砷與農(nóng)藥草甘膦、敵敵畏對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合毒性

王云彪，李潤琴，鄧茗芩，李鑄衡，徐鏡波

1.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 濕地生態(tài)與環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春130102

2.吉林省電力科學(xué)研究院有限公司，長春130021

3.東北師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程系，長春130024

砷(As)是常見的致癌污染物之一，砷的毒理作用會隨環(huán)境介質(zhì)改變而發(fā)生變化[1]。環(huán)境中污染物的種類和數(shù)量不斷增加，使得在許多類型的生態(tài)系統(tǒng)中以更大概率存在著一種以上的污染物[2]。隨著農(nóng)用化學(xué)品的大量使用，自然生態(tài)系統(tǒng)中存在無機(jī)污染物和農(nóng)藥復(fù)合污染的風(fēng)險[3]，土壤及地下水中由砷污染引發(fā)的環(huán)境問題已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注，而在農(nóng)田土壤和受面源污染的水體中，砷污染并非獨(dú)立存在，常常伴隨著砷與典型農(nóng)藥的復(fù)合污染[4]。農(nóng)藥與無機(jī)污染物的復(fù)合污染效應(yīng)包括農(nóng)藥與無機(jī)物之間復(fù)雜的交互作用和聯(lián)合毒性[5-6]，其生物學(xué)響應(yīng)是一個矢量[7]，復(fù)合污染研究是當(dāng)下環(huán)境毒理學(xué)和污染生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。

有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphate，簡稱Ops)是當(dāng)今農(nóng)藥中的主要類別[8]。草甘膦(GPS)為廣譜性有機(jī)磷除草劑，是世界上應(yīng)用最廣，產(chǎn)量最大的農(nóng)藥品種[9－10]。敵敵畏(DDVP)是一種應(yīng)用最為廣泛的有機(jī)磷殺蟲劑，已被確認(rèn)為外源性擾亂內(nèi)分泌化學(xué)物質(zhì)[11-12]。目前研究較多的是砷與敵敵畏的環(huán)境化學(xué)行為和單一污染毒性，已在基因和蛋白水平進(jìn)行了生物標(biāo)志物篩選;而草甘膦的生態(tài)風(fēng)險尚待揭示[4,13]。污染物的聯(lián)合暴露毒性研究從無機(jī)物之間、有機(jī)物之間的研究，擴(kuò)展到現(xiàn)實(shí)環(huán)境中有機(jī)－無機(jī)物聯(lián)合暴露毒性評價，而秀麗隱桿線蟲因其遺傳背景、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路清楚，行為和分子指標(biāo)豐富，以及具有實(shí)踐前景等優(yōu)勢，被越來越廣泛地應(yīng)用到污染物的聯(lián)合暴露毒性評價研究中[14]。線蟲被廣泛用作環(huán)境污染的指示生物[8,15]。而秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)已被廣泛用作模式生物進(jìn)行毒理學(xué)研究[16－17]。

本研究利用模式生物秀麗隱桿線蟲探討砷與典型農(nóng)藥復(fù)合污染的毒理作用模式，為深入和細(xì)致探討典型無機(jī)－有機(jī)復(fù)合脅迫的毒理效應(yīng)和相互作用模式，提供了模式材料和判定方法參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生型秀麗隱桿線蟲(C.elegans)N2 株由美國線蟲種質(zhì)中心提供，使用涂有大腸桿菌(Escherichia coli OP50)的NGM 培養(yǎng)基，在20℃下的生化培養(yǎng)箱中同步化培養(yǎng)。用KCl 和0.051 mol·L－1NaCl)作為母液配制合理濃度的亞砷酸鈉(NaAsO2，分析純，Sigma 生產(chǎn))、草甘膦(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為41%的草甘膦異丙胺鹽水劑，安徽豐樂農(nóng)化有限責(zé)任公司生產(chǎn))和敵敵畏(體積分?jǐn)?shù)為77.5%的敵敵畏乳油溶液)，湖南南天實(shí)業(yè)股份有限公司生產(chǎn))染毒液，加于24 孔板中待用，每孔0.5 mL，每組3個平行。

1.2 LC50的計算

將秀麗隱桿線蟲年輕成蟲在不同濃度的染毒液中培養(yǎng)24 h 后計算死亡數(shù)，根據(jù)各個濃度的存活率，以直線內(nèi)插法推導(dǎo)做出回歸曲線，并計算出該毒物對秀麗隱桿線蟲的24 h 半數(shù)致死濃度LC50。再按經(jīng)驗(yàn)公式求出安全濃度:農(nóng)藥安全濃度=24 h－LC50×0.1。敵敵畏密度為1.415 g·L－1(25℃)。

1.3 復(fù)合脅迫方式判定

根據(jù)獲得的每種毒物24 h－LC50值，將亞砷酸鈉、草甘膦和敵敵畏脅迫強(qiáng)度分別設(shè)置為LC50值的1/5(1/5 LC50)，LC50值的1/2(1/2 LC50)，LC50值，作為各種毒物的濃度，計算2 種物質(zhì)所需的濃度和體積配成等毒性溶液，進(jìn)行亞砷酸鈉與草甘膦，亞砷酸鈉與敵敵畏的聯(lián)合毒性效應(yīng)實(shí)驗(yàn);同時設(shè)置空白對照組，每個脅迫強(qiáng)度設(shè)置3 個重復(fù)，每一脅迫強(qiáng)度下放置10 條處于壯年(young adult)階段線蟲，染毒24 h 后在顯微鏡下觀察每組線蟲死亡數(shù)。綜合等效應(yīng)線圖法、相加指數(shù)法和Finney 法[18－19]，若2 種毒物單一脅迫下秀麗隱桿線蟲死亡率之和大于聯(lián)合毒性，即為拮抗效應(yīng);若2 種毒物單一毒性之和小于聯(lián)合毒性，即為協(xié)同效應(yīng);若2 種毒物單一毒性之和等于聯(lián)合毒性，則為相加作用。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 12 軟件分析，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來表示。LC50計算中，先將脅迫濃度轉(zhuǎn)換為對數(shù)值進(jìn)行毒力回歸分析，并統(tǒng)計標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 3 種污染物對秀麗隱桿線蟲單一毒性

單一脅迫下，砷、草甘膦及敵敵畏對野生型秀麗隱桿線蟲N2 株的24 h 毒性分析如表1 所示。研究結(jié)果表明，這3 種毒物對秀麗隱桿線蟲都表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性。As 表現(xiàn)出重金屬的毒性特征，其對秀麗隱桿線蟲24 h－LC50值與Pb、Cr 相近[15]。敵敵畏作為典型殺蟲劑，對秀麗隱桿線蟲表現(xiàn)出極強(qiáng)的毒性作用，其安全 濃度為0.47 μg·L－1，而中國(GHZB1—1999)地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(I、II、III 類水域)規(guī)定敵敵畏濃度上限為0.1 μg·L－1。特別指出的是，草甘膦作為一種有機(jī)磷除草劑，對秀麗隱桿線蟲的24 h－LC50為18.5 mg·L－1，表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性作用。在較低濃度(1.85 mg·L－1)的草甘膦脅迫下，秀麗隱桿線蟲即表現(xiàn)出異常的行為反應(yīng)。

2.2 砷與草甘膦對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合毒性

根據(jù)等毒性效應(yīng)，砷與草甘膦濃度設(shè)置為1/5 LC50、1/2 LC50和LC50，觀測砷與草甘膦復(fù)合脅迫對秀麗隱桿線蟲的毒性效應(yīng)。如果秀麗隱桿線蟲實(shí)測死亡率高于理論死亡率，則表明脅迫因子的復(fù)合作用為協(xié)同效應(yīng)。如圖1 所示，不同濃度的砷與濃度為1/5 LC50的草甘膦聯(lián)合作用下，實(shí)測秀麗隱桿線蟲死亡率高于理論值，表明砷與低濃度草甘膦的聯(lián)合毒性為協(xié)同作用，濃度為1/2 LC50和LC50的砷與1/5 LC50草甘膦的協(xié)同效應(yīng)顯著高于1/5 LC50砷與1/5 LC50草甘膦的協(xié)同效應(yīng)，表明低劑量的草甘膦即可顯著增強(qiáng)較高含量砷的毒性。中等脅迫強(qiáng)度的1/2 LC50草甘膦與砷的聯(lián)合毒性表現(xiàn)出相似的規(guī)律(圖2)，即草甘膦與高濃度砷的協(xié)同作用大于與低濃度砷的協(xié)同作用。而在濃度為LC50的高強(qiáng)度草甘膦協(xié)同作用下，秀麗隱桿線蟲在濃度為1/5 LC50的低強(qiáng)度砷染毒液中，24 h 時全部死亡(圖3)。結(jié)果表明，低濃度的砷與低濃度的草甘膦協(xié)同作用不顯著，低濃度的砷與高濃度的草甘膦表現(xiàn)出極強(qiáng)的協(xié)同作用，草甘膦對較高濃度的砷毒性協(xié)同作用明顯。

表1 砷、草甘膦及敵敵畏對秀麗隱桿線蟲24 h-LC50值及其回歸方程Table 1 Regression equations and 24 h-LC50 values of arsenic,glyphosate and dichlorvos to C.elegans

圖1 砷與濃度為1/5 LC50的草甘膦對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合毒性Fig.1 Joint toxicity of arsenic at different concentrations and glyphosate at concentration of 1/5 LC50 to C.elegans

圖2 砷與濃度為1/2 LC50的草甘膦對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合毒性Fig.2 Joint toxicity of arsenic at different concentrations and glyphosate at concentration of 1/2 LC50 to C.elegans

圖3 砷與濃度為LC50的草甘膦對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合毒性Fig.3 Joint toxicity of arsenic at different concentrations and glyphosate at concentration of LC50 to C.elegans

2.3 砷與敵敵畏對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合毒性

圖4 砷與濃度為1/5 LC50的敵敵畏對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合毒性Fig.4 Joint toxicity of arsenic at different concentrations and dichlorvos at concentration of 1/5 LC50 to C.elegans

如圖4 所示，不同濃度的砷與濃度為1/5 LC50的敵敵畏24 h 聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)中，秀麗隱桿線蟲死亡率明顯低于理論值，濃度為1/5 LC50的砷與1/5 LC50的復(fù)合脅迫下秀麗隱桿線蟲死亡率，與濃度為1/5 LC50的敵敵畏單一脅迫下秀麗隱桿線蟲死亡率相同;濃度為1/2 LC50的砷與濃度為1/5 LC50的敵敵畏聯(lián)合作用下，秀麗隱桿線蟲死亡率接近為零，即濃度為1/5 LC50的敵敵畏可抵消濃度為1/2 LC50的砷對秀麗隱桿線蟲的毒性作用;而濃度為1/5 LC50的敵敵畏，可使?jié)舛葹長C50的砷對秀麗隱桿線蟲的單一致死率由50%降低至20%。濃度為1/2 LC50的敵敵畏與砷聯(lián)合作用下，對秀麗隱桿線蟲的24 h 致死率維持在約20%的水平(圖5)，表明砷對濃度為1/2 LC50的敵敵畏的聯(lián)合毒性作用接近為零;需要指出的是，濃度為1/2 LC50的砷與敵敵畏的聯(lián)合作用效應(yīng)略低于濃度為1/5 LC50的砷聯(lián)合作用效應(yīng)。如圖6 所示，1/5 LC50的砷與濃度為LC50的敵敵畏對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合致死率為28%，濃度為1/2 LC50的砷與濃度為LC50的敵敵畏對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合致死率為20%，濃度為LC50的砷與濃度為LC50的敵敵畏聯(lián)合作用下，對秀麗隱桿線蟲的24 h 致死率約為50%，等效于敵敵畏或砷的單一毒性。

綜上，砷與敵敵畏的聯(lián)合毒性效應(yīng)表現(xiàn)為拮抗作用，相同砷濃度下，這種拮抗效應(yīng)隨敵敵畏濃度增加而減弱;濃度為1/2 LC50的砷對敵敵畏的拮抗作用尤為顯著。濃度為1/5 LC50的砷與濃度為1/2 LC50敵敵畏，濃度為1/5 LC50的砷與濃度為LC50敵敵畏，濃度為LC50的砷與濃度為1/5 LC50的敵敵畏，濃度為LC50的砷與濃度為1/5 LC50的敵敵畏，這4 個復(fù)合脅迫強(qiáng)度對秀麗隱桿線蟲的致死率極為接近。

圖5 砷與濃度為1/2 LC50的敵敵畏對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合毒性Fig.5 Joint toxicity of arsenic at different concentrations and dichlorvos at concentrations of 1/2 LC50 to C.elegans

圖6 砷與濃度為LC50的敵敵畏對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合毒性Fig.6 Joint toxicity of arsenic at different concentrations and dichlorvos at concentration of LC50 to C.elegans

3 討論(Discussion)

24 h 單一毒性是實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3 種毒物對秀麗隱桿線蟲的急性毒性大小排序?yàn)?，砷＜草甘膦＜敵敵畏。尚沒有證據(jù)證明砷是生命必需元素，有研究發(fā)現(xiàn)低劑量下砷具有興奮作用，如砒霜作為中藥的療效作用，而在細(xì)菌中也發(fā)現(xiàn)了As 可具有替代必須元素(P)的生物學(xué)作用[20]。砷對秀麗隱桿線蟲半數(shù)致死濃度與鉛、鉻相近，敵敵畏對秀麗隱桿線蟲的毒性與其他生物的脅迫響應(yīng)相近，表現(xiàn)為劇毒;而本研究結(jié)果表明，草甘膦對秀麗隱桿線蟲的急性毒性大于砷，這說明草甘膦對土壤中的非靶動物存在一定的生態(tài)風(fēng)險[10]。

污染物的復(fù)合作用方式和途徑多種多樣，包括在機(jī)體外的化學(xué)反應(yīng)，在生命體內(nèi)的綜合作用等[6]。聯(lián)合毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，砷與不同有機(jī)磷農(nóng)藥的復(fù)合作用模式都不同，不同濃度組合的聯(lián)合毒性效應(yīng)和作用程度都有所差異[21]。砷與草甘膦對秀麗隱桿線蟲的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為協(xié)同效應(yīng)，草甘膦與砷并不發(fā)生直接的化學(xué)作用，但在生物體內(nèi)，草甘膦對機(jī)體的脅迫壓力可能會使生命體對砷的耐受性減弱，從而表現(xiàn)出砷的毒性作用增強(qiáng)。作為2 種典型有機(jī)磷農(nóng)藥的草甘膦和敵敵畏的生物毒理作用機(jī)制各不相同[22－23]，如草甘膦可能是通過生殖相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，而敵敵畏具有神經(jīng)毒性。砷與敵敵畏可能發(fā)生復(fù)雜的化學(xué)作用，包括絡(luò)合作用、氧化還原等[11]。梁繼東和周啟星[7]發(fā)現(xiàn)有機(jī)農(nóng)藥對重金屬有腐蝕作用，而銅可與甲胺磷的部分功能團(tuán)發(fā)生絡(luò)合，其復(fù)合毒性表現(xiàn)為拮抗作用。三價砷被氧化或還原后毒性作用會降低，同時由于二甲基磷酸酯官能團(tuán)被破壞，也使得其毒性大為減弱。敵敵畏濃度為1/2 LC50和LC50時，分別與濃度為1/5 LC50的砷的聯(lián)合毒性相近，表明敵敵畏濃度變化，并不影響與砷的拮抗作用;砷濃度為LC50時，分別與濃度為1/5 LC50和1/2 LC50的敵敵畏的聯(lián)合毒性作用相近，表明較低濃度的敵敵畏可顯著減低較高濃度砷對秀麗隱桿線蟲的毒性作用。

自然環(huán)境中往往多種毒物并存，不同污染物間的聯(lián)合作用，如重金屬易與有機(jī)物形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，以及相同種類污染物的不同濃度組合，都會使污染物毒性較其單一毒性發(fā)生很大變化。這種聯(lián)合毒性效應(yīng)的判定方法有多種，本文所用的等效毒性相加法，不需復(fù)雜公式的計算，可直觀有效地判定2 種毒物的復(fù)合作用模式，并且通過理論與實(shí)測曲線對比圖，可大體判定2 種毒物的復(fù)合脅迫作用程度。秀麗隱桿線蟲作為生命科學(xué)領(lǐng)域的典型模式生物，用其作為毒物聯(lián)合毒性模式判定的實(shí)驗(yàn)材料，具有操作簡易、結(jié)論精確和端點(diǎn)豐富的優(yōu)勢[7－8]。應(yīng)用秀麗隱桿線蟲進(jìn)行復(fù)合污染模式判斷，操作簡單，易于觀測，結(jié)果清晰可信。而線蟲類群是自然界數(shù)量最豐富、分布最廣的生物，已被廣泛用作污染生態(tài)學(xué)領(lǐng)域研究的指示生物，這使得利用秀麗隱桿線蟲作為環(huán)境毒理學(xué)材料，更加具有實(shí)踐意義[24]。室內(nèi)模擬實(shí)驗(yàn)和野外定位觀測相結(jié)合，將是應(yīng)用線蟲這一自然界數(shù)量最豐富的類群進(jìn)行污染物的生物監(jiān)測和生態(tài)風(fēng)險評價的必經(jīng)途徑。

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