PGC-1α/Nrf1介導(dǎo)的線粒體生物合成通路在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老中的作用機(jī)制

【摘要】目的 探究PGC-1α/Nrf1介導(dǎo)的線粒體生物合成通路在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老中的作用及可能機(jī)制。方法 培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為對(duì)照組、衰老組、PGC-1α激活組，Western blotting檢測(cè)心肌細(xì)胞中p21、p53、PGC-1α、Nrf1的蛋白水平，RT-qPCR檢測(cè)心肌細(xì)胞中p21、p53、PGC-1α、Nrf1的mRNA水平，免疫熒光染色檢測(cè)p53與PGC-1α共表達(dá)水平，試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）、丙二醛（MDA）、活性氧（ROS）及腺苷三磷酸（ATP）水平，線粒體膜電位（ΔΨm）檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ΔΨm。結(jié)果 與對(duì)照組相比，衰老組心肌細(xì)胞中衰老標(biāo)志蛋白p21、p53蛋白及mRNA水平增加，線粒體生物合成通路蛋白PGC-1α、Nrf1蛋白及mRNA水平減少；與衰老組相比，PGC-1α激活組p21、p53蛋白及mRNA水平減少，PGC-1α、Nrf1蛋白及mRNA水平增加（P均<0.05）。與對(duì)照組相比，衰老組心肌細(xì)胞SOD、GSH含量減少，MDA、ROS含量增加，細(xì)胞ΔΨm下降，ATP含量減少；與衰老組相比，PGC-1α激活組SOD、GSH含量增加，MDA、ROS含量減少，ΔΨm增加，ATP含量增加（P均<0.05）。結(jié)論 PGC-1α/Nrf1介導(dǎo)的線粒體生物合成通路在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要作用，激活PGC-1α/Nrf1通路可通過改善氧化應(yīng)激水平改善心肌細(xì)胞的衰老。

【關(guān)鍵詞】心肌細(xì)胞；衰老；p21；p53；PGC-1α/Nrf1通路；線粒體

【DOI】10.16806/j.cnki.issn.1004-3934.2024.10.017

The Role of PGC-1α/Nrf1 Mediated Mitochondrial Biosynthesis Pathway in H2O2-Induced Cardiomyocyte Senescence

TIAN Wei，RAO Xiaojiao，GAO Meng，XIAO Shu’na

（Cardiovascular Center，Liyuan Hospital， Tongji Medical College， Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430000，Hubei，China）

【Abstract】Objective To investigate the role of PGC-1α/Nrf1 mediated mitochondrial biosynthesis pathway in H2O2-induced cardiomyocyte senescence and its possible mechanism.Methods H9c2 cardiomyocytes were cultured and divided into control group，senescence group and PGC-1α activated group according to the experimental design.Western blotting detected the protein levels of p21，p53，PGC-1α and Nrf1 in the cardiomyocytes.The mRNA levels of p21，p53，PGC-1α and Nrf1 in cardiomyocytes were detected by RT-qPCR，co-expression levels of p53 and PGC-1α were detected by immunofluorescence staining，superoxide dismutase （SOD），glutathione （GSH），malondialdehyde （MDA），reactive oxygen species （ROS） and adenosine triphosphate （ATP） levels in cardiomyocytes were detected by kits.Mitochondrial membrane potential （ΔΨm） test kit was used to detect ΔΨm.Results Compared with the control group，the levels of senescence marker proteins p21 and p53 protein and mRNA in senescence group were increased，mitochondrial biosynthesis pathway proteins PGC-1α，Nrf1 protein and mRNA levels decreased.Compared with senescence group，the levels of p21 and p53 protein and mRNA in PGC-1α activated group were decreased，PGC-1α，Nrf1 protein and mRNA levels increased（All P<0.05）.Compared with control group，SOD and GSH contents of cardiomyocytes in senescent group decreased，MDA and ROS contents increased，cell ΔΨm decreased，ATP content decreased.Compared with senescence group，the contents of SOD and GSH in PGC-1α activated group were increased，MDA and ROS contents decreased，ΔΨm increased，ATP content increased（All P<0.05）.Conclusion PGC-1α/Nrf1 mediated mitochondrial biosynthesis pathway plays an important role in H2O2-induced cardiomyocyte senescence，activation of PGC-1α/Nrf1 pathway can improve the senescence of cardiomyocytes by improving the level of oxidative stress.

【Keywords】Cardiac muscle cell；Senescence；p21；p53；PGC-1α/Nrf1 pathway；Mitochondrion

心臟衰老是心臟儲(chǔ)備功能下降的一種情況，其中，心肌細(xì)胞衰老參與心血管疾病的病理機(jī)制［1］。心血管疾病是影響人類生活的主要危險(xiǎn)因素，也是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一。由于缺乏有效的治療靶點(diǎn)逆轉(zhuǎn)病理性心臟損傷，所以改善衰老心臟的功能至今仍是一大難題［2］。因此，充分了解心臟衰老機(jī)制至關(guān)重要。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1α，PGC-1α）是線粒體生物發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子，也是調(diào)節(jié)抗氧化的核心蛋白［3］。Li等［4］研究表明，核轉(zhuǎn)錄因子紅系2相關(guān)因子1（nuclear factor-erythroid 2-related factor 1，Nrf1）可與PGC-1α協(xié)同轉(zhuǎn)錄促進(jìn)線粒體生物合成發(fā)生，并參與感染導(dǎo)致的心臟損傷過程。p21與p53是重要的衰老相關(guān)蛋白，在心肌細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要作用［5-6］。Wang等［7］研究顯示激活SIRT1/PGC-1α通路可降低活性氧（reactive oxygen species，ROS），改善心肌細(xì)胞衰老。然而，關(guān)于PGC-1α介導(dǎo)的線粒體生物合成通路在衰老心肌細(xì)胞中與p21、p53之間的可能聯(lián)系機(jī)制尚未完全闡明。此外，越來越多研究［8］表明，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷在心肌細(xì)胞衰老中占據(jù)重要地位。本研究通過使用H2O2建立心肌細(xì)胞衰老模型，探究PGC-1α/Nrf1通路與衰老標(biāo)志蛋白p21、p53之間的可能聯(lián)系，為治療心臟衰老提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

p21抗體、p53抗體（美國(guó)sigma公司），PGC-1α抗體、Nrf1抗體（美國(guó)abcam公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位

（mitochondrial membrane potential，ΔΨm）檢測(cè)試劑盒（JC-1，賽默飛世爾科技公司），丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）檢測(cè)試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）檢測(cè)試劑盒（索萊寶生物科技有限公司），PGC-1α激活劑ZLN005（美國(guó)MCE公司），熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative polymerase chain reaction，qPCR）儀（加拿大Funglyn Biotech），全自動(dòng)酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組與衰老細(xì)胞模型的建立

培養(yǎng)大鼠H9c2心肌細(xì)胞（武漢普諾賽生命科技有限公司），根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分為：對(duì)照組、衰老組、PGC-1α激活組。對(duì)照組細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)，衰老組、PGC-1α激活組心肌細(xì)胞加入H2O2（100 μmol/L）培養(yǎng)4 h，PGC-1α激活組在加入H2O2之前2 h加入PGC-1α激活劑ZLN005 20 μmol/L。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)心肌細(xì)胞中p21、p53、PGC-1α、Nrf1的mRNA水平

提取大鼠心肌細(xì)胞中總RNA量，逆轉(zhuǎn)錄p21、p53、PGC-1α、Nrf1的RNA為互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA）。擴(kuò)增p21、p53、PGC-1α、Nrf1的cDNA，內(nèi)參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），引物序列見表1。

1.4 Western blotting 檢測(cè)心肌細(xì)胞中p21、p53、PGC-1α、Nrf1的蛋白表達(dá)

收集各組大鼠心肌細(xì)胞，加入合適的裂解液提取總蛋白，檢測(cè)各組蛋白濃度，配置成一定體系后將蛋白高溫變性。配置合適濃度的凝膠，向凝膠孔道中加入相同體積的樣品進(jìn)行電泳，將電泳結(jié)束的凝膠與聚偏二氟乙烯膜按照一定順序置于轉(zhuǎn)膜夾中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜后浸入快速封閉液中封閉，磷酸鹽吐溫緩沖液清洗后，分別孵育p21、p53、PGC-1α、Nrf1一抗，再孵育對(duì)應(yīng)的二抗，磷酸鹽吐溫緩沖液清洗后使用發(fā)光液曝光，最后將結(jié)果保存后統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 試劑盒檢測(cè)心肌細(xì)胞中SOD、GSH、MDA、ROS及ATP水平

收集各組大鼠心肌細(xì)胞，分別按照SOD活性檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒、GSH檢測(cè)試劑盒、ROS檢測(cè)試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒說明書中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，最后根據(jù)提供的公式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 免疫熒光染色檢測(cè)心肌細(xì)胞中p53、PGC-1α蛋白表達(dá)

待心肌細(xì)胞長(zhǎng)滿后制備成細(xì)胞懸液，稀釋后加入6孔板，待孔板中細(xì)胞長(zhǎng)滿后使用磷酸鹽緩沖溶液清洗3次，使用多聚甲醛固定25 min，0.5％TritonX-100打孔5 min，封閉液封閉30 min，加入稀釋好的抗體，置于4 ℃冰箱過夜。第二天使用磷酸鹽緩沖溶液清洗后加入稀釋好的二抗（避光），最后加入含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的封片劑，8 min后，在熒光顯微鏡下觀察分析。

1.7 ΔΨm檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ΔΨm

將各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)在12孔板中，待長(zhǎng)至80%時(shí)進(jìn)行干預(yù)，按照ΔΨm檢測(cè)試劑盒說明書中的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作，最后在熒光顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 激活PGC-1α對(duì)衰老心肌細(xì)胞衰老標(biāo)志蛋白p21、p53表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，衰老組心肌細(xì)胞中衰老標(biāo)志蛋白p21、p53蛋白水平增加（P<0.05）；與衰老組相比，PGC-1α激活組p21、p53蛋白水平減少（圖1A和1B，P<0.05）。與對(duì)照組相比，衰老組心肌細(xì)胞中p21、p53 mRNA水平增加（P<0.05）；與衰老組相比，PGC-1α激活組p21、p53 mRNA水平減少（圖1C，P<0.05）。

2.2 激活PGC-1α對(duì)衰老心肌細(xì)胞線粒體生物合成通路蛋白PGC-1α、Nrf1表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，衰老組心肌細(xì)胞中線粒體生物合成通路蛋白PGC-1α、Nrf1蛋白水平減少（P<0.05）；與衰老組相比，PGC-1α激活組PGC-1α、Nrf1蛋白水平增加（圖2A和2B，P<0.05）。與對(duì)照組相比，衰老組心肌細(xì)胞中PGC-1α、Nrf1 mRNA水平減少（P<0.05）；與衰老組相比，PGC-1α激活組PGC-1α、Nrf1 mRNA水平增加（圖2C，P<0.05）。

2.3 激活PGC-1α對(duì)衰老心肌細(xì)胞p53及PGC-1α共表達(dá)水平的影響

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，衰老組心肌細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)增加的同時(shí)，PGC-1α蛋白表達(dá)減少（P<0.05）；與衰老組相比，PGC-1α激活組心肌細(xì)胞中p53蛋白表達(dá)減少的同時(shí)，PGC-1α蛋白表達(dá)增加（圖3A和3B，P<0.05）。

2.4 激活PGC-1α對(duì)衰老心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的影響

與對(duì)照組相比，衰老組心肌細(xì)胞SOD、GSH含量減少（P<0.05），MDA、ROS含量增加（P<0.05）；與衰老組相比，PGC-1α激活組SOD、GSH含量增加（圖4A和4B，P<0.05），MDA、ROS含量減少（圖4C和4D，P<0.05）。

2.5 激活PGC-1α對(duì)衰老心肌細(xì)胞ΔΨm及ATP的影響

與對(duì)照組相比，衰老組心肌細(xì)胞ΔΨm下降（P<0.05），ATP含量減少（P<0.05）；與衰老組相比，PGC-1α激活組ΔΨm增加（P<0.05），ATP含量增加（圖5A～5C，P<0.05）。

3 討論

衰老是心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一。最近的研究［9］表明，心臟衰老的發(fā)病機(jī)制與心血管疾病直接相關(guān)，如心力衰竭。心血管疾?。ㄈ缧牧λソ撸┗颊叩纳钯|(zhì)量較低，死亡率較高［10］。由于心肌細(xì)胞的不可再生性，絕大多數(shù)與衰老相關(guān)的心血管疾病患者無法避免疾病復(fù)發(fā)［11］。因此，進(jìn)一步研究心肌細(xì)胞衰老的機(jī)制和抑制心肌細(xì)胞衰老發(fā)展的策略將有利于提高患者的生活質(zhì)量。近年來，大量研究［8］表明，氧化應(yīng)激是心肌細(xì)胞衰老損傷的一種主要途徑。因此，抑制心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)對(duì)預(yù)防衰老誘發(fā)的心血管疾病至關(guān)重要。本研究利用H2O2構(gòu)建心肌細(xì)胞衰老模型，結(jié)果顯示，與正常心肌細(xì)胞相比，衰老組的心肌細(xì)胞中MDA、ROS含量增加，GSH、SOD含量減少，即衰老心肌細(xì)胞的氧化能力增強(qiáng)，抗氧化能力降低，衰老相關(guān)蛋白p53、p21表達(dá)顯著增加。

PGC-1α/Nrf1通路可調(diào)控線粒體的生物合成過程改善心肌細(xì)胞肥大［12］。Yeo等［13］研究表明，高表達(dá)PGC-1α可改善老年骨骼肌中線粒體缺陷。沉默信息調(diào)控因子1是細(xì)胞能量的代謝傳感器，對(duì)能量代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、衰老起重要作用，沉默信息調(diào)控因子1可去乙?；疨GC-1α參與線粒體生物合成［14］。此外，研究［7］顯示，亞精胺可通過激活PGC-1α/Nrf2通路延緩心臟衰老。Lee等［15］研究表明，激活PGC-1α/Nrf2信號(hào)通路可通過抗氧化作用緩解H2O2及紫外線引起的皮膚衰老。這提示，PGC-1α/Nrf2通路介導(dǎo)的線粒體生物合成在心肌細(xì)胞衰老中發(fā)揮重要作用。既往研究［5］顯示，p21與p53的激活可促進(jìn)心肌細(xì)胞衰老。然而，目前關(guān)于PGC-1α介導(dǎo)的線粒體生物合成通路在衰老心肌細(xì)胞中與p21、p53之間可能的聯(lián)系機(jī)制尚未完全闡明。本研究結(jié)果顯示，衰老心肌細(xì)胞中PGC-1α/Nrf1通路蛋白表達(dá)下降，ΔΨm下降，ATP水平降低，衰老相關(guān)蛋白p21、p53表達(dá)增加，激活PGC-1α后PGC-1α/Nrf1通路蛋白表達(dá)、ΔΨm、ATP水平、抗氧化因子SOD和GSH水平增加，氧化因子ROS、MDA水平減少，衰老相關(guān)蛋白p21、p53表達(dá)減少。

綜上所述，本研究初步闡明PGC-1α/Nrf1介導(dǎo)的線粒體生物合成通路在H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞衰老中發(fā)揮著重要作用，激活該通路可下調(diào)氧化應(yīng)激水平及衰老相關(guān)蛋白的表達(dá)，這將為治療心肌細(xì)胞衰老提供新的理論依據(jù)。然而，關(guān)于PGC-1α/Nrf1通路與衰老相關(guān)蛋白p21、p53之間深入的分子機(jī)制仍有待繼續(xù)挖掘。

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基金項(xiàng)目：湖北省衛(wèi)生健康委員會(huì)科研項(xiàng)目（20220108）

通信作者：肖書娜，E-mail：qingqing200199@163.com