國矯形外科雜志,2006,14(6):461-464.

[14] 盧慕峻,王忠,董國勤,等.聚羥基乙酸作為支架材料體外構(gòu)建復(fù)層膀胱壁結(jié)構(gòu)的探討[J].臨床泌尿外科雜志,2009,24(12):935-938.

[15] Xu F,Wang Y,Jiang X,et al.Effects of different biomaterials:Comparing the bladder smooth muscle cells on waterborne polyurethane or poly-lactic-co-glycolic acid membranes[J].Kaohsiung J Med Sci,2012,28(1):10-15.

[16] Stankus JJ,Freytes DO,Badylak SF,et al.Hybrid nanofibrous scaffoldsfrom electrospinningofa synthetic biodegradable elastomer and urinary bladder matrix[J].J Biomater Sci Polym Ed,2008,19(5):635-652.

[17] Engelhardt EM,Micol LA,Houis S,et al.A collagen-poly(lactic acid-co-ε-caprolactone)hybrid scaffold for bladder tissue regeneration[J].Biomaterials,2011,32(16):3969-3976.

[18] Atala A,Bauer SB,Soker S,et al.Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty[J].Lancet,2006,367(9518):1241-1246.

[19] Liu Y,Bharadwaj S,Lee SJ,et al.Optimization of a natural collagen scaffold to aid cell–matrix penetration for urologic tissue engineering[J].Biomaterials,2009,30(23-24):3865-3873.

[20] Mondalek FG,Ashley RA,Roth CC,et al.Enhanced angiogenesis of modified porcine small intestinal submucosa with hyaluronic acid-poly(lactide-co-glycolide)nanoparticles:from fabrication to preclinical validation[J].J Biomed Mater Res A,2010,94(3):712-719.

[21] Harrington DA,Sharma AK.Bladder tissue engineering through nanotechnology[J].World J Urol,2008,26(4):315-322.

[22] Baumert H,Simon P,Hekmati M,et al.Development of a seeded scaffold in the great omentum:feasibility of an in vivo bioreactor for bladder tissue engineering[J].Eur Urol,2007,52(3):884-890.

[23] Miller DC,Haberstroh KM,Webster TJ.Mechanism(s)of increased vascular cell adhesion on nanostructured poly(lacticco-glycolic acid)films[J].J Biomed Mater Res A,2005,73(4):476-484.

[24] Harrington DA,Cheng EY,Guler MO,et al.Branched peptideamphiphiles as self-assembling coatings for tissue engineering scaffolds[J].J Biomed Mater Res A,2006,78(1):157-167.