胸腹水癌細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)診斷的實(shí)踐與體會(huì)

梁華兵，盧興國

(1.浙江溫嶺市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，浙江溫嶺317502;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院血液科，浙江杭州310009)

胸腹水脫落腫瘤細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)診斷，長期來是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的弱項(xiàng)，其原因有三:其一為出版的相關(guān)專著絕大多數(shù)是用病理學(xué)方法和視角介紹的，不太適用于檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)診斷;其二是檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)(包括院校)對胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)診斷的基礎(chǔ)、技能教學(xué)(育)和培養(yǎng)的投入不足;其三是胸腹水腫瘤細(xì)胞學(xué)，即使同一病例標(biāo)本，常表現(xiàn)千姿百態(tài)形態(tài)，評估性診斷時(shí)，又需要一定的臨床和病理為基礎(chǔ)，故普遍性重視不夠。臨床上，惡性胸腹水中，最常見的是癌細(xì)胞侵犯，包括兒童患者［1］，但對胸腹水標(biāo)本送檢的要求、處理的方法、鏡檢的要求和形態(tài)學(xué)的把握等，文獻(xiàn)上報(bào)道的體會(huì)均有所不同［2～7］?，F(xiàn)將我們13年來的一些實(shí)踐探索與體會(huì)作一介紹。

一、材料和方法

1.病例 1999年1月至2011年10月浙江溫嶺市第二人民醫(yī)院住院患者，經(jīng)CT、B超和腫瘤標(biāo)志物或病理組織學(xué)和(或)脫落細(xì)胞學(xué)等檢查而明確診斷的惡性腫瘤患者，臨床最后匯總各項(xiàng)檢查而確診的癌性胸腹水939例。其中男504例、女435例，年齡34～89歲;肺腺癌浸潤450例，肺鱗癌20例，肺小細(xì)胞性癌13例，胃癌171例，卵巢癌111例，胰腺癌85例，肝癌25例，乳腺癌18例，大腸癌16例，其他癌癥轉(zhuǎn)移30例;胸腹水細(xì)胞學(xué)檢查找到癌細(xì)胞409例，陽性率為43.6%。

2.標(biāo)本處理 抽取的胸腹水由乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝劑塑料帶蓋標(biāo)識(shí)專用試管抗凝(容積11 mL)，常規(guī)標(biāo)本在0.5～1 h內(nèi)280×g離心5 min，離心后傾去上清液，推片或涂片，Wright-Giemsa混合染色和細(xì)胞免疫化學(xué)染色(SP法)［4］，晾干后鏡檢。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本放置時(shí)間和處理方法見結(jié)果。

3.觀察方法和形態(tài)學(xué)評判 觀察標(biāo)本不同的處理方法、推片量與涂片法、標(biāo)本放置時(shí)間、鏡檢方法和技巧以及掌握癌細(xì)胞形態(tài)對癌細(xì)胞檢出率的影響?；仡櫺杂^察的陽性標(biāo)本由2位專職學(xué)形態(tài)學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)師進(jìn)一步確認(rèn)。本實(shí)驗(yàn)室規(guī)定的幾個(gè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)定義或依據(jù)如下:細(xì)胞空泡形成是指胞質(zhì)有1個(gè)或多個(gè)空泡出現(xiàn)者，細(xì)胞退化是指細(xì)胞比正常為大并出現(xiàn)胞膜溶解和(或)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)模糊不清者;將細(xì)胞過大且胞核幼稚和畸形或胞質(zhì)染色渾厚者，核仁大而藍(lán)染者和核形異常者，類似造血原始細(xì)胞而胞質(zhì)偏位與囊泡和(或)小簇出現(xiàn)者，中大型細(xì)胞核背靠背或結(jié)對現(xiàn)象且胞質(zhì)異常者，中大型細(xì)胞組成團(tuán)狀、套疊現(xiàn)象和囊泡狀胞質(zhì)結(jié)構(gòu)者等，作為基本符合或提示癌細(xì)胞的依據(jù);將其中胞質(zhì)囊泡狀和(或)染色不均勻性、細(xì)胞嵌合狀和(或)套疊狀，以及上皮樣結(jié)構(gòu)(如腺管狀和較規(guī)則狀細(xì)胞聚集一起)形態(tài)特征者，作為進(jìn)一步評判基本符合或提示腺癌細(xì)胞的依據(jù);將間皮細(xì)胞樣、大或巨大而散在性分布的癌細(xì)胞，常有多變形胞質(zhì)和圈曲樣細(xì)胞團(tuán)或角化珠樣結(jié)構(gòu)者，作為進(jìn)一步評判基本符合或提示鱗癌細(xì)胞的依據(jù)。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 百分比數(shù)據(jù)，組間比較用SPSS12統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。中位數(shù)組間比較用秩和檢驗(yàn)。

二、結(jié)果

1.標(biāo)本處理方法對癌細(xì)胞檢出率的影響(1)留取細(xì)胞沉渣方法:標(biāo)本離心后去上清液有2種方法。習(xí)慣方法在離心后將試管內(nèi)上清液倒掉，試管內(nèi)殘留細(xì)胞液量平均達(dá)到100 μL甚至更多，制成的推片有核細(xì)胞往往不足。另一方法，是將經(jīng)過離心的試管管底細(xì)胞沉渣端向里，一手持離心管緩慢棄去上清液，至80℃ ～90℃左右保持30 s，另一手持棉球吸去殘液。使沉渣殘留量濃縮至平均50 μL以下。我們在開展胸腹水癌細(xì)胞檢驗(yàn)診斷的前7年，用前一方法處理臨床確診的411例癌性標(biāo)本，152例找到癌細(xì)胞檢出率為37.0%;而后6年采用后一方法制備標(biāo)本528例，257例找到癌細(xì)胞，檢出率48.7%，后組比前者提升較為明顯(χ2=12.85，P＜0.01);(2)推片標(biāo)本量:對39例臨床診斷的癌性標(biāo)本，分別制成3 μL和6 μL的普通推片和加厚推片，各3張。厚推片組17例(43.6%)找到癌細(xì)胞，而普通推片組找到癌細(xì)胞14例(35.9%，P＞0.05)，而癌細(xì)胞偶見(每張涂片＜3個(gè)癌細(xì)胞)者，厚片組和普通推片組分別為2例(11.8%)和5例(35.7%)，顯示加厚推片檢出癌細(xì)胞有若干優(yōu)勢;(3)標(biāo)本放置時(shí)間、溫度與細(xì)胞形態(tài):隨機(jī)留取15例病例的非低蛋白血癥漏出液，其中炎癥性10例、癌性5例。留置每一患者胸腹水6例標(biāo)本(6支專用試管)，分別在室溫下放置0.5、1、2、3、4 和 16 h，分次離心留取沉渣推片，觀察標(biāo)本放置時(shí)間長短對細(xì)胞形態(tài)的影響。結(jié)果為0.5～2 h內(nèi)處理的標(biāo)本，細(xì)胞形態(tài)幾乎一樣;有1例標(biāo)本至3 h時(shí)出現(xiàn)稍為明顯的核固縮和碎裂，至4h和16h明顯增多(表1)。空泡變性是胸腹水標(biāo)本中最常見變化，在不同標(biāo)本中空泡細(xì)胞懸殊(與標(biāo)本性質(zhì)有關(guān));間皮細(xì)胞和癌細(xì)胞空泡放置3 h和4 h時(shí)的主要變化時(shí)空泡增大，甚至出現(xiàn)氣球樣大空泡(圖1)。癌細(xì)胞和間皮細(xì)胞退化均少，放置16h后才見退化細(xì)胞增加。淋巴細(xì)胞變化最不明顯，多數(shù)標(biāo)本無異常形態(tài)，只2例見小空泡，退化細(xì)胞更少見，均不隨時(shí)間而發(fā)生明顯變化。在實(shí)驗(yàn)觀察的13例中，至16h時(shí)仍有5例(38.5%)標(biāo)本細(xì)胞形態(tài)與0.5h標(biāo)本無異(P＞0.05)。

表1 不同放置時(shí)間胸腹水對細(xì)胞形態(tài)的影響(中位數(shù)，范圍%)

圖1 胸腹水放置后的細(xì)胞形態(tài)變化

另隨機(jī)留取6例非低蛋白血癥漏出液，每例一分為二。1例及時(shí)處理，另1例放置4℃冰箱12 h時(shí)處理。結(jié)果為放置4℃冰箱12 h標(biāo)本與不放置4℃及時(shí)處理的標(biāo)本，均未見出現(xiàn)明顯的形態(tài)差異，包括細(xì)胞空泡(中位數(shù)37%與40%)、退化(中位數(shù)4%與4%)、核固縮和碎裂(1%與1%)，組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

三、討論

我們在實(shí)踐中體會(huì)到，尋找胸腹水癌細(xì)胞最重要的是找到其。因此，要提高癌細(xì)胞檢出率，濃縮細(xì)胞量的處理方法即是其中的一個(gè)因素。可通過多次離心的方法提高細(xì)胞量［8］，但這需要較多的標(biāo)本量和抗凝問題，并增加操作步驟。我們用11 mL專用試管容積量，離心后，在傾去上清液的方法上做了調(diào)整，即試管傾斜80℃ ～90℃ 30 s并用一顆棉球吸去過多的余液，達(dá)到了濃縮細(xì)胞量的一個(gè)重要步驟，可使沉淀的殘余液量比一般方法減少一半以上，同時(shí)又因細(xì)胞增加而容易制備滿意的推片。此外，增加每一推片的量又是其中的一個(gè)因素。相對而言，標(biāo)本中細(xì)胞越多越容易檢出癌細(xì)胞，包括對檢出癌細(xì)胞數(shù)量和檢查費(fèi)時(shí)的影響。我們將推片量由3 μL提高到6 μL，對個(gè)別癌細(xì)胞特別少的標(biāo)本有明顯影響。所以我們規(guī)定體液脫落細(xì)胞學(xué)檢查制成的推片以厚片為佳，但必需有尾部。反復(fù)的實(shí)踐表明，5～6 μL的加厚推片尾部區(qū)域，細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本清晰。經(jīng)離心濃縮的加厚推片有3個(gè)優(yōu)點(diǎn):聚集大細(xì)胞于局部，檢查費(fèi)時(shí)少和易于找到并進(jìn)一步評判癌細(xì)胞的上皮組織來源。推片的標(biāo)本量中，還需考慮其中的紅細(xì)胞過多對癌細(xì)胞檢出的影響。紅細(xì)胞明顯增多時(shí)，常因離心后厚厚的紅細(xì)胞層而影響殘留細(xì)胞液量或所要求吸取白細(xì)胞層的細(xì)胞。此時(shí)，應(yīng)將紅細(xì)胞去除，可往離心管內(nèi)加入適量的低滲氯化鉀溶液(48 g/L氯化鉀溶液)，破壞紅細(xì)胞，再次離心后取沉淀物制片。也可用其他方法去除過多的紅細(xì)胞［2］。

在胸腹水細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)中，人們普遍關(guān)注的是細(xì)胞退化造成對診斷的影響，故要求胸腹水標(biāo)本盡可能新鮮，但在送檢的時(shí)間上尚缺乏一致的認(rèn)識(shí)，可能也與缺乏一定的實(shí)驗(yàn)有關(guān)。我們將標(biāo)本放置不同時(shí)間后觀察表明，標(biāo)本放置后，可觀察到細(xì)胞空泡、退化、核碎裂和固縮形態(tài)的增加或發(fā)生。但通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)放置2 h內(nèi)處理的標(biāo)本幾乎不對細(xì)胞形態(tài)產(chǎn)生影響(前后形態(tài)幾乎一致)，少數(shù)標(biāo)本(1/13)在放置3h時(shí)出現(xiàn)核固縮和核碎裂增多，一部分標(biāo)本(3/13)至4h出現(xiàn)細(xì)胞空泡增大和(或)增多。胸腹水標(biāo)本真正的細(xì)胞退化只是一部分，較多的細(xì)胞形態(tài)改變都在標(biāo)本獲得時(shí)就存在，因此，加強(qiáng)對不同病理狀態(tài)下的細(xì)胞形態(tài)識(shí)別十分重要。而且不同標(biāo)本中的形態(tài)異常差異十分明顯，也有部分是由于推片機(jī)械性因素造成的類似退化性變化(細(xì)胞過度攤開)，后者與血片尾部細(xì)胞的部分形態(tài)變化一樣。在同一張標(biāo)本中，當(dāng)部分區(qū)域細(xì)胞退化而部分區(qū)域細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰時(shí)，就可以評判為假性細(xì)胞退化。最容易發(fā)生空泡的是中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞，但他們通常對腫瘤細(xì)胞的形態(tài)鑒別不產(chǎn)生影響。最不易發(fā)生形態(tài)變化的是淋巴細(xì)胞，其很少出現(xiàn)空泡和退化，但淋巴細(xì)胞(尤其是腫瘤性)過多時(shí)則可在尾部出現(xiàn)涂抺細(xì)胞(推片所致機(jī)械性形變，個(gè)別標(biāo)本很多)。最易發(fā)生退化的是間皮細(xì)胞和癌細(xì)胞，也是最易造成混淆者，而且放置后兩者的形態(tài)變化類似，這才需要加強(qiáng)區(qū)別的。我們認(rèn)為對形態(tài)學(xué)的把握是最重要的，癌細(xì)胞胞體和胞核多不規(guī)則、細(xì)胞大多大而異形或成簇、核仁大多大而明顯、胞質(zhì)多為豐富而染色不均，當(dāng)癌細(xì)胞退化時(shí)仍會(huì)留有明顯的惡性形態(tài)特點(diǎn)，尤其是胞核的畸形和大核仁，而退化的間皮細(xì)胞形態(tài)幾乎與此相反，或顯示出明顯的不典型性改變，此外，還可結(jié)合細(xì)胞免疫化學(xué)染色作出鑒別。影響胸腹水標(biāo)本細(xì)胞學(xué)改變的因素很多，除了人為影響外，有體液營養(yǎng)成分、體液滲透壓與病因(肝硬化和腎病所致的漏出性胸腹水細(xì)胞很容易發(fā)生細(xì)胞退化和機(jī)械性形變)、體液細(xì)胞量和實(shí)驗(yàn)試管中標(biāo)本量(標(biāo)本量少易于形變)、溫度、試管的不同材質(zhì)(玻璃的易于細(xì)胞變化)等，而普遍關(guān)注的放置時(shí)間因素僅是其中之一。我們認(rèn)為臨床抽吸胸腹水后，用EDTA-K2抗凝劑塑料帶蓋標(biāo)識(shí)專用試管抗凝的標(biāo)本，在2 h內(nèi)送到實(shí)驗(yàn)室并及時(shí)處理，可以作為胸腹水細(xì)胞學(xué)送檢時(shí)間的規(guī)范要求。臨床上，會(huì)遇到夜間抽吸的胸腹水需要送檢。對此，我們還觀察了4℃保存標(biāo)本對細(xì)胞形態(tài)的影響，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)前、后無明顯的細(xì)胞學(xué)改變，認(rèn)為對臨床來不及送檢的夜間標(biāo)本(專用試管盛放)，置于4℃冰箱次日及時(shí)送檢和處理。

鏡檢標(biāo)本區(qū)域?qū)φ业桨┘?xì)胞的時(shí)間有影響，低倍和油鏡是鏡檢的兩個(gè)重要“武器”。鏡檢時(shí)先用低倍尋找可疑細(xì)胞而后轉(zhuǎn)到油鏡下確認(rèn)，可以提高癌細(xì)胞的檢出效率。低倍巡視除了尾部區(qū)域外，對推片邊端和頭部區(qū)域，也同樣需要重視。推片的體部通常不予考慮，因此，部位厚而細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，雖可檢出異常細(xì)胞但常不易評判，這也是部分病理細(xì)胞學(xué)診斷中用涂(抺)片法陽性率低的原因。此外，我們規(guī)定對細(xì)胞少見的標(biāo)本和陰性標(biāo)本，必須檢查所有染色的標(biāo)本張數(shù)，至少3張;對臨床高度提示的病例，需要染色更多的標(biāo)本并更仔細(xì)地用低倍尋找的鏡檢方法。細(xì)胞免疫化學(xué)染色有較好的參考價(jià)值，建議有條件的科室盡量同步開展，有助于細(xì)胞學(xué)作出進(jìn)一步的評估［9］。

［1］Pradhan SB，Pradhan B，Dali S.Cytology of body fluids from different sites:an approach for early diagnosis of malignancy［J］.JNMA J Nepal Med Assoc，2006，45(164):353-356.

［2］支喜蘭.血性胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢查涂片方法的比較［J］.診斷病理學(xué)雜志，2003，10(1):49-50.

［3］叢玉隆.實(shí)用檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)［J］.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:304-315.

［4］羅玉琴，盧興國.胸腹水脫落細(xì)胞學(xué)檢驗(yàn)質(zhì)量管理的初步體會(huì)［J］.臨床檢驗(yàn)雜志，2005，23(5):396-397.

［5］范賢斌，徐 志，邵 鳳.胸腹水細(xì)胞學(xué)檢查在良惡性積液中的應(yīng)用及體會(huì)［J］.中國鄉(xiāng)村醫(yī)學(xué)，2005，12(1):51-52.

［6］許成英.提高胸腹水細(xì)胞學(xué)檢查陽性率方法探討［J］.浙江腫瘤，2000，24(1):62-63.

［7］曹 敏，魏紅權(quán)，陳培輝.477例擬診癌癥患者胸腹水細(xì)胞學(xué)診斷探討［J］.實(shí)用腫瘤雜志，2003，18(4):304-305.

［8］趙中華，劉 艷，林 云，等.二步離心法在漿膜腔積液常規(guī)細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查中的應(yīng)用［J］.江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2007，25(1):70.

［9］黃衛(wèi)彤，覃志堅(jiān)，潘興壽，等.胸腹水細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)制片的免疫細(xì)胞化學(xué)診斷對比研究［J］.江西醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)，2006，24(1):17-18.