金針菇多糖對(duì)運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠免疫水平影響的研究

田雪文，黃 超，劉 倩，何 明

(1.山東省體育科學(xué)研究中心，山東 濟(jì)南 250102;2.山東體育學(xué)院，山東 濟(jì)南 250063)

運(yùn)動(dòng)性疲勞是由運(yùn)動(dòng)引發(fā)的不可避免的生理現(xiàn)象，疲勞物質(zhì)在體內(nèi)積累，乳酸和蛋白質(zhì)分解物存留在體內(nèi)，導(dǎo)致體內(nèi)肌酸激酶、尿素氮等有所增加，SOD 活性增強(qiáng)，而睪酮、血紅蛋白含量有所下降［1－2］。運(yùn)動(dòng)性疲勞時(shí)會(huì)出現(xiàn)免疫功能紊亂，運(yùn)動(dòng)平衡失調(diào)，感染感冒、胃腸道等疾病的幾率大大增加，影響運(yùn)動(dòng)員比賽成績(jī)。過(guò)度運(yùn)動(dòng)后機(jī)體運(yùn)動(dòng)免疫力下降是影響運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練效果和運(yùn)動(dòng)員身體健康的一個(gè)重要因素。

金針菇(Flarnmulina velutipes)又名毛柄金錢菌、樸菇、冬菇。金針菇子實(shí)體由細(xì)長(zhǎng)而質(zhì)嫩的菌柄和形似銅錢的菌蓋組成，呈乳白色或金黃色，其蓋滑、柄脆，是目前人工栽培較為廣泛的食用菌之一。金針菇中含有豐富的多糖物質(zhì)，是金針菇的主要活性成分。給大白鼠灌胃金針菇多糖溶液后，會(huì)增強(qiáng)T 細(xì)胞功能，促進(jìn)抗體產(chǎn)生，增強(qiáng)抗氧化作用，增強(qiáng)抗癌能力，通過(guò)恢復(fù)和提高免疫力方法來(lái)達(dá)到抑制腫瘤的目的［3－4］。本研究通過(guò)補(bǔ)充金針菇多糖，揭示金針菇多糖影響運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠各項(xiàng)血清指標(biāo)的變化以及疲勞消除的效果，從而為進(jìn)一步消除運(yùn)動(dòng)員疲勞提供理論依據(jù)，對(duì)現(xiàn)代競(jìng)技體育的發(fā)展有積極的現(xiàn)實(shí)意義。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選用7 周齡雌性健康純種Sprague－Dawley(SD)大鼠30 只，體重160 ～190 克，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供(質(zhì)量合格證號(hào):SCXK 京2012－0001)。分籠飼養(yǎng)，每籠3 ～4 只大鼠，顆粒飼料喂養(yǎng)，自由飲食、飲水，室溫22±2℃，相對(duì)濕度40%～60%，12 小時(shí)光照，每日換墊料一次。

1.2 金針菇多糖的提取

應(yīng)用傳統(tǒng)水提法提取金針菇多糖:溫度90 ℃、浸提時(shí)間4 h、料液比1:30、提取2 次、PH7 為提取金針菇多糖的最佳工藝條件。向糖液中加入氯仿－正丁醇溶液(5:1)去除蛋白以純化多糖，金針菇多糖提取率達(dá)1.63%。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

SD 大鼠按照本實(shí)驗(yàn)要求隨機(jī)分為空白對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、金針菇組3 組，每組10 只。

空白對(duì)照組:置于籠中自然生長(zhǎng)，不參加跑臺(tái)訓(xùn)練。

運(yùn)動(dòng)對(duì)照組:依照本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的運(yùn)動(dòng)疲勞模型，進(jìn)行跑臺(tái)訓(xùn)練，并在跑臺(tái)訓(xùn)練后即刻灌胃與金針菇組相同劑量的0.9%生理鹽水。

金針菇組:依照本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的運(yùn)動(dòng)疲勞模型，進(jìn)行跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，并在每次跑臺(tái)訓(xùn)練后即刻灌胃2 ml 金針菇多糖水溶制劑(按照150 mg/kg 體重計(jì)算)。

1.4 運(yùn)動(dòng)方案

根據(jù)圖4液壓泵消耗功率可得:無(wú)動(dòng)態(tài)規(guī)劃優(yōu)化,液壓泵消耗的功率主要集中在[2.5×104,4.0× 104] W之間,最大消耗功率為6.1×104 W;有動(dòng)態(tài)規(guī)劃優(yōu)化后,液壓泵消耗的功率主要集中在[1.0×104,2.0×104] W之間,最大消耗功率為4.9×104 W.采用動(dòng)態(tài)規(guī)劃優(yōu)化后的液壓冗余機(jī)械臂,其消耗的功率較小,運(yùn)動(dòng)相對(duì)平穩(wěn).

1)環(huán)境適應(yīng):大鼠購(gòu)入以后在動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)2 天，以便適應(yīng)動(dòng)物房環(huán)境;

2)跑臺(tái)適應(yīng):第3 ～6 天讓大鼠做適應(yīng)跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)，跑臺(tái)速度為15 m/min，時(shí)間為10 min。大鼠跑臺(tái)訓(xùn)練持續(xù)9 周，每周訓(xùn)練6 天，周日休息。

本研究在大鼠完成適應(yīng)性訓(xùn)練后，采用上海體育學(xué)院陳佩杰、王茹［5］等人的跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)模型進(jìn)行訓(xùn)練，大鼠的運(yùn)動(dòng)負(fù)荷遞增，第7 周開(kāi)始訓(xùn)練至力竭。力竭判斷標(biāo)準(zhǔn)，動(dòng)物跟不上預(yù)定速度，大鼠臀部壓在籠具后壁，后肢隨轉(zhuǎn)動(dòng)皮帶后拖達(dá)30 s，連續(xù)的光、聲、機(jī)械刺激驅(qū)趕無(wú)效;行為特征表現(xiàn)為呼吸深急、幅度大，精神疲憊，俯臥位垂頭，刺激后無(wú)反應(yīng)［6－7］。具體的跑臺(tái)訓(xùn)練負(fù)荷見(jiàn)表1。

表1 大鼠遞增運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的訓(xùn)練計(jì)劃

1.5 血液指標(biāo)檢測(cè)

分別在大鼠訓(xùn)練1 周、3 周、9 周后36 小時(shí)眼眶后靜脈叢取血，經(jīng)過(guò)9 周遞增負(fù)荷模型運(yùn)動(dòng)后，恢復(fù)一周，在第10 周對(duì)大鼠腹腔注射1%的戊巴比妥(1 ml/100g 體重)麻醉，使用肝素真空采血針抽取腹主靜脈血。取血0.2 ml 置于含抗凝劑的EP 管內(nèi)，檢測(cè)全血白細(xì)胞(WBC)、血紅蛋白(Hb);取血1 ml 置于試管內(nèi)，經(jīng)過(guò)3 500 rpm 離心15 min 后取血清，檢測(cè)肌酸激酶(CK)、血清尿素氮(BUN)、睪酮(T)等指標(biāo)。

1.6 Real－time PCR 檢測(cè)mRNA 水平表達(dá)情況

應(yīng)用Invitrogen 試劑盒提取T 淋巴細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，放在－20°C 備用。應(yīng)用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物引物由上海生工生物工程公司合成:GAPDH 上游引物5，－CCCTCAATGACCACTTTGTG－3，GAPDH 下游引物5，－GGTTTGAGGGCTCTTACTCC T－3，T－bet 上游引物:5，－CCTGCTGGACGACAATG G－3，T－bet 下游引物:5，TCTGGTAGGCGGTGACTG－3，GATA－3 上游引物:5，－AAGAGTGCCTCAAGTA TCAG－3，GATA－3 下游引物:5，GCGGATAGGTGGT AATGG－3。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 白細(xì)胞的變化情況

白細(xì)胞是一種含有多種細(xì)胞功能活性的細(xì)胞，它能保護(hù)機(jī)體免受病原微生物的侵害，常作為觀察運(yùn)動(dòng)員免疫作用的有效指標(biāo)，在運(yùn)動(dòng)、寒冷及炎癥等，白細(xì)胞數(shù)量會(huì)明顯增加。9 周運(yùn)動(dòng)大鼠空白對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、金針菇組，在運(yùn)動(dòng)第1 周、第3 周、第9 周、第10 周后白細(xì)胞的變化見(jiàn)表2。第3 周，運(yùn)動(dòng)模型組和金針菇組數(shù)據(jù)顯示白細(xì)胞在運(yùn)動(dòng)后出現(xiàn)一過(guò)性增高。運(yùn)動(dòng)模型組第9 周比空白對(duì)照組白細(xì)胞顯著降低(P＜0.01)，比第1 周、第3 周白細(xì)胞降低(P ＜0.05)，第10 周下降更大。金針菇組第9 周和第10 周白細(xì)胞水平和空白對(duì)照沒(méi)有差異，但是和運(yùn)動(dòng)模型組顯著升高。通過(guò)實(shí)驗(yàn)可以看到金針菇具有良好維持白細(xì)胞水平的作用，起到提高機(jī)體免疫力的效果。

表2 各組大鼠白細(xì)胞變化(*109 個(gè)/L)

2.2 血紅蛋白變化情況

血紅蛋白是運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度和運(yùn)動(dòng)量常用測(cè)試指標(biāo)。9周運(yùn)動(dòng)大鼠空白對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、金針菇組在運(yùn)動(dòng)第1 周、第3 周、第9 周、第10 周后血紅蛋白的變化見(jiàn)表3。結(jié)果表明運(yùn)動(dòng)對(duì)照組在第9 周、第10 周時(shí)血紅蛋白顯著降低(P ＜0.01)，金針菇組在第9 周時(shí)血紅蛋白也有顯著下降(P ＜0.01)，但是比運(yùn)動(dòng)模型組有顯著提高(P ＜0.01)。金針菇組在第10 周時(shí)血紅蛋白比空白對(duì)照組降低(P ＜0.05)，但是比運(yùn)動(dòng)模型組有顯著提高(P ＜0.01)。由此可見(jiàn)，金針菇能顯著提高運(yùn)動(dòng)疲勞后的血紅蛋白水平。

表3 各組大鼠血紅蛋白變化(g/L)

2.3 肌酸激酶變化情況

9 周運(yùn)動(dòng)大鼠空白對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、金針菇組在運(yùn)動(dòng)第1 周、第3 周、第9 周、第10 周后肌酸激酶的變化見(jiàn)表4。運(yùn)動(dòng)對(duì)照組在第9 周時(shí)肌酸激酶比第3周顯著升高(P ＜0.05)，比起空白對(duì)照組顯著升高(P＜0.01)，提示有運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生。金針菇組第九周肌酸激酶和空白對(duì)照組沒(méi)有顯著性差異，比運(yùn)動(dòng)模型組顯著降低(P ＜0.01)?？瞻讓?duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、金針菇組3 組第10 周比第1 周、第3 周、第9 周具有降低(P ＜0.05)，而且金針菇組比空白對(duì)照組有顯著降低(P ＜0.01)，比運(yùn)動(dòng)模型組有降低(P ＜0.05)。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析金針菇具有顯著降低肌酸激酶、降低疲勞的作用。

表4 各組大鼠肌酸激酶變化(u/l)

2.4 尿素氮變化情況

尿素氮可以作為反映機(jī)體疲勞程度和機(jī)能狀態(tài)的重要指標(biāo)。空白對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、金針菇組在運(yùn)動(dòng)第1 周、第3 周、第9 周、第10 周后的變化見(jiàn)表5。運(yùn)動(dòng)對(duì)照組在第3、第9 周時(shí)比空白對(duì)照組尿素氮顯著升高(P ＜0.01)，提示有運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生。金針菇組比運(yùn)動(dòng)對(duì)照組在第3 周、第9 周、第10 周時(shí)均能顯著降低尿素氮(P ＜0.01)，表明金針菇組具有明顯的幫助消除疲勞，促進(jìn)機(jī)體恢復(fù)的作用。

表5 各組大鼠尿素氮變化(mmol/L)

2.5 睪酮變化情況

測(cè)定血清睪酮值對(duì)于評(píng)價(jià)訓(xùn)練負(fù)荷及機(jī)能狀態(tài)，有著重要的意義?？瞻讓?duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、金針菇組在運(yùn)動(dòng)第1 周、第3 周、第9 周、第10 周后的變化見(jiàn)表6。運(yùn)動(dòng)對(duì)照組在第9 周時(shí)睪酮顯著降低(P ＜0.01)，提示有運(yùn)動(dòng)疲勞產(chǎn)生。金針菇組對(duì)比空白對(duì)照組在第九周時(shí)睪酮數(shù)值略有降低，但是比起運(yùn)動(dòng)對(duì)照組能顯著提高(P ＜0.05)。第10 周時(shí)，金針菇組睪酮比起運(yùn)動(dòng)對(duì)照組有顯著提高(P ＜0.05)。結(jié)果表明金針菇提高睪酮值，具有一定的維持機(jī)體雄激素代謝水平的作用。

表6 各組大鼠睪酮變化情況(ng/dL)

2.6 T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 變化情況

T－bet 和GATA－3 是T 淋巴細(xì)胞分化特異性轉(zhuǎn)錄因子?？瞻讓?duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、金針菇組在運(yùn)動(dòng)第九周T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 變化見(jiàn)表7。通過(guò)數(shù)據(jù)對(duì)比可以看到，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組T－bet mRNA 和GATA－3 mRNA 的表達(dá)對(duì)比空白對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，金針菇組T－bet mRNA 和GATA－3 mRNA 對(duì)比空白對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)對(duì)照組均有顯著降低(P ＜0.05)。

空白對(duì)照組、運(yùn)動(dòng)對(duì)照組、金針菇組在運(yùn)動(dòng)第十周T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 變化見(jiàn)表8。通過(guò)數(shù)據(jù)對(duì)比可以看到，運(yùn)動(dòng)對(duì)照組T－bet mRNA 和GATA－3 mRNA 的表達(dá)對(duì)比空白對(duì)照組顯著升高(P ＜0.01)，金針菇組T－bet mRNA 和GATA－3 mRNA 對(duì)比運(yùn)動(dòng)對(duì)照組顯著降低(P ＜0.01)。

表7 過(guò)度運(yùn)動(dòng)第9 周T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 變化情況

通過(guò)表7 和表8，金針菇在第9 周和第10 周Tbet mRNA、GATA－3 mRNA 的變化可以看出:金針菇組在第9 周時(shí)T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 比空白對(duì)照組和運(yùn)動(dòng)對(duì)照組均降低，而第10 周時(shí)金針菇組T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 比運(yùn)動(dòng)對(duì)照組顯著降低，但是和空白對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，接近空白對(duì)照水平。由此可見(jiàn)，金針菇具有較好的維持T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 的接近正常水平的作用，對(duì)于維持T淋巴細(xì)胞免疫平衡具有重要作用。

表8 過(guò)度運(yùn)動(dòng)第10 周T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 變化情況

3 討論

目前關(guān)于Th1/Th2 平衡與相關(guān)疾病的聯(lián)系已成為醫(yī)學(xué)界的研究熱點(diǎn)，但是關(guān)于運(yùn)動(dòng)性免疫抑制與Th1/Th2 免疫平衡之間關(guān)系的研究卻非常少。王茹［8］等建立了大鼠脾臟淋巴細(xì)胞中Th1/Th2 型淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)的固相酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)技術(shù)檢測(cè)方案，比較了Th1/Th2 淋巴細(xì)胞和CD4+/CD8+在大鼠遞增負(fù)荷過(guò)度訓(xùn)練過(guò)程中的改變情況，也有一些運(yùn)動(dòng)與免疫關(guān)系研究進(jìn)展的綜述［9］，但關(guān)于過(guò)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致T 淋巴細(xì)胞Th1/Th2 失衡與運(yùn)動(dòng)性免疫抑制關(guān)系的分子機(jī)制的報(bào)道非常少見(jiàn)。

Th1/Th2 的分化受特異性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，轉(zhuǎn)錄因子T－bet 和GATA－3 在靜息CD4+T 細(xì)胞向Th1型和Th2 型細(xì)胞分化和發(fā)生中起關(guān)鍵作用［10］。Tbet 是Th1 細(xì)胞分化的特異性轉(zhuǎn)錄因子，GATA－3 是Th2 細(xì)胞分化特異性轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控幼稚CD4+T 細(xì)胞向Th2 型分化，可使發(fā)育中的Th1 細(xì)胞反轉(zhuǎn)為Th2表型［11］。

T－bet 為轉(zhuǎn)錄因子T－box 家族成員，可部分通過(guò)激活Th1 型標(biāo)志型細(xì)胞因子IFN－γ 的表達(dá)使CD4+T 細(xì)胞分化為Th1 型細(xì)胞［12］。T－bet 的表達(dá)與IFNγ 的表達(dá)呈正相關(guān)，而在Th2 細(xì)胞中不表達(dá)，將T－bet轉(zhuǎn)染至完全分化的Th2 細(xì)胞核中，能使這些細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ 并同時(shí)抑制IL－4 和IL－5 生成。T－bet 基因表達(dá)的強(qiáng)弱直接影響T 細(xì)胞向Th1 或Th2 型的分化，目前已經(jīng)成為調(diào)節(jié)Th1/Th2 分化及建立新的免疫平衡的重要靶點(diǎn)。

GATA－3 屬于GATA 轉(zhuǎn)錄因子家族，特異性表達(dá)于Th2 細(xì)胞，Agnello 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，在Th2 細(xì)胞中，用染色質(zhì)免疫沉淀法證明GATA－3 結(jié)合于遠(yuǎn)側(cè)3’端的增強(qiáng)子。實(shí)驗(yàn)表明，GATA－3 可提高IL－4 啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，反義基因抑制這一過(guò)程［14］;用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將GATA－3 轉(zhuǎn)入成熟的Th1 細(xì)胞時(shí)不能引起IL－4 生成。GATA－3 促進(jìn)IL－4 基因表達(dá)的具體機(jī)制存在爭(zhēng)議。普遍認(rèn)為GATA－3 通過(guò)3 種不同的機(jī)制促進(jìn)Th2 效應(yīng)［15］:1)促進(jìn)Th2 細(xì)胞因子的生成;2)Th2 細(xì)胞選擇性生長(zhǎng);3)抑制Th1 細(xì)胞特異性因子。

本實(shí)驗(yàn)中九周過(guò)度運(yùn)動(dòng)大鼠血紅蛋白顯著降低、肌酸激酶和尿素氮顯著升高，睪酮顯著降低，這些表明過(guò)度運(yùn)動(dòng)大鼠疲勞程度較高。在大強(qiáng)度訓(xùn)練(或大運(yùn)動(dòng)量訓(xùn)練)的動(dòng)物與人體模型中，訓(xùn)練后T1 細(xì)胞的數(shù)量和功能均受到抑制，該抑制作用可持續(xù)7 天［16］，因此，我們又繼續(xù)檢測(cè)了運(yùn)動(dòng)第十周的各項(xiàng)指標(biāo)。通過(guò)運(yùn)動(dòng)1 周、3 周、9 周和10 周后血液指標(biāo)的檢測(cè)得出金針菇能維持良好的白細(xì)胞水平，顯著提高過(guò)度運(yùn)動(dòng)大鼠的血紅蛋白和睪酮，降低肌酸激酶和尿素氮，提高機(jī)體免疫力，促進(jìn)運(yùn)動(dòng)疲勞恢復(fù)。第10 周時(shí)金針菇組T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 比運(yùn)動(dòng)對(duì)照組顯著降低，但是和空白對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，金針菇能較好的維持T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 的水平接近正常水平。關(guān)于轉(zhuǎn)錄因子T－bet、GATA－3 在T 淋巴細(xì)胞及Th1/Th2 平衡中的作用及具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

4.1 金針菇能顯著提高運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠的白細(xì)胞，血紅蛋白和睪酮水平，具有較好的提高運(yùn)動(dòng)能力，增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用。

4.2 金針菇能顯著降低運(yùn)動(dòng)疲勞大鼠肌酸激酶、尿素氮，幫助大鼠在過(guò)度運(yùn)動(dòng)后消除疲勞，恢復(fù)體能。

4.3 金針菇能使運(yùn)動(dòng)大鼠第10 周T－bet mRNA、GATA－3 mRNA 接近空白對(duì)照水平，對(duì)維持Th1/Th2處于平衡狀態(tài)起到一定作用。

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