Spinophilin的表達(dá)與垂體腺瘤侵襲性的關(guān)系

陽 榮 牟 吉 周 龍 田仁富

垂體腺瘤（pituitary adenoma，PA）是常見的顱內(nèi)良性腫瘤[1]，但部分PA呈侵襲性生長，稱為侵襲性PA，可侵犯海綿竇、顱骨和頸內(nèi)動(dòng)脈等，手術(shù)治療效果較差[2]。PA侵襲性涉及多種基因及信號通路的異常，蛋白磷酸酶調(diào)節(jié)底物的磷酸化在瘤細(xì)胞增殖、侵襲過程中發(fā)揮重要作用[3，4]。Spinophilin（SPN）是從神經(jīng)元樹突棘中分離出來的，定位于染色體17q21.33 ，與蛋白磷酸酶1及F肌動(dòng)蛋白存在相互作用[5]。SPN參與突觸可塑性、細(xì)胞骨架組裝和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與阿爾茨海默癥、帕金森病和膠質(zhì)瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[6～8]。既往研究發(fā)現(xiàn)SPN與腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移有關(guān)[9]。本文探討SPN在PA中的表達(dá)及其與腫瘤侵襲性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前未接受放、化療；②組織病理學(xué)檢查證實(shí)為PA；③年齡≥18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位腫瘤；②存在急慢性感染性疾??；③合并嚴(yán)重肝腎臟疾病；④合并免疫系統(tǒng)疾病。

2018年8月至2021年6月收治符合標(biāo)準(zhǔn)的PA共98例，其中64例獲取瘤旁組織（距腺瘤組織≥2 cm）。98例中，男53例，女45例；年齡21歲～72歲，平均（49.23 ±11.29 ）歲；腫瘤直徑8～65 mm，平均（34.27 ±10.03 ）mm；混合型20例，生長激素型12例，泌乳素型24例，促腎上腺皮質(zhì)激素型9例，無功能型33例。根據(jù)Knosp分類法[10]：侵襲性46例，非侵襲性52例。

1.2 免疫組化染色檢測SPN的表達(dá)PA組織和瘤旁組織經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋、切片由本院病理科制作，厚度為1.5 μm。常規(guī)脫蠟后，進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS洗滌3次后，加入SPN抗體（1 000:1，美國Sigma公司）37℃孵育1 h，隨后溫室放置30 min。PBS洗滌兩次后加入二抗，37℃孵育20 min，洗滌2次。進(jìn)行DAB顯色（武漢卡諾斯科技有限公司），避光下觀察，3 min內(nèi)終止顯色。最后用蘇木素（上海懋康生物科技有限公司）復(fù)染1 min，脫水、封片。顯微鏡下觀察，細(xì)胞呈棕黃色為SPN陽性表達(dá)（圖1）。將陽性細(xì)胞百分比評分（陽性細(xì)胞百分比＜5%、6%～25%、26%～50%、≥51%，分別計(jì)0、1、2、3分）與染色強(qiáng)度評分（無染色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)0、1、2、3分）相乘，≤2分為陰性，≥3分為陽性[11]。

1.3 熒光定量PCR檢測SPN mRNA表達(dá)水平 用TRIzol試劑（上海源葉生物科技有限公司）提取組織總RNA。通過反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA，隨后用熒光定量試劑盒（美國Sigma公司）進(jìn)行檢測，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，用2-△△Ct法計(jì)算SPN mRNA相對表達(dá)量。引物序列：SPN上游5′-GGCGATCATACTGGGAGATG-3′，下游5′-TGTGATTCAAGTTGGGGTCA-3′；內(nèi)參GAPDH上游5′-AGCATAATACAGCAGGCACAGAC-3′，下游5′-AAAGGTTGTTCTCCACTC TCTCAC-3′。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0 軟件處理；計(jì)量資料以x±s表示，用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)；應(yīng)用多因素logistic回歸模型分析侵襲性的影響因素；用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析SPN mRNA判斷PA侵襲性的價(jià)值，計(jì)算曲線下面積（area under curve，AUC）、靈敏度和特異度；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PA組織SPN的表達(dá)水平PA組織SPN陽性表達(dá)率（21.43 %，21/98）明顯低于瘤旁組織（71.87 %，46/64；P＜0.05 ）。侵襲性PA組織SPN陽性表達(dá)率（13.04 %，6/46）明顯低于非侵襲性PA組織（28.85 %，15/52，P＜0.05 ）?；旌闲蚉A組織SPN陽性表達(dá)率為30.00 %（6/20）、生長激素型為25.00 %（3/12）、泌乳素型為20.83 %（5/24）、促腎上腺皮質(zhì)激素型為22.22 %（2/9）、無功能型為15.15 %（5/33），各種類型PA組織SPN陽性表達(dá)率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05 ）。PA組織SPN mRNA相對表達(dá)量（1.21 ±0.37 ）明顯低于瘤旁組織（2.89 ±0.75 ；P＜0.05 ）。侵襲性PA組織SPN mRNA相對表達(dá)量（0.73 ±0.16 ）明顯低于非侵襲性PA組織（1.68 ±0.80 ；P＜0.05 ）。

2.2 PA侵襲性的影響因素 單因素分析顯示，腫瘤大小、增殖水平、SPN表達(dá)水平與PA侵襲性有關(guān)（P＜0.05 ，表1）。多因素logistic回歸分析顯示，腫瘤直徑＞3 cm（OR=4.103 ；95%CI 1.351 ～10.672 ；P＜0.001 ）、Ki-67增殖指數(shù)高（OR=1.675 ；95%CI 1.271 ～3.802 ；P＜0.05 ）、SPN陰性表達(dá)（OR=2.876 ；95%CI 1.003 ～5.121 ；P＜0.001 ）是PA侵襲性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

2.3 SPN mRNA預(yù)測PA侵襲性的價(jià)值ROC曲線分析顯示，SPN mRNA預(yù)測PA侵襲性的AUC為0.830 （95%CI 0.813 ～0.916 ；P＜0.001 ），診斷臨界值為0.84 ，靈敏度和特異度分別為95.23 %和83.12 %，見圖2。

圖1 免疫組化染色檢測組織SPN表達(dá)（×200）

表1 本文98例垂體腺瘤侵襲性危險(xiǎn)因素的單因素分析

圖2 ROC曲線分析SPN mRNA預(yù)測垂體腺瘤侵襲性的效果

3 討論

PA屬于良性腫瘤，部分PA具有侵襲性。PA侵襲性受多種因素影響。本文發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑和Ki-67增殖指數(shù)是PA侵襲性密切相關(guān)。這與既往報(bào)道一致[11，12]。本文還發(fā)發(fā)現(xiàn)，SPN低水平表達(dá)與PA侵襲性有關(guān)。SPN是黏度信號蛋白，在人體多種組織中均有表達(dá)，特別是在腦組織（腦皮質(zhì)、海馬和尾殼核）中表達(dá)豐富[13]。SPN可以與磷酸酶PP1結(jié)合，又被稱為PPP1R9B，可能參與腫瘤進(jìn)展[14]。研究發(fā)現(xiàn)SPN在肺腺癌細(xì)胞中低表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移密切相關(guān)[15]。SPN不僅與PP1結(jié)合，在腦組織中還與黏附分子、細(xì)胞骨架蛋白等多種蛋白相互作用，參與突觸可塑性、細(xì)胞骨架組裝和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，與阿爾茨海默癥、帕金森病和膠質(zhì)瘤等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[6，7，13]。研究發(fā)現(xiàn)SPN可以調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的侵襲性，下調(diào)SPN可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲性，并且促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解[16]。本文發(fā)現(xiàn)，PA組織SPN表達(dá)水平明顯低于瘤旁組織，表明SPN可能在PA中發(fā)揮抑癌基因的作用。本文還發(fā)現(xiàn)侵襲性PA組織SPN陽性表達(dá)率明顯低于非侵襲性PA組織；并且侵襲性PA組織SPN mRNA相對表達(dá)量明顯低于非侵襲性PA組織；多因素logistic回歸分析顯示，SPN陰性表達(dá)是PA侵襲性的獨(dú)立危險(xiǎn)因素；ROC曲線分析顯示SPN mRNA水平預(yù)測PA侵襲性的AUC為0.830 ，診斷臨界值為0.84 ，靈敏度和特異度分別為95.23 %和83.12 %。這提示SPN mRNN水平判斷PA侵襲性具有較高的價(jià)值。

總之，PA組織SPN呈低表達(dá)，檢測SPN表達(dá)水平對PA侵襲性有一定評估作用。