99Tcm標記右旋糖苷衍生物DCM-1的淋巴結(jié)攝取和顯像

李洪玉，梁積新，楊春慧，羅洪義，莊 玲，陳 陽，鄭德強，魯 佳，孫桂全

(1.中國原子能科學(xué)研究院 同位素研究所,北京 102413；2.原子高科股份有限公司，北京 102413；3.中國核工業(yè)北京四○一醫(yī)院，北京 102413)

前哨淋巴結(jié)(SLN)是指接受淋巴引流的第一級淋巴結(jié)。當某原發(fā)癌發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，最先引起反應(yīng)的就是SLN。由此可見，SLN的病理學(xué)特征可預(yù)測并反映該腫瘤的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況，準確識別和定位SLN對病情監(jiān)測和患者預(yù)后評估至關(guān)重要。

前哨淋巴結(jié)活檢(Sentinel Lymph Node Biopsy，SLNB)是獲取SLN并進行病理學(xué)檢查的技術(shù)手段。用放射性核素顯像法檢測SLN是SLNB的常用方法之一[1]，而SLN顯像作為放射性核素定位法的一種有效手段，可以為SLNB提供SLN位置、數(shù)目及狀態(tài)的重要信息。SLN顯像的成功率很大程度上取決于所采用放射性藥物的種類。一種理想的SLN放射性藥物應(yīng)具有如下性質(zhì)：納米顆粒且大小均勻；在正?；虬┳兊腟LN中的攝取率高并且滯留時間較長；可從注射點快速清除；較少發(fā)生向下一級淋巴結(jié)的遷移。目前臨床上最常用的SLN顯像劑是膠體類藥物，如99Tcm-硫膠體、99Tcm-硫化銻、99Tcm-硫化錸，以及其他大分子藥物，如99Tcm-人血清白蛋白、99Tcm-右旋糖苷等[2]。然而，這些藥物都是非特異性的，主要靠主動擴散作用向淋巴管路轉(zhuǎn)移，藥物顆粒最終靠淋巴巨噬細胞的吞噬作用被淋巴結(jié)攝取，存在示蹤劑顆粒大小不均、注射后至顯像的時間間隔不易確定、注射點濃集較高、隨時間延長向下一級淋巴結(jié)遷移等缺點。

最近的研究[3]表明，甘露糖對淋巴巨噬細胞表面的受體具有親和作用，99Tcm標記的甘露糖基化右旋糖苷類大分子化合物，由于具有受體結(jié)合性質(zhì)且分子大小較為確定，因而在SLN顯像方面體現(xiàn)出較強的應(yīng)用價值。LymphoseekTM(99Tcm-DTPA-甘露糖基化右旋糖苷)[4]即為近年開發(fā)出來的SLN顯像劑，目前在國外已進入三期臨床研究。Lymphoseek選擇了DTPA作為99Tcm的螯合基團，而99Tcm-DTPA配合物僅在大量DTPA配體和過量亞錫離子的存在下才是穩(wěn)定的，且其化學(xué)結(jié)構(gòu)始終存在不確定性，因此，仍有必要研究一種化學(xué)結(jié)構(gòu)確定，穩(wěn)定性和靶向性兼?zhèn)涞腟LN藥物。

DCM(Dextran-S-Cysteine-Mannose)是指一類連接有半胱氨酸的甘露糖基化右旋糖苷衍生物，化學(xué)結(jié)構(gòu)示于圖1，其分子通過巰基的硫原子連接了半胱氨酸，S-半胱氨酸基團的氨基可耦聯(lián)甘露糖基；另一方面，未連接甘露糖基的S-半胱氨酸基團可作為SNO三齒配體與[99Tcm(CO)3(H2O)3]+螯合。通過這種分子設(shè)計，DCM類化合物無需連接其他雙功能螯合劑，可直接進行99Tcm的標記[5]。

相關(guān)的生物分布實驗和顯像研究表明，該類锝標記的DCM配合物與未連接甘露糖基的DC(Dextran-S-Cysteine)配合物相比較，在SLN的攝取大大提高，體現(xiàn)出了受體結(jié)合的特點，但注射劑量是關(guān)鍵因素[6-7]。

本研究用羰基锝標記了DCM-1，得到99Tcm-(CO)3-DCM-1，并進行正常鼠淋巴結(jié)中的分布和顯像研究，重點考察不同注射劑量的99Tcm-(CO)3-DCM-1對正常鼠淋巴結(jié)攝取及體內(nèi)分布的影響。

1 實驗材料

1.1 主要儀器

99Mo-99Tcm發(fā)生器：原子高科股份有限公司產(chǎn)品；FH463A自動定標器、FT-603型閃爍探頭：北京核儀器廠；CRC15R放射性活度計：美國CAPINTEC公司；微量注射器：美國 Hamilton公司；高效液相系統(tǒng)：ProStar 210型，美國Varian公司；HPLC放射性檢測器：德國Raytest公司；Milli-Q高純水制備系統(tǒng)：美國MILLIPORE公司。

圖1 右旋糖苷衍生物DCM-1的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of dextran mannose conjugates: DCM-1

1.2 主要試劑

Isolink藥盒：由Mallinckrodt-Tyco公司生產(chǎn)并贈送；右旋糖苷衍生物DCM-1：希臘放射性核素和放射性顯像產(chǎn)品研究所的Ioannis Pirmettis博士合成，法國Roberto Pasqualini博士提供；專利藍溶液(2.5%)：Roberto Pasqualini博士提供；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，實驗用水均為二次去離子水。

1.3 實驗動物

Balb/C小白鼠：隨機分組，每組5只，雌雄兼用，18～22 g；Wistar大鼠：隨機分組，每組3只，雌雄兼用，180～220 g；動物均為清潔級，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供。

2 實驗方法

2.1 [99Tcm(CO)3(H2O)3]+ 的制備

向Isolink藥盒中加入1 mL新鮮的 Na99TcmO4洗脫液(37～370 MBq)，于95 ℃反應(yīng)25～30 min，間歇振蕩，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻到室溫，用 PBS-HCl緩沖液(0.64 mol/L，pH為2.5)調(diào)節(jié)pH為7.5～8.5。

2.2 DCM-1的99Tcm標記[5]

將1 mL [99Tcm(CO)3(H2O)3]+溶液 (37～370 MBq)加入到含有400 μg DCM-1凍干品的瓶中，于75 ℃反應(yīng)30 min，冷卻，即得標記化合物99Tcm-(CO)3-DCM-1。

2.3 99Tcm-(CO)3-DCM-1的放化純度測定

采用高效液相色譜法(HPLC)分析測定標記物的放化純度，HPLC分析條件：C-18色譜柱(Hypersil ODS2，4.6 mm×250 mm)，紫外檢測器波長為254 nm，流速為1 mL/ min。淋洗液組成：流動相A : 0.1%TFA/H2O，B: 0.1%TFA/MeOH；淋洗梯度：0～4 min，0～0%B；4～6 min，0～25%B；6～17 min，25%～100%B；17～25 min，100%B；25～30 min，100%～0B；30～35 min，0B。

總體上說，在公路橋梁建設(shè)過程中，預(yù)應(yīng)力的使用是一項長期且復(fù)雜的工程，技術(shù)要求高，每個環(huán)節(jié)都要求精準把握，因此，針對這項技術(shù)的實際應(yīng)用，需要根據(jù)項目的實際特點，采用正確的方式進行。不斷提高施工作業(yè)的精度和準度，提升施工工藝，保障各項施工工藝始終符合行業(yè)標準和具體施工需求。從而全面提高預(yù)應(yīng)力在我國公路橋梁中的具體作用。

2.4 99Tcm-(CO)3-DCM-1的穩(wěn)定性

將標記溶液用生理鹽水稀釋80倍，于室溫下靜置5 h，用HPLC分析放化純度，考察其體外穩(wěn)定性。將99Tcm-(CO)3-DCM-1由小鼠腳墊皮下注射，1 h后取尿液離心后取上層澄清液進行HPLC分析，考察其體內(nèi)穩(wěn)定性。

2.5 99Tcm-(CO)3-DCM-1在正常鼠體內(nèi)的生物分布

取健康Balb/C小鼠，隨機分組，每組5只；Wistar大鼠，隨機分組，每組3只。標記物用生理鹽水稀釋，經(jīng)正常鼠的右后足腳墊進行皮下注射，注射液放射性濃度為3～37 GBq/L。注射后按摩腳掌30 s以利于藥物吸收，分別于處死前10 min在給藥同側(cè)的腳墊處皮下注入專利藍溶液，再按摩腳掌30 s。給藥后1、4 h處死動物，取SLN(即腘窩淋巴結(jié)，popliteal lymph node)、次級淋巴結(jié)(即腰淋巴結(jié)，2LN)、注射點(即右后足，injection site)、肝、脾、血等，肝、脾、血稱重，測量各器官或組織的放射性計數(shù)，計算放射性攝取率(SLN、2LN、注射點單位為%ID，肝、脾、血的單位為%ID·g-1),并計算SLN提取率(popliteal extraction rate,PE%)，公式如下：

PE%=[(SLN攝取率-2LN攝取率)/SLN攝取率]×100%

PE%體現(xiàn)了藥物在SLN滯留的比率，該值越大，說明藥物在SLN的滯留越強，向下一級淋巴結(jié)遷移的可能性越小。

2.6 正常大鼠體內(nèi)的淋巴結(jié)顯像

取Wistar大鼠，每3只一組，每只右后足腳墊皮下注射不同劑量的標記物，分別在注射后不同時間點進行顯像，顯像前10 min經(jīng)腹腔注射0.8 mL 10%水合氯醛溶液對大鼠進行麻醉。顯像數(shù)據(jù)在計算機系統(tǒng)128×128矩陣中進行記錄與分析，放大倍數(shù)：1，采集計數(shù)：50 K/只。

3 結(jié)果與討論

3.1 99Tcm-(CO)3-DCM-1的制備及穩(wěn)定性

將99Tcm-(CO)3-DCM-1溶液用生理鹽水稀釋80倍，于室溫下靜置5 h，放化純度仍>90%，說明99Tcm-(CO)3-DCM-1體外穩(wěn)定性較好。給藥后1 h，尿液的HPLC分析圖譜示于圖2d，結(jié)果顯示，主峰保留時間未變，99Tcm-(CO)3-DCM-1在小鼠體內(nèi)未發(fā)生分解。

3.2 99Tcm-(CO)3-DCM-1在正常鼠體內(nèi)的生物分布

將99Tcm-(CO)3-DCM-1分別以每25 μL 2 μg、每5 μL 2 μg、每5 μL 0.2 μg、每5 μL 0.05 μg和每5 μL 0.005 μg劑量注入Balb/C小白鼠體內(nèi)，99Tcm-(CO)3-DCM-1在Balb/C小白鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列于表1。

a——[99Tcm (CO)3(H2O)3]+ ；b——99Tcm-(CO)3-DCM-1；c——99Tcm-(CO)3-DCM-1稀釋80倍；d——99Tcm-(CO)3-DCM-1小鼠代謝的尿樣品圖2 各種樣品的HPLC圖 a——[99Tcm (CO)3(H2O)3]+ ；b——99Tcm-(CO)3-DCM-1；c——99Tcm-(CO)3-DCM-1 (80 times dilution)；d——the mice’s urine sample of 99Tcm-(CO)3-DCM-1 metabolismFig.2 Radio-HPLC profiles of the samples

注射后時間組織或器官Balb/C小鼠體內(nèi)的放射性攝取率2 μg(25 μL)2 μg(5 μL)0.2 μg(5 μL)0.05 μg(5 μL)0.005 μg(5 μL)SLN3.18±0.186.12±0.764.34±1.436.47±1.456.37±0.862LN2.16±0.414.88±1.521.75±0.670.22±0.140.54±0.09注射點30.68±8.3340.51±8.6116.73±1.1854.23±2.2476.65±4.141 h肝23.34±3.5029.02±3.004.05±0.891.34±0.272.61±0.34脾13.82±3.621.79±0.320.12±0.090.23±0.130.16±0.07血2.93±0.442.23±0.530.01±0.000.04±0.041.09±0.13SLN提取率PE%32.120.359.796.691.5SLN3.47±1.027.69±1.575.19±1.474.32±0.917.08±0.802LN2.07±0.474.51±1.070.78±0.450.20±0.090.69±0.37注射點36.09±3.0934.90±3.0821.41±1.6544.58±3.2670.29±3.244 h肝21.60±3.2936.65±2.384.58±0.551.17±0.413.24±0.14脾15.41±3.482.82±0.430.16±0.070.25±0.280.21±0.03血1.27±0.071.33±1.510.00±0.010.04±0.061.06±0.14SLN提取率PE%40.341.485.095.490.3

注：SLN、2LN、注射點攝取率的單位為%ID；肝、脾、血攝取率的單位為%ID·g-1

由表1可見，注射劑量，包括注射化學(xué)量和注射體積，對99Tcm-(CO)3-DCM-1在Balb/C小白鼠體內(nèi)的SLN攝取具有顯著影響。當注射藥物化學(xué)量保持不變，而注射體積由25 μL 減少到5 μL時，SLN 的攝取幾乎增加了一倍，注射后1 h從3.18%增至6.12%，注射后4 h從3.47%增至7.69%，存在顯著差異(P<0.001)。當注射體積保持不變，而注射藥物化學(xué)量由2 μg減少到0.05 μg時，SLN 的攝取也會提高，同時2LN的攝取減少到只有0.22%，相應(yīng)的SLN提取率PE%從20%～40% 增長到90%以上，說明向次級淋巴結(jié)的遷移隨注入化學(xué)量的減少而減少。然而，實驗結(jié)果也表明，注射劑量并不是越低越好，當注射劑量減少到每5 μL 0.005 μg時，SLN攝取率和提取率PE%均出現(xiàn)下滑，而注射點的滯留卻明顯增加。當注射劑量相對較小時，如每5 μL 0.05 μg時，生物分布較理想，SLN攝取較高，而其他組織或器官(除注射點)攝取較低。

另外，分別以每30 μL 0.05 μg和每5 μL 0.05 μg的劑量注入Wistar大鼠體內(nèi)，得到99Tcm-(CO)3-DCM-1在Wistar大鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列于表2。

在Wistar大鼠生物分布實驗中得到了與小鼠相似的實驗結(jié)果，注射劑量減少時，SLN的攝取增加，如表2所示，注射化學(xué)量為0.05 μg、注射體積30 μL時，SLN的攝取率達到15%～17%，當注射體積由30 μL 減少到5 μL(注射化學(xué)量相同)時，SLN的攝取率幾乎增加一倍，達到30%～32%，而且藥物向下一級次淋巴結(jié)的遷移較小，PE%均在95%左右，但不得不注意到，仍有約50%的藥物滯留在注射點。注射劑量0.05 μg(30 μL)和0.05 μg(5 μL)時所得數(shù)據(jù)經(jīng)對照，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，差異顯著。

以前的研究表明，注射劑量是影響前哨淋巴結(jié)顯像藥物生物分布的關(guān)鍵因素，并應(yīng)在可行的前提下盡量降低注射體積[8]。注射體積增大，會降低淋巴結(jié)對藥物的攝??；而減少注射化學(xué)量，會降低肝和血液中的攝取并減少藥物向下一級淋巴結(jié)的遷移。適量降低注射劑量有利于提高SLN的攝取率和2LN提取率，但也并不是越低越好，降低注射劑量，意味著要對藥物進行大量稀釋，有可能造成藥物分子相互聚集，形成聚合大分子而滯留在注射點，因此需要進行綜合考慮，從而確定最佳注射劑量。

表2 99Tcm-(CO)3-DCM-1在Wistar大鼠體內(nèi)的生物分布

注：SLN、2LN、注射點攝取率的單位為%ID；肝、脾、血攝取率的單位為%ID·g-1

3.3 Wistar大鼠的淋巴結(jié)顯像

99Tcm-(CO)3-DCM-1分別以劑量a：0.5 μg每50 μL(2.1×106Bq)和劑量b：1.0 μg每50 μL(4.1×106Bq)的注射劑量注射Wistar大鼠，進行顯像，顯像結(jié)果示于圖3。

a組——0.5 μg(50 μL)；b組——1.0 μg(50 μL)圖3 99Tcm-(CO)3-DCM-1在Wistar大鼠體內(nèi)顯像圖Fig.3 SPECT images pictures of 99Tcm-(CO)3-DCM-1 in Wistar rats

由圖3可以看出，顯像與生物分布的結(jié)果一致，99Tcm-(CO)3-DCM-1具有較高的SLN攝取，注藥后10 min，SLN即已顯影，隨后各個時間點，SLN顯像均非常清晰；雖然在注射點仍有較強滯留，但并不影響對SLN的觀察；而隨時間延長，可看到有小部分放射性向2LN遷移，膀胱與2LN顯影會發(fā)生重疊，但即使給藥2 h后，仍未見放射性向第三淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移；全身放射性本底較低，可見肝區(qū)輕微顯影。當注射化學(xué)量從0.5 μg增加到1.0 μg時，SLN攝取有所下降，肝區(qū)顯影略加重。

4 結(jié) 論

用[99Tcm(CO)3(H2O)3]+標記甘露糖基化的右旋糖苷衍生物DCM-1，標記過程簡單，標記率大于90%。99Tcm-(CO)3-DCM-1在SLN的攝取較高，在大鼠的分布實驗中，SLN的攝取達30%以上，顯像實驗可見SLN清晰顯影；向下一級淋巴結(jié)的遷移較少，PE%最高可達97.7%。淋巴結(jié)攝取對注射劑量很敏感，當注射劑量減少時，SLN的攝取率和PE%都相應(yīng)提高。結(jié)果表明，99Tcm-(CO)3-DCM-1具有較高的前哨淋巴結(jié)攝取及優(yōu)良的體內(nèi)分布性質(zhì)，具備應(yīng)用于前哨淋巴結(jié)顯像的潛在價值，值得進一步的研究。

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