依達(dá)拉奉對血管性癡呆大鼠模型學(xué)習(xí)記憶能力的影響

周廣安 孟光源

(泰山醫(yī)學(xué)院附屬泰山醫(yī)院，山東 泰安 271000)

血管性癡呆(Vascular dementia，VaD)是各種腦血管因素引起的一種認(rèn)知功能缺損綜合征。臨床癥狀主要表現(xiàn)為以下至少三項精神活動受損:語言、記憶、視空間技能、情感、人格和認(rèn)知功能，病理改變以腦血管病引起的海馬等重要部位神經(jīng)元的缺血缺氧損為主。海馬是與學(xué)習(xí)記憶功能有關(guān)的主要腦功能區(qū)，易被缺血損傷。研究認(rèn)為慢性腦缺血可引起海馬的細(xì)胞凋亡、變性、萎縮，損傷后常常引起學(xué)習(xí)、記憶功能障礙的出現(xiàn)，為血管性癡呆的病理基礎(chǔ)[1]。

血管性癡呆是多種因素參與的復(fù)雜病理過程，而氧自由基引起的組織脂質(zhì)過氧化損傷是其發(fā)病重要因素之一。依達(dá)拉奉是一種自由基清除劑，通過清除羥自由基，抑制過氧化脂質(zhì)的生成，從而抑制腦細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞的氧化損傷,是一種有效的腦神經(jīng)保護(hù)劑,血腦屏障的通透率為60%[2]。

為了達(dá)到研究其病因機(jī)制的目的，建立一種理想的接近于臨床VaD發(fā)病過程的動模型顯得尤為重要。VD建模的方法有許多種，本實驗選用易于操作的兩血管法建模。研究血管性癡呆大鼠行為及海馬組織學(xué)變化，以及依達(dá)拉奉對其影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 健康雄性3個月齡Wistar大鼠30只，體重250±10 g，清潔級，購于山東中醫(yī)藥大學(xué)。

1.1.2藥品及試劑 10%水合氯醛、0.9%氯化鈉、4%多聚甲醛、10%中性福爾馬林。

1.1.3儀器 Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、分析天平(JA2003)(上海精科)、眼科用手術(shù)剪(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠)、眼科用手術(shù)鑷(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠)、石蠟切片機(jī)(德國LE工CARMZ135)、生物組織石蠟包埋機(jī)(JBM一A型)(湖北亞光醫(yī)用電子儀器廠)、自制微創(chuàng)血管夾(湖南醫(yī)用器械廠)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(Jc303)(上海成順儀器儀表有限公司)、光學(xué)顯微鏡(德國OLYMPSBX60)。

1.2 實驗方法

1.2.1實驗動物分組 30只雄性Wistar大鼠室溫喂養(yǎng)，隨機(jī)分為：假手術(shù)組、模型組、依達(dá)拉奉治療組，每組各10只。

1.2.2實驗?zāi)Ｐ徒?/p>

采用雙頸總動脈永久結(jié)扎方法。適應(yīng)性喂養(yǎng)兩周后，使大鼠術(shù)前12 h禁食，4 h禁水。三組大鼠均用10%的水合氯醛(按3.5 mg/kg給予)腹腔內(nèi)注射麻醉(為防止針頭刺破腹腔臟器，麻醉時使大鼠的位置處于腹部向上，頭稍微向下傾斜的頭低位。注射時針頭在右下腹迅速刺入皮下，沿皮下前進(jìn)大約0.5 cm后再以45°角緩慢刺入腹腔，回抽如無空氣可緩慢注入)。麻醉成功后(以反正反應(yīng)消失為判定方法)，將大鼠頭仰臥固定在鼠板上，用剪刀剪去頸部皮毛，潔爾碘液進(jìn)行消毒。待消毒液干燥后，沿頸部正中縱向切開皮膚，以能充分暴露視野為準(zhǔn)。然后鈍性分離開皮下筋膜及肌肉組織至雙側(cè)頸總動脈，分離暴露出雙側(cè)頸總動脈。模型組與丁苯酞組每側(cè)頸總動脈用0號手術(shù)絲線進(jìn)行雙結(jié)扎，然后在兩絲線中間剪斷，縫合手術(shù)切口。術(shù)后放入有暖燈的箱子中保暖，待蘇醒后放回清潔籠箱繼續(xù)飼養(yǎng)，并給予手術(shù)局部皮膚適量青霉素粉劑涂抹3日。假手術(shù)組中的除頸總動脈不結(jié)扎外，亦按上述手術(shù)過程進(jìn)行操作。

1.3 學(xué)習(xí)記憶力測試

采用Morris水迷宮法。水迷宮大小為直徑150 cm，高50 cm，水深30 cm的圓形水池，池等分為4個象限，平臺設(shè)于第三象限正中，直徑11 cm、高29 cm，水平面高處平臺1.5 cm，水溫保持在(26±1)℃。水迷宮實驗于造模第4 d開始進(jìn)行，測試程序為定位航行試驗(Place navigation):歷時4 d，每日2次，將大鼠面向池壁分別從4個入水點(diǎn)放入水中，設(shè)定最游泳時間為120 s，記錄在2 min內(nèi)尋找到并爬上平臺的時間即逃避潛伏期(escape latency)。若果大鼠在2 min內(nèi)未能登上平臺，則由實驗者牽引其至平臺上，讓大鼠停留5 s，再放回籠中，潛伏期記為最高分120 s，第5天撤除平臺，記錄2 min內(nèi)大鼠的游經(jīng)平臺的次數(shù)，進(jìn)統(tǒng)計分析，以上數(shù)據(jù)的采集和處理均由Morris迷宮圖像自動監(jiān)視處理系統(tǒng)完成。

1.4 標(biāo)本采集

造模1周，Morris水迷宮實驗結(jié)束后，大鼠進(jìn)行標(biāo)本采集，用10%的水合氯醛(3 ml/kg)麻醉，仰臥固定，剪開胸壁暴露心臟，在心尖處插入灌洗針，并同時剪開右心耳，快速入生理鹽水沖洗脈管系統(tǒng)，然后用4℃的4%多聚甲醛溶液100～200 ml灌注固定注畢取腦，取腦后固定24 h，后剝?nèi)『ｑR組織，并用石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅染色，封片，在光鏡下觀察海馬組織形態(tài)。

1.6 統(tǒng)計分析

統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。1～4天水迷宮實驗結(jié)果采用重復(fù)測量方差分析，第5天實驗數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，P<0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 動物一般情況觀察

模型組:大鼠大多數(shù)表現(xiàn)為反應(yīng)遲鈍、不干凈、進(jìn)食減少、少動、動作遲緩;個別大鼠出現(xiàn)自發(fā)運(yùn)動增多及自我及相互嘶咬等癥狀。治療組與假手術(shù)組無明顯變化。

2.2 各組大鼠Morris水迷宮行為學(xué)觀察

進(jìn)行Morris水迷宮測試結(jié)果顯示第1、2、3、4天，模型組逃避潛伏期明顯大于假手術(shù)組，依達(dá)拉奉治療組逃避潛伏期小于模型組，均具有顯著差異，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)。治療組與假手術(shù)組逃避潛伏期比較無顯著差異(P>0.05)。第5天穿越平臺次數(shù)，模型組少于治療組與假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。治療組與假手術(shù)組穿越平臺次數(shù)比較無顯著差異(P>0.05)。見表1。

表1 1周各組大鼠逃避潛伏期及穿越平臺次數(shù)

注：與依達(dá)拉奉治療組對照●P>0.05，與假手術(shù)組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01

2.3 光學(xué)顯微鏡下觀察海馬區(qū)HE染色結(jié)果

假手術(shù)組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊緊密，形態(tài)完整，胞漿豐富胞核飽滿，核仁清晰。模型組神經(jīng)細(xì)胞缺失較多，殘留的神經(jīng)細(xì)胞排列松散不規(guī)則，邊界模糊，邊緣出現(xiàn)空泡，有的胞核消失。依達(dá)拉奉治療組神經(jīng)元數(shù)目較模型組明顯增多，神經(jīng)元胞漿豐富，核仁清晰(圖1)。

假手術(shù)組(×100) 模型組(×100) 依達(dá)拉奉治療組(×100)

圖1 海馬CA1區(qū)HE染色結(jié)果

3 討 論

隨著世界人口趨向老齡化，VD患者數(shù)量在不斷增加，已成為繼腫瘤、心腦血管病之后引起老年人死亡的第四大疾病，VD也越來越受到廣泛關(guān)注。因此對VD發(fā)病機(jī)制和有效防治方法進(jìn)行研究，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會效益。

研究表明氧化應(yīng)激被證實是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要原因?；钚匝跷镔|(zhì)的產(chǎn)生，可通過氧化細(xì)胞膜脂質(zhì)[3,4]，并可在鳥嘌呤羥化及胞嘧啶甲基化的過程中引起DNA剪切[5]，而對蛋白質(zhì)的氧化則可產(chǎn)生羰基衍生物及硝化酪氨酸[6]。活性氧物質(zhì)還可抑制線粒體電子傳遞鏈中的酶復(fù)合物，導(dǎo)致線粒體功能障礙[7]，最終破壞細(xì)VaD大鼠模型的成功建立對研究其發(fā)病機(jī)制和治療方法有著重要的意義，本實驗采用2一V0法建立VaD模型，實驗整個過程，對動物創(chuàng)傷較小，存活率較高、安全性較好，且手術(shù)操作較簡單，要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力下降，與臨床“VaD”的發(fā)病過程相似。Morris水迷宮是實驗動物學(xué)習(xí)記憶保持情況的測試方法，被廣泛應(yīng)用于動物行為學(xué)的研究[8]。利用Morris水迷宮測試大鼠智能較恰當(dāng)。

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn):采用雙頸總動脈永久結(jié)扎方法可使大鼠智能下降、相關(guān)功能受到損害。利用Morris水迷宮測試，模型組逃避潛伏期明顯大于假手術(shù)組和依達(dá)拉奉治療組，模型組穿越平臺次數(shù)明顯少于假手術(shù)組和依達(dá)拉奉治療組，證明了采用2-V0法造模的VaD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力下降，認(rèn)知功能受到損害;為了進(jìn)一步肯定模型的成功，對大鼠腦組織進(jìn)行病理學(xué)觀察，海馬是大腦的重要結(jié)構(gòu)之一，是缺血損傷最敏感腦區(qū)是腦內(nèi)參與記憶貯存功能的重要部分，直接參與信息貯存和回憶，為VaD研究中涉及最的腦區(qū)之一，本實驗針對海馬這一關(guān)鍵腦區(qū)行HE染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn):海馬CAI區(qū)錐體細(xì)的變性、壞死甚至丟失，符合VaD形態(tài)學(xué)特征，而假手術(shù)組與治療組無明顯差異。進(jìn)一步證明2一V0法造模成功。依達(dá)拉奉治療組大鼠的認(rèn)知功能的有了明顯的提高，海馬CAI區(qū)錐體細(xì)的變性、壞死減少，這與依達(dá)拉奉抗自由基的神經(jīng)元保護(hù)機(jī)制有關(guān)。

采用兩血管法制備的VaD大鼠模型認(rèn)知功能功能下降，海馬神經(jīng)元數(shù)量減少，依達(dá)拉奉可以改善VaD大鼠的認(rèn)知功能，保護(hù)海馬區(qū)神經(jīng)元。

[1] Kuller LH.Dementia epidemiology researeh:it is time to modify the focus of researeh[J].Gerontol A Biol Sci Med Sci，2006，61(12):1314-1318.

[2] Ahmad A, Khan MM, Javed H,et al.Edaravone ameliorates oxidative stress associated cholinergic dysfunction and limits apoptotic response following focal cerebral ischemia in rat[J]. Mol Cell Biochem, 2012,367(1-2):215-225.

[3] Vincent AM，MaieseK．Nitric oxide induction of neuronal endonuclease activity in programmed cell death．Exp Cell Res，l999．246：290～300．

[4] Siu AW，To CH．Nitric oxide and hydroxyl radical-induced retinal lipid peroxidation in vitro．Clin Exp Optom，2002，85：378-382．

[5] Lee DH，O’Connor TR，Pfeifer GP．Oxidative DNA damage induced by copper and hydrogen peroxide promotes CG—>TT taudem mutations at methylated CpG dinucleotides in nucleotide excision repair-deficient cells．Nucleic AcidsRes．2002，30：3566～3573．

[6] Adams S，Green P，Claxton R，et a1．Reactive carbonyl formation by oxidative and non-oxidative pathways．Front Biosci，2001，6：Al7～24.

[7] Yamamoto T，Maruyama W，Kato Y，et a1．Selective nitration of mitochondrial complex I by peroxynitrite：involvement in mitochondria dysfunction and cell death of dopaminergic SH-SY5Y cells．J Neural Transm，2002，109(1)：1～13．

[8] 徐玉振秦麗晨劉運(yùn)林．消旋正丁基苯酞對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響．中華行為醫(yī)學(xué)與腦科學(xué)雜志，2011，20：309-311