點擊化學(xué)法制備奧曲肽類似物18F-Ta-Gluc-TOCA及其生物學(xué)評價

溫 凱，陳寶軍，2，郭飛虎，2，梁積新，2，殷 胤，陳大明，崔海平

(1.原子高科股份有限公司，北京 102413;2.中國原子能科學(xué)研究院，同位素研究所，北京 102413)

生長抑素是由D細(xì)胞分泌的一種環(huán)狀多肽類激素，是一種具有廣泛生理學(xué)功能的內(nèi)源性調(diào)節(jié)肽，對許多實體腫瘤及正常組織有抗增生作用，還可抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[1-3]。奧曲肽是一種人工合成的生長抑素，體內(nèi)作用時間可達2 h，作用較天然的生長抑素單一、持久，易被放射性核素標(biāo)記。

奧曲肽作為一種重要的生長抑素類似物，與生長抑素受體有良好的親和力，已經(jīng)成為一種重要的腫瘤治療藥物，多種放射性核素標(biāo)記的奧曲肽已經(jīng)進入臨床應(yīng)用。18F標(biāo)記奧曲肽類似物在國外已有一系列的合成方法報道，1994年，Guhlke等[4-5]成功完成了(2-18F-Fluoropropionyl-(D)phe1)- octreotide 的合成，該標(biāo)記方法的優(yōu)點為：?；噭┗钚愿?，空間位阻小，副反應(yīng)少，但其合成時間較長，在腫瘤攝取較低。2003年，Wester等[6-7]合成了18F-FP-Gluc-TOCA，通過引入葡萄糖基明顯改善了奧曲肽的親水性和穩(wěn)定性，但其合成時間大約需要3 h，放化產(chǎn)率為(25±5)%。2006年，Schirrmacher[8-10]制備了18F-SiFA-TATE，反應(yīng)機理為同位素交換反應(yīng)，最終的標(biāo)記率較高，生物體內(nèi)分布較好，但其在肝、腎攝取較高，體內(nèi)穩(wěn)定性不夠理想。2010年，Laverman等[11-12]利用NOTA環(huán)螯合Al18F，利用此基團來標(biāo)記一系列奧曲肽類似物。點擊化學(xué)(click chemistry)，其實質(zhì)是指選用易得原料，通過可靠、高效而又具選擇性的化學(xué)反應(yīng)來實現(xiàn)碳雜原子連接，低成本、快速合成大量新化合物的一套強大且實用的合成方法[13]。目前，該技術(shù)已在眾多研究領(lǐng)域得到迅速發(fā)展[14]，并已有標(biāo)記多肽方面研究的報道[15-18]。本實驗采用點擊化學(xué)的方法，在溫和條件下和較短時間內(nèi)完成標(biāo)記[19-20]，符合PET藥物的制備要求。所用的奧曲肽類似物經(jīng)過修飾，加入葡萄糖基，有利于增加奧曲肽的親水性，更有利于腫瘤的吸收。

1 主要材料和儀器

1.1 實驗材料

乙二醇雙對甲苯磺酸(化合物1)：東京化成工業(yè)株式會社；疊氮化鈉、N,N-二甲基甲酰胺、乙酸乙酯、石油醚、硫酸銅、抗壞血酸鈉、冰醋酸、氯化鈉、乙醇、三氟乙酸、無水硫酸鈉、無水硫酸鎂、氟化鉀、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、碳酸鉀：國藥集團化學(xué)試劑公司；乙腈：北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；K2.2.2：北京派特生物技術(shù)有限公司；前體化合物Pr-Gluc-TOCA：杭州中肽有限公司協(xié)作制備，純度95.1%。

實驗動物采用Balb/C裸鼠，鼠齡為4～6周：北京華阜康生物技術(shù)有限公司；采用的癌細(xì)胞為AR42J細(xì)胞，大鼠胰腺外分泌細(xì)胞，癌細(xì)胞在含10%小牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基中，于CO2恒濕孵育箱中培養(yǎng)，常規(guī)傳代：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。

1.2 實驗儀器

Eclipse HP型回旋加速器(11 Mev)：德國西門子公司；高效液相Agilent 1100：美國安捷倫公司；C18色譜柱，φ4.6 mm×250 mm：德國Merck公司；高效液相系統(tǒng)ProStar 320系統(tǒng)：美國Varian公司；C18色譜柱：4.6 mm×250 mm，美國Thermo公司；GABI型高效液相色譜放射性監(jiān)控儀：Raytest公司；Varian Mercury-Plus 400型核磁共振儀：美國Varian公司；Applied biosystems QTRAP 2000型質(zhì)譜儀：美國AB公司；CRC-15PET放射性活度計：美國Capintec公司； Sep Pak light C18 柱、Sep Pak light QMA柱：Waters公司；BHC-336定標(biāo)器、FT-663閃爍探頭：北京核儀器廠；MH2800A加熱模塊：Auto Science公司；水凈化系統(tǒng)：法國Millipore公司；KQ5200超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；旋渦混合器：北京北德科學(xué)器材有限公司；V-vials瓶，5 mL：美國Wheaton公司。

2 實驗方法

2.1 18F-Ta-Gluc-TOCA的合成

2.1.12-疊氮對甲苯磺酸乙酯(化合物2)的制備

取化合物1 1.84 g(10 mmol)溶于16 mL的無水DMF中，分四批加入疊氮化鈉0.32 g(10 mmol)，反應(yīng)混合物在常溫下攪拌48 h；然后過濾除去固體殘渣，濾液轉(zhuǎn)移至100 mL水中，充分?jǐn)嚢?，使化合?充分重結(jié)晶，用真空泵進行抽濾，得到化合物2的水和DMF混合溶液；再用30 mL乙酸乙酯萃取3次，萃取前加少量NaCl防止乳化，合并有機相后用20 mL飽和食鹽水洗滌；有機相用無水硫酸鈉和無水硫酸鎂混合干燥2.5 h，減壓蒸掉溶劑得粗產(chǎn)品約0.650 g，產(chǎn)率約26.9%。再以V(乙酸乙酯)∶V(石油醚)=1∶2.5為流動相，硅膠柱分離。采用核磁、質(zhì)譜鑒定化合物2結(jié)構(gòu)，通過HPLC來測定其化學(xué)純度，色譜流動相A水(含0.1%三氟乙酸)和流動相B乙腈(含0.1%三氟乙酸)；流速：1.0 mL/min；0 min，100%A；20 min，0%A；30 min，0%A；35 min，100%A。

2.1.22-18F疊氮乙烷(化合物3)的制備

18F-Ta-Gluc-TOCA合成路線示于圖1。18F生產(chǎn)條件為：核反應(yīng)18O(p，n)18F，采用1.5 mL H2O[18O]富氧水靶，在回旋加速器上用質(zhì)子束流連續(xù)轟擊15～30 min，流強50 μA，效率80%，得到18F-。取18F-約11.1×107Bq，注入到事先活化好的QMA柱(先用5 mL 10% K2CO3潤洗，再用10 mL去離子水清洗，最后用20 mL空氣排出柱上水分)上，用0.6 mL K2.2.2/ K2CO3溶液洗脫得到活的18F-KF。將上述18F-KF注入5 mL 的V-vials瓶中，在100 ℃加熱模塊上加熱，通氮氣吹干乙腈和水分，再加三次500 μL色譜純乙腈吹干，保證反應(yīng)體系無水，取出反應(yīng)瓶冷卻。

圖1 18F-Ta-Gluc-TOCA合成路線Fig.1 Synthesis of 18F-Ta-Gluc-TOCA

向活化后含有18F-KF的反應(yīng)瓶中，分三批加入2-疊氮對甲苯磺酸乙酯(化合物2)(0.125 mg，0.52 μmol)的250 μL無水乙腈的溶液，反應(yīng)混合物加熱到100 ℃，N2下吹干乙腈，再加300 μL無水乙腈復(fù)溶，密閉反應(yīng)15 min后停止反應(yīng)，冰水浴冷卻到室溫。

采用高效液相色譜放射性監(jiān)控儀檢測放化純度。色譜流動相A為水(含0.1%三氟乙酸)和流動相B為乙腈(含0.1%三氟乙酸)；流速：1.0 mL/min；0 min，95%A；3 min，95%A；10 min，10%A；15 min，25%A；20 min，95%A。

2.1.318F-Ta-Gluc-TOCA的制備

在含有2-氟疊氮乙烷(化合物3)的瓶中，氮氣保護下，加入100 μL 0.10 mol/L pH 6.0 PBS溶液，加入25 μL 0.45 mol/L硫酸銅溶液和60 μL 3.0 mol/L抗壞血酸鈉溶液，再加入250 μL Pr-Gluc-TOCA(化合物4，0.5 mg，0.36 μmol)的 PBS溶液，在室溫下反應(yīng)20 min。用Sep Pak Light C18柱分離純化。18F-Ta-Gluc-TOCA檢測方法同化合物3。

2.2 合成條件的選擇

2.2.1化合物2投料量對標(biāo)記率影響

化合物4用量保持0.5 mg，化合物2的投料量一個當(dāng)量為0.091 mg，分別取2、1、0.25、0.125、0.091 mg化合物2和9.3×107Bq18F-，保持其他反應(yīng)條件不變，分析對18F-Ta-Gluc-TOCA標(biāo)記率的影響。

2.2.2pH 對標(biāo)記率影響

分別以pH為4、5、6、7、8為反應(yīng)環(huán)境，進行完整的合成實驗，保持其他反應(yīng)條件不變。

2.3 體外穩(wěn)定性測定

取含18F-Ta-Gluc-TOCA的試劑約5.6×106Bq，置于1 mL 0.10 mol/L,pH 6的PBS中，置于37 ℃下，孵育30、60、90、120 min后，采用HPLC法測定其放化純度，觀察其體外穩(wěn)定性。

2.4 脂水分配系數(shù)測定

取5.5×106Bq18F-Ta-Gluc-TOCA，將其加入到含1 mL正辛醇和1 mL 0.10 mol/L,pH 6的PBS兩相溶劑中，密封渦旋，靜置使兩相恢復(fù)平衡。用移液器分別取出兩相各500 μL，用γ計數(shù)器計數(shù)，重復(fù)三次，計算脂水分配系數(shù)。

2.5 正常小鼠體內(nèi)生物分布

取正常小鼠16只，隨機分成4組，每組4只，分別經(jīng)尾靜脈注射100 μL約5.6×106Bq18F-Ta-Gluc-TOCA的生理鹽水溶液，分別于注射后15、30、60、120 min處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、肌肉、骨頭、血等相應(yīng)器官置于計數(shù)管底部，稱重并測量計數(shù)。經(jīng)衰變校正后計算各組織的每克組織放射性攝取率(%ID/g)。

2.6 荷瘤裸鼠體內(nèi)分布實驗

取荷AR42J瘤裸鼠8只，分成2組，每組4只，分別經(jīng)尾靜脈注射100 μL約5.6×106Bq18F-Ta-Gluc-TOCA的生理鹽水溶液，分別于注射后60、120 min處死，取心、肝、脾、肺、腎、胃、小腸、肌肉、骨頭、血、腫瘤等相應(yīng)器官置于計數(shù)管底部，稱重并測量計數(shù)。經(jīng)衰變校正后計算每克組織放射性攝取率(%ID/g)。

3 結(jié)果與討論

3.1 18F-Ta-Gluc-TOCA的合成

3.1.1化合物2的合成

2-疊氮對甲苯磺酸乙酯的HPLC圖示于圖2?；衔?性狀為淡黃色油狀物，共0.054 g，柱分離效率約8.5%。1H NMR(CDCl3，400 MHz)δ：7.82 (d, J = 8.0 Hz, 2H, C2H), 7.37 (d, J = 8.0 Hz, 2H, C3H), 4.16 (t, 2JHH= 5.2 Hz, 2H, SCH2), 3.48 (2JHH= 5.2 Hz, 2H, NCH2), 2.45(s, 3H, CH3); MS: 242.1(M+H), 259.1(M+NH4), 264.1(M+Na)。結(jié)果顯示，化合物2的結(jié)構(gòu)正確，相對分子質(zhì)量241.2；保留時間為13.833 min純度較高，大于97%，可以進行下一步實驗。

圖2 2-疊氮對甲苯磺酸乙酯的HPLC圖 Fig.2 HPLC chromatography of 2-azide-ethyl-p-toluenesulfonate

3.1.2化合物3的合成

2-18F疊氮乙烷的HPLC圖示于圖3。在反應(yīng)開始后，化合物3很快就開始生成，化合物2不斷減少，直到反應(yīng)結(jié)束，化合物2基本完全反應(yīng)，化合物3產(chǎn)率大于98%。

圖3 2-氟疊氮乙烷的HPLC圖Fig.3 HPLC chromatography of synthesizing 2-fluorine aziethane

3.1.318F-Ta-Gluc-TOC的合成

18F-Ta-Gluc-TOCA的HPLC圖示于圖4。合成18F-Ta-Gluc-TOCA實驗主要分為兩步，第一步合成化合物3，第二步合成18F-Ta-Gluc-TOC。化合物3的標(biāo)記率為80%，第二步反應(yīng)標(biāo)記率相對較低，總標(biāo)記率約為57%，需要進行分離純化。經(jīng)過對分離純化條件的優(yōu)化，最終選定使用Light C18柱進行分離純化。分離純化后18F-Ta-Gluc-TOCA放化純度達到91%，校正后比活度為7.4×107Bq/mg。

圖4 18F-Ta-Gluc-TOCA的HPLC分析圖 Fig.4 HPLC chromatography of 18F-Ta-Gluc-TOCA

3.2 合成條件選擇

3.2.1化合物2投料量

當(dāng)化合物2投料量為2、1、0.25、0.125、0.091 mg時，18F-Ta-Gluc-TOCA的標(biāo)記率分別為78%、、80%、75%、78%、40%。當(dāng)投料量為0.125 mg以上時，標(biāo)記率基本保持在75%至80%之間，投料量過小，標(biāo)記率會有明顯下降，為了提高標(biāo)記率，盡量減少化合物2的投料量，因此選擇化合物2用量0.125 mg。

3.2.2pH影響

在pH4、5、6、7、8時，18F-Ta-Gluc-TOCA標(biāo)記率分別為73%、75%、78%、80%、78%，標(biāo)記率基本穩(wěn)定。這也證實了點擊反應(yīng)對pH要求低的特點，為了維持多肽的活度，選取pH為6作為反應(yīng)條件。

3.3 體外穩(wěn)定性

18F-Ta-Gluc-TOCA體外穩(wěn)定性結(jié)果示于圖5。由圖5可知，18F-Ta-Gluc-TOCA的體外穩(wěn)定性較好。但是其穩(wěn)定性隨時間變化略有降低，這可能是由于18F與碳鏈的連接不穩(wěn)定，有少量18F離子脫下。

圖5 18F-Ta-Gluc-TOCA的體外穩(wěn)定性Fig.5 Stability of 18F-Ta-Gluc-TOCA in vitro

3.4 脂水分配系數(shù)

對18F-Ta-Gluc-TOCA進行親脂性實驗，測得其脂水分配系數(shù)為-0.43±0.05。說明18F-Ta-Gluc-TOCA的親水性得到了一定的提高，但相對18F-FP-Gluc-TOCA仍然較低。由于丙炔酸和2-18F疊氮乙烷增加了碳鏈長度，也在一定程度上降低了其親水性。

3.5 正常小鼠體內(nèi)生物分布

18F-Ta-Gluc-TOCA在正常小鼠體內(nèi)的生物分布結(jié)果列于表1。由表1可以看出，18F-Ta-Gluc-TOCA在正常小鼠體內(nèi)肝吸收最強，15 min時為11.85%ID·g-1，腎吸收為其次，15 min時為4.12%ID·g-1肝與腎放射性攝取比(T/NT)約為2.9∶1；該藥物主要通過肝臟代謝，其次通過腎代謝；在其他器官的攝取均較低，股骨有少量的攝?。桓髌鞴俚臄z取均隨著時間不斷下降，18F-Ta-Gluc-TOCA的血液清除較快。該藥物的肝吸收高主要是由于18F-Ta-Gluc -TOCA的結(jié)構(gòu)中加入了丙炔酸，同時在點擊反應(yīng)后又加入了2-18F-疊氮乙烷，導(dǎo)致其碳鏈較長，增加了其親脂性，使其主要通過肝臟代謝；該藥物在骨中有攝取主要是因為少量游離的18F-。

3.6 荷瘤裸鼠體內(nèi)生物分布

18F-Ta-Gluc-TOCA在荷AR42J瘤裸鼠體內(nèi)分布結(jié)果列于表2。由表2可以看出，18F-Ta-Gluc-TOCA在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布基本與正常小鼠體內(nèi)分布一致，在肝和腎有較高的攝取，在60 min時肝臟為3.28%ID·g-1，腎臟為2.41%ID·g-1，主要通過肝代謝，血液清除較快，在其他器官攝取較低。18F-Ta-Gluc-TOCA在腫瘤中的攝取較高，60 min時達到4.34%ID·g-1，在120 min時仍保持較高攝取。

18F-Ta-Gluc-TOCA在荷AR42J瘤裸鼠體內(nèi)分布的T/NT結(jié)果列于表3。由表3可以看出，腫瘤與肝臟、腎臟兩個主要的代謝器官的T/NT稍小；在120 min時的T/NT增大。T/NT隨時間而增大主要是由于18F-Ta-Gluc-TOCA 在120 min時腫瘤中的攝取仍然較高，下降不明顯，在組織或器官中的攝取均明顯降低，說明18F-Ta-Gluc-TOCA在腫瘤內(nèi)保留時間較長，在腫瘤中的高攝取使其有望用于生長抑素受體陽性腫瘤PET顯像。

表1 18F-Ta-Gluc-TOCA的正常小鼠體內(nèi)分布

表2 18F-Ta-Gluc-TOCA的荷瘤裸鼠體內(nèi)分布數(shù)據(jù)Table 2 Biodistribution of 18F-Ta-Gluc-TOCA in tumor bearing nude mice

腫瘤與器官T/NT60 min120 min腫瘤/心3.13±0.8113.28±3.18腫瘤/肝1.32±0.102.07±0.36腫瘤/肺3.47±0.887.94±2.30腫瘤/腎1.81±0.216.80±0.64腫瘤/胃3.64±0.956.21±2.14腫瘤/肌肉13.77±3.4313.62±2.33腫瘤/股骨2.83±0.292.98±0.77腫瘤/血3.56±0.4712.38±2.31

4 結(jié)論

本研究采用點擊化學(xué)法制備了18F標(biāo)記的奧曲肽類似物18F-Ta-Gluc-TOCA放化純度高，穩(wěn)定性較好，親水性得到了一定改善。18F-Ta-Gluc-TOCA在血液中清除較快；主要通過肝臟代謝，部分經(jīng)腎臟代謝，在其他器官或組織攝取均較低；在腫瘤中攝取較高，而且在120 min時仍有較高的攝取，18F-Ta-Gluc-TOCA在腫瘤中的高攝取可以使其成為一種較好的顯像劑。18F-Ta-Gluc-TOCA制劑在骨中有少量攝取，穩(wěn)定性有待提高；由于點擊化學(xué)反應(yīng)以及引入的丙炔酸結(jié)構(gòu)使其親脂性進一步增加，18F-Ta-Gluc-TOCA肝臟攝取較高，在以后的研究中可以對奧曲肽結(jié)構(gòu)進一步改進。

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