11C-Carfentanil的質(zhì)量控制

張曉軍, 向曉輝, 張錦明 , 田嘉禾

(1.中國人民解放軍總醫(yī)院 核醫(yī)學科， 北京 100853;2.北京大學 神經(jīng)科學研究所， 北京 100191)

11C-Carfentani是一種μ-Opiate受體(阿片受體)顯像劑，主要與涉及疼痛感覺的中樞神經(jīng)Mm型μ-Opiate受體結(jié)合，描繪該受體在大腦內(nèi)的分布[1]，研究該受體的藥理機制，探討針炙止痛的機理，也用于一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂疾病如癲癇、肺腺癌等疾病的診斷，藥物成癮和煙酒戒斷治療等的監(jiān)測[2-5]?？ǚ姨?Carfentanl)是目前最強有效的阿片類鎮(zhèn)痛藥物，藥物相對作用效價約為嗎啡的10 000倍，是芬太尼的100倍，在人體起效藥物劑量是10 μg[6-7]。

正電子放射性藥物，特別是短半衰期正電子核素標記的PET藥物，需要專門的安全評價和質(zhì)量控制措施。短半衰期放射性藥物也必須在嚴格的時間內(nèi)就地生產(chǎn)并就近使用，而且在生產(chǎn)和應用之間沒有足夠長的時間進行所有常規(guī)質(zhì)量控制和檢測實驗。短半衰期放射性藥物的另一個特點是微量，11C-Carfentanil合成的前體去甲基卡芬太尼使用量是1 mg，產(chǎn)品中所含的11C-Carfentanil僅有幾十微克，這使得用于質(zhì)量控制的分析方法必須具有較低的檢測下限，其中高效液相色譜法是最常用的一種分析手段，其與放射性探測器結(jié)合使用，可以測量產(chǎn)品的化學純度及放化純度，與標準品同時進樣可進行化合物的鑒定。

本研究利用高效液相色譜系統(tǒng)測量11C-Carfentanil注射液的化學純度和放化純度；液質(zhì)聯(lián)用方法測量比活度；應用快速內(nèi)毒素檢測器PTS檢測產(chǎn)品中內(nèi)毒素含量，對制備的11C-Carfentanil注射液的質(zhì)量控制方法進行了研究[8]。

1 實驗材料

液質(zhì)聯(lián)用儀(LC-MS): API 2000，美國Applied Biosystems公司；Pump Agilent 1200 G1310，Agilent Eclipse XDB-C18分析柱(4.6 mm×150 mm×5 μm):Agilent Technologies公司；PTS(內(nèi)毒素快速檢測儀)：美國charles river公司；Plus C18柱和 HPLC分析系統(tǒng) (紫外檢測器和放射性探測器)：Waters公司；前體去甲基卡芬太尼，標準品12C-Carfentanil：德國ABX公司；KM小鼠：北京華阜康生物科技股份有限公司(許可證編號：SKK京2009-0007)。

2 實驗方法

2.1 理化性質(zhì)分析

2.1.1外觀鑒別11C-Carfentanil為本中心自行制備[9-10]，在制備完成后，11C-Carfentanil注射液在燈光下，在鉛玻璃后觀察。

2.1.2放射性核素鑒定 取1 mL制備的11C-Carfentanil注射液，用活度計測定60 min內(nèi)不同時間的活度值，以時間為橫坐標，測量的濃度為縱坐標，在半對數(shù)坐標紙上作圖，用半對數(shù)法計算半衰期。

2.1.3酸堿度 使用精密pH試紙測定11C-Carfentanil注射液的pH。

2.1.4濃度測量 用HPLC系統(tǒng)測定11C-Carfentanil注射液的濃度，分析柱為Grace Alltima C18, 5 μL,10 mm×250 mm，流動相為500 mL含50 mmol乙酸銨的30%乙腈溶液，另加1 mL冰乙酸，pH 為6.4，流速1.0 mL·min-1。以紫外檢測器檢測，進樣量10 μL，檢測波長254 nm。使用面積歸一法測定11C-Carfentanil注射液的濃度。

2.1.5放化純度測量 測量HPLC條件與濃度測量相同。將11C-Carfentanil注射液與標準品(12C-Carfentanil)溶液(10 mg/L)在HPLC系統(tǒng)同時進樣，測量標準品和11C-Carfentanil注射液的保留時間；采用HPLC系統(tǒng)與在線放射性探測器結(jié)合測量，使用面積歸一法測定11C-Carfentanil注射液的放化純度。

2.2 比活度測量

11C-Carfentanil的比活度關系到研究與應用能否安全進行，需要嚴格控制。測量比活度需要先測量產(chǎn)品中11C-Carfentanil的濃度，濃度測量可采用紫外測量法和質(zhì)譜測量法。

紫外測量方法為：精確配置5.0、7.5、10、15、20 mg/L標準品溶液，在上述色譜條件下，依次取10 μL進樣，對各濃度色譜峰面積積分，以峰面積為縱坐標、濃度為橫坐標進行線性回歸，得到定量線性方程。再取10 μL產(chǎn)品溶液進樣，將峰面積代入線性方程即可得到產(chǎn)品中卡芬太尼濃度。

質(zhì)譜測量方法為：采用API2000質(zhì)譜儀測量11C-Carfentanil注射液濃度，并計算其比活度。質(zhì)譜參數(shù)設定：采用Q1 Full Scan模式，Syring Pump 進300 μg/L的標準溶液10 μL/min，根據(jù)Carfentanil的極性及其熱不穩(wěn)定性，選用ESI離子源正離子掃描，可得395.3 amu為基峰，也是母離子(M+H)+，并Edit Ramp優(yōu)化Declustering Potential(DP)為40 V、Focusing Potential(FP)為350 V、Entrance Potential(EP)為8 V。采用Product Ion Scan模式，掃描并選擇113.0 amu、246.3 amu、335.1 amu做子離子。進行MRM優(yōu)化，設置離子對為395.3/113.0、395.3/246.3、395.3/335.1，同時Edit Ramp優(yōu)化Collision Energy(CE)為50 V，Curtain Gas(CUR)為17 psig，Collision Gas為6 psig，IonSpray Voltage(IS)為5 500 V，Ion Source Gas 1(GS1)為55 psig，Ion Source Gas 2 (GS2)為55 psig，Temperature(TEM)為350 ℃，保存MRM方法。

質(zhì)譜測量前液相色譜分離條件：HPLC采用Agilent Eclipse XDB-C18分析柱(4.6 mm×150 mm×5 μm)，流動相為600 mL 50 mmol/L乙酸銨水溶液與400 mL乙腈混合，再加入2.2 mL冰乙酸調(diào)節(jié)pH至6.4，流速為500 μL/min。手動進樣20 μL，這種條件下，樣品中Carfentanil的保留時間為7.2 min。

精確制備濃度為100、200、300、400、500 μg/L的Carfentanil標準品溶液。應用設定好的質(zhì)譜MRM方法，依次進樣25 μL，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標擬合線性回歸方程，再用25 μL產(chǎn)品進樣，經(jīng)MS測量后依標準曲線即可計算出產(chǎn)品濃度，從而可計算出11C-Carfentanil的比活度。

2.3 生物學性質(zhì)

2.3.1細菌內(nèi)毒素含量 美國藥典26版規(guī)定，11C-Carfentanil注射液中細菌內(nèi)毒素不高于175/V，內(nèi)毒素單位(EU)(175/VIU)，V定義為最大總用藥劑量，以mL計。利用Charles river公司產(chǎn)品PTS檢測，取10 μL產(chǎn)品，加入注射用水稀釋到1 mL，即稀釋100倍，用專用微量進樣器取100 μL稀釋液加入PTS，即可測量稀釋100倍后產(chǎn)品中內(nèi)毒素含量，求得產(chǎn)品內(nèi)毒素含量。測量過程中所用器具和加入的試劑均為無菌無熱源。

2.3.2無菌檢查 根據(jù)中國藥典附錄[11]，取0.2 mL11C-Carfentanil注射液分別接種于7.5 mL硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基和真菌培養(yǎng)基中，在隔離系統(tǒng)中30～35 ℃ 培養(yǎng)14 d，并按規(guī)定進行觀察。

2.3.3異常毒性檢查 根據(jù)中國藥典附錄方法[12]，用5只KM小鼠對生產(chǎn)的11C-Carfentanil注射液進行異常毒性檢查，每只小鼠尾靜脈注射0.2 mL 18.5 MBq產(chǎn)品溶液，載體為每只0.278 nmol。于注射后稱重，正常飼養(yǎng)一周后再次稱重，同時全部處死，取主要器官，肉眼觀察有無變化。

3 結(jié)果與討論

3.1 理化性質(zhì)

11C-Carfentanil外觀為無色透明澄清溶液；精確pH試紙測量溶液的pH為5.5～6.0(n=3)；通過活度計測量產(chǎn)品衰變速度，用半對數(shù)法計算11C-Carfentanil注射液的半衰期，結(jié)果為20.3 min，符合11C放射性核素的半衰期要求。

經(jīng)HPLC系統(tǒng)分析，11C-Carfentanil的紫外保留時間為5.3 min(圖1)，放射性峰的保留時間為5.8 min(圖2)，其時間差值是由于紫外探測器與放射性探測器之間的連接管路產(chǎn)生的。標準品與產(chǎn)品同時進樣，二者紫外保留時間一致，均為5.3 min，可以證實產(chǎn)品為目標化合物。采用放射流量檢測器測定產(chǎn)品放化純度，使用面積歸一法測定11C-Carfentanil注射液的放化純度>98%。

圖1 HPLC分析放射性峰

圖2 HPLC分析紫外峰

11C-Carfentanil溶液中主要化學雜質(zhì)是去甲基卡芬太尼前體，合成結(jié)束時的反應溶液用10 mL 1%氨水稀釋后過C2柱，11C-Carfentanil被吸附在C2柱上，用10 mL水淋洗C2柱后，去甲基卡芬太尼前體即被除去，但仍有少量的前體與11C-Carfentanil隨乙醇淋洗到最終產(chǎn)品溶液中。去甲基卡芬太尼，在血液中無法進入血腦屏障(BBB)，動物實驗證實，盡管卡芬太尼的毒性很大，但其前體去甲基卡芬太尼則毒性很低，小鼠體內(nèi)注射50 mg/kg的前體，沒有觀察到中毒征狀。因此微量前體對產(chǎn)品質(zhì)量沒有很大影響[10]。

實驗中發(fā)現(xiàn)，在11C-Carfentanil的制備中，使用兩種不同的氫化鋰鋁對最終比活度的影響很大。使用高本底的氫化鋰鋁，由于其中12C甲醇鹽含量高，在與氫碘酸反應后生成12C-CH3I，轉(zhuǎn)換成12C-CH3-Triflate后與前體去甲基卡芬太尼反應生成12C-Carfentanil，因此使產(chǎn)品比活度大大下降。使用低本底與高本底的氫化鋰鋁進行反應，所得產(chǎn)品的比活度分別為1.69×1014Bq/g與3.48×1013Bq/g，可見，低本底的氫化鋰鋁化學純高，可以提高產(chǎn)品的比活度。

3.2 比活度測量

濃度為5～20 mg/L的Carfentanil標準品經(jīng)HPLC檢測，定量標準曲線為y=516.81x-164.88，r=0.975 9，可見Carfentanil標準品濃度與HPLC紫外峰面積之間有良好的線性相關性。但產(chǎn)品溶液進樣后發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品峰處雜峰較多，影響對11C-Carfentanil峰的峰面積進行積分，而導致無法對11C-Carfentanil準確定量。

質(zhì)譜有靈敏、快速、特異、化學定量的特點，是目前定量化合物最靈敏最有效的方法。通過質(zhì)譜定量分析11C-Carfentanil產(chǎn)品，記錄質(zhì)譜圖示于圖3和圖4，經(jīng)線性回歸，得到線性方程y=533x+5 370，r= 0.999 9，線性范圍為100～500 μg/L。在相同的質(zhì)譜分析條件下，稀釋產(chǎn)品溶液，使其濃度落在標準曲線范圍內(nèi)，然后取25 μL稀釋液進樣，測量質(zhì)譜圖峰面積，即可知產(chǎn)品濃度為12.8 mg/L。再測量產(chǎn)品總活度，計算可得比活度為1.69×1014Bq/g。

圖3 母離子Q1掃描

圖4 離子對Q1/Q2掃描

3.3 生物學性質(zhì)

內(nèi)毒素快速檢測儀PTS的內(nèi)置內(nèi)毒素標準曲線范圍為5～0.05 EU/mL，產(chǎn)品稀釋100倍后測量內(nèi)毒素含量為小于0.05 EU/mL，即產(chǎn)品中內(nèi)毒素含量小于5 EU/mL(n=3)，符合標準。經(jīng)無菌試驗證實產(chǎn)品為無菌溶液。

異常毒性檢查中，小鼠注射時體重均值為(23.1±1.8) g，一周后為(28.7±2.1) g，肉眼觀察主要器官，無變化。在保證所有合成材料與原料均為無菌無熱源的前提下，11C-Carfentanil注射液的細菌內(nèi)毒素測量以及無菌檢驗可以在注射液使用中或使用結(jié)束后進行。

4 小 結(jié)

11C-Carfentani作為一種μ-Opiate受體顯像劑，由于其生理效應很強，要求產(chǎn)品高比活度。從理化性質(zhì)和生物學性質(zhì)兩個方面對11C-Carfentani進行質(zhì)量控制，合成產(chǎn)品為無色透明澄清溶液，pH為5.5～6.0，半衰期為20.3 min，放化純大于98%，比活度為1.69×1014Bq/g，內(nèi)毒素含量小于5 EU/mL，異常毒性試驗檢查合格。以上結(jié)果表明，11C-Carfentanil注射液的質(zhì)量符合藥用要求，可滿足實驗和臨床安全使用的要求。

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