人間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記分子的研究進(jìn)展

李秋晨 綜述 肖苒 審校

干細(xì)胞根據(jù)所處的發(fā)育階段可分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞（MSC）是成體干細(xì)胞家族的重要成員，是一類(lèi)中胚層來(lái)源的具有高度自我更新能力和多向分化潛能的干細(xì)胞，主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。MSC因具有造血支持、免疫調(diào)控以及獲取容易等特點(diǎn)日益受到人們的關(guān)注。在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，MSC可分化為多種組織細(xì)胞，因此可作為理想的種子細(xì)胞參與組織器官的修復(fù)過(guò)程。但由于不同的分離方法得到的MSC的純度不同，極大地影響了療效的穩(wěn)定性[1]。因此，對(duì)MSC表面標(biāo)記分子進(jìn)行鑒定、分選，已成為干細(xì)胞領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記分子的分類(lèi)與功能

MSC表面標(biāo)記分子包括相對(duì)特異性抗原、細(xì)胞因子及受體、生長(zhǎng)因子及受體、黏附分子和細(xì)胞外基質(zhì)等。在MSC的鑒定、分選過(guò)程中，黏附分子起著至關(guān)重要的作用，是介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱(chēng)。根據(jù)黏附分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，可以分為整合素家族、選凝素家族、免疫球蛋白超家族、鈣黏蛋白家族等，此外還有一些尚未歸類(lèi)的黏附分子[2]。黏附分子種類(lèi)繁多，各自的功能、與干細(xì)胞的相關(guān)性等，都需要更深入的探討。

1.1 免疫球蛋白超家族

免疫球蛋白超家族由一組結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)組成，這組蛋白質(zhì)具有與免疫球蛋白Ig同源的V區(qū)和C區(qū)。

CD90（又稱(chēng)Thy-1）與細(xì)胞的黏附、分化、細(xì)胞間相互作用有關(guān)。它是人類(lèi)微血管內(nèi)皮細(xì)胞活化的標(biāo)記，與新生血管的形成有關(guān)[3]；也是鑒別人類(lèi)MSC的重要標(biāo)記之一[4]。

CD106（VCAM-1）又稱(chēng)可誘導(dǎo)細(xì)胞黏附分子，可由IL-1、TNF等細(xì)胞因子與細(xì)胞作用后表達(dá)。它在活化內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞表面表達(dá)；其表達(dá)與MSC的干性維持有關(guān)[5]。

CD146（MCAM，Mel-CAM）是一種鈣離子非依賴(lài)型細(xì)胞黏附分子。因最早發(fā)現(xiàn)其特異表達(dá)于黑色素瘤細(xì)胞，并與原位黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移潛能直接相關(guān)，故而又命名為黑色素瘤黏附分子（Mel-CAM）[6]。亦有研究表明，它在人血管內(nèi)皮細(xì)胞上組成性表達(dá)，是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記，可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管的新生。

CD166（ALCAM）又稱(chēng)為白細(xì)胞活化黏附因子，主要在白細(xì)胞和胸腺上皮細(xì)胞表達(dá)。它可以參與胚胎造血系統(tǒng)的發(fā)育和毛細(xì)血管的形成，并在維持MSC多向分化潛能方面起著至關(guān)重要的作用[7]。

CD56（NCAM）是神經(jīng)細(xì)胞黏附分子的異構(gòu)體和自然殺傷淋巴細(xì)胞（NK）的標(biāo)記分子。它在神經(jīng)系統(tǒng)的生長(zhǎng)、發(fā)育過(guò)程中起著“導(dǎo)航”和“停泊”作用[8]；更為重要的是，它可以調(diào)節(jié)MSC向三個(gè)胚層的分化[9]。

1.2 整合素家族

整合素是一組細(xì)胞表面跨膜受體，由α鏈和β鏈以共價(jià)鍵形成異構(gòu)二聚體，在識(shí)別細(xì)胞外基質(zhì)成分中起著重要作用。

CD29是β1類(lèi)整合素，為多種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的受體。它的表達(dá)與MSC的遷移有關(guān)。

CD49d也為β1類(lèi)整合素，主要在肥大細(xì)胞等組織細(xì)胞以及靜息狀態(tài)下的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞表面表達(dá)，它可以介導(dǎo)造血干細(xì)胞與骨髓的黏附，參與造血干細(xì)胞的重新分布與歸巢[10-11]。

1.3 其它家族分子

CD105又稱(chēng)內(nèi)皮素，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β超家族的成員[15]，在內(nèi)皮細(xì)胞顯著表達(dá)，它的許多功能與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）所涉及的信號(hào)通路有關(guān)[12]。CD105在血管發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用，它可以維持血管的完整性[13]。

CD271是低親和力的神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體，屬于腫瘤壞死因子受體超家族。在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）、濾泡樹(shù)突狀細(xì)胞、黑色素瘤細(xì)胞等非神經(jīng)細(xì)胞表面表達(dá)[14]。它在BMSC的分離純化中起著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，CD105、CD271以及免疫球蛋白超家族的CD146在維持MSC良好的貼壁能力以及特有的形態(tài)方面起著重要的作用[15]。

CD73又稱(chēng)為胞外-5-核苷酸酶，是糖基磷脂酰肌醇（GPI）錨定于細(xì)胞膜外表面的一種糖蛋白。其分布廣，功能多，不僅可參與嘌呤核苷酸的補(bǔ)救合成途徑，還可作為一種重要的免疫信號(hào)分子，參與跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞的黏附[16]。CD73在間充質(zhì)干細(xì)胞表面的穩(wěn)定表達(dá)是鑒別MSC重要的表面標(biāo)記之一。

神經(jīng)節(jié)苷脂（GD2）是一類(lèi)細(xì)胞膜上的糖鞘脂類(lèi)化合物，其伸展于細(xì)胞膜表面的糖基具有免疫原性，能夠誘發(fā)免疫反應(yīng)。

胚胎階段特異性抗原（SSEA3和SSEA4）是與細(xì)胞表面葡萄糖糖脂相關(guān)的抗原決定簇，是P血型系統(tǒng)家族成員，在絕大多數(shù)人紅細(xì)胞表面表達(dá)。SSEA和GD2大都在MSC的前體細(xì)胞群中表達(dá)[17-18]。

2 與間充質(zhì)干細(xì)胞分離純化相關(guān)的表面陰性標(biāo)記分子

一些CD分子在MSC表面陰性表達(dá)，而在造血干細(xì)胞或外周血其它細(xì)胞表面特異性表達(dá)，因此可以利用這些分子的陽(yáng)性表達(dá)去除其它干擾細(xì)胞，對(duì)MSC進(jìn)行分離純化。

CD34分子屬于鈣黏蛋白家族，為鈣離子依賴(lài)型黏附分子，主要參與介導(dǎo)特定組織或器官的同型細(xì)胞間的黏附，其結(jié)構(gòu)包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞漿區(qū)3部分[19]。CD34選擇性地表達(dá)于人類(lèi)及其他哺乳動(dòng)物造血干細(xì)胞表面，并隨細(xì)胞的成熟，表達(dá)逐漸減弱甚至消失。CD34是造血干細(xì)胞特異性的標(biāo)記物，一直被用作篩選造血干細(xì)胞（HSC）[20]，可通過(guò)該標(biāo)記分子，排除造血干細(xì)胞及其他內(nèi)皮祖細(xì)胞，從而對(duì)MSC進(jìn)行純化。但近來(lái)發(fā)現(xiàn)，ADSC可以高表達(dá)CD34，這與前期研究相矛盾。

CD45又稱(chēng)白細(xì)胞共同抗原，由兩條相同肽鏈構(gòu)成同源二聚體，可表達(dá)于成熟紅細(xì)胞、血小板表面。由于它在造血干細(xì)胞表面高表達(dá)，所以CD45和CD34常被用作篩選造血干細(xì)胞[21]。

CD11a為淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原(LFA-1)的A鏈，幾乎存在于所有外周血白細(xì)胞中，可表達(dá)于骨髓造血細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞表面[22]。

CD19表達(dá)于人體外周血各個(gè)階段B細(xì)胞表面，包括未成熟B細(xì)胞、初始B細(xì)胞、記憶性 B細(xì)胞表面，可以用來(lái)標(biāo)定所有正常的外周血B細(xì)胞[23]。

CD14主要在單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表面表達(dá)，其它細(xì)胞系統(tǒng)包括紅細(xì)胞、造血干細(xì)胞以及非造血系統(tǒng)細(xì)胞上不表達(dá)，在正常粒細(xì)胞表面僅微弱表達(dá)[24]。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記分子的表達(dá)與分離純化

2005年，細(xì)胞治療國(guó)際組織推薦了可判定人類(lèi)多能MSCs的最低標(biāo)準(zhǔn)：①能在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下貼壁生長(zhǎng)；②CD105、CD73和CD90表達(dá)陽(yáng)性，造血干細(xì)胞的表面標(biāo)記CD34、CD45、CD11a、CD19或CD79a、CD14或CD11b和HLA-DR表達(dá)陰性；③特殊培養(yǎng)條件下，體外能分化為成骨細(xì)胞、成脂細(xì)胞和成軟骨細(xì)胞[25]。因此，利用表面標(biāo)記分子對(duì)MSC進(jìn)行分離純化尤為重要。

3.1 不同組織來(lái)源MSC表面標(biāo)記分子的表達(dá)與分離純化

不同組織來(lái)源的MSC有其特異性的表面抗原表達(dá)，脂肪組織來(lái)源的MSC可高表達(dá)CD34，胎盤(pán)來(lái)源的MSC可表達(dá)SSEA-3、SSEA-4[26]，骨髓來(lái)源的 MSC可高表達(dá) CD271和組織非特異性的堿性磷酸酶（TNAP）[27-29]。亦有研究指出，骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞CD106陽(yáng)性表達(dá)，而脂肪來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞CD106表達(dá)量極低甚至不表達(dá)[30]。因此，對(duì)于不同組織來(lái)源的MSC進(jìn)行分離純化需要選擇特異的標(biāo)記分子[31]。

3.2 CD73、CD105和CD271可分離純化骨髓來(lái)源的MSC

MSC表面特異性高表達(dá)CD73和CD105，這兩種分子的陽(yáng)性表達(dá)提示這些細(xì)胞非造血干細(xì)胞來(lái)源。由于骨髓中大部分細(xì)胞是造血干細(xì)胞，用這兩種分子標(biāo)記物對(duì)骨髓中的MSC進(jìn)行分離純化，可以得到較高純度的MSC。但近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)這些分子標(biāo)記物可以在體內(nèi)多種組織細(xì)胞中表達(dá)，例如在來(lái)源于皮膚的成纖維細(xì)胞中可以檢測(cè)到這兩種標(biāo)記物[32-33]。因此，用CD73和CD105分離純化結(jié)締組織中的MSC是行不通的。此外，有報(bào)道從骨髓組織中分離得到的CD271+的BMSC克隆樣集落的形成能力明顯高于CD271-的細(xì)胞[26-27]，Giemsa染色顯示CD271+的BMSC有深染的胞核和豐富的胞漿，而CD271-的細(xì)胞的形態(tài)表型卻類(lèi)似于淋巴細(xì)胞，從形態(tài)學(xué)上可以容易地區(qū)分兩種細(xì)胞[34]。因此，CD73、CD105、CD271可用來(lái)分離純化骨髓來(lái)源的MSC。

3.3 CD56可以分離向軟骨細(xì)胞方向分化的MSC

研究顯示，CD271+、SSEA-3+、CD56-的 MSC 可向成脂、成骨方向分化，但不能分化為軟骨細(xì)胞。相反，CD271+、SSEA-3+、CD56+的細(xì)胞則可以向軟骨細(xì)胞方向分化。因此，CD56是分離向軟骨細(xì)胞方向分化的MSC的表面標(biāo)記之一[35]。

4 間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記分子的穩(wěn)定性

MSC表面標(biāo)記分子并不總是穩(wěn)定地表達(dá)，MSC所處的微環(huán)境不同，它們的表面標(biāo)記分子也不同。在體外培養(yǎng)或是將其進(jìn)行誘導(dǎo)過(guò)程中，MSC表面標(biāo)記分子會(huì)發(fā)生明顯的變化[36]。例如，CD56、CD109、CD166、CD271 可以在骨髓來(lái)源的 MSC表面表達(dá)，但是隨著MSC在體外的擴(kuò)增培養(yǎng)，表達(dá)水平卻迅速下調(diào)[27]。相反，CD318在MSC表面并不表達(dá)，但是隨著體外培養(yǎng)的進(jìn)行，它的表達(dá)量卻逐漸增加[37]。而在STRO-1+或CD56+的MSC表面不表達(dá)的組織特異性堿性磷酸酶（TNAP），在成骨誘導(dǎo)分化過(guò)程中的表達(dá)卻逐步上調(diào)[38]。

隨著免疫學(xué)研究的進(jìn)展，將發(fā)現(xiàn)更多MSC表面特異表達(dá)的標(biāo)記分子。根據(jù)實(shí)驗(yàn)及臨床研究的需求，對(duì)MSC進(jìn)行表型鑒定及分化能力的檢測(cè)，從而分選出純度更高的干細(xì)胞群是未來(lái)研究的熱點(diǎn)。鑒于MSC廣闊的應(yīng)用前景，相信在不久的將來(lái)，經(jīng)過(guò)分離純化的MSC在修復(fù)組織缺損等過(guò)程中將扮演重要的角色。

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