土著細(xì)菌對江漢平原淺層含水層沉積物中砷遷移的影響

謝作明，羅艷，王焰新，周義芳，孫小燕，甘義群

中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，武漢430074

砷是普遍存在于巖石圈、水圈和生物圈中的一種無色無味的劇毒類金屬，隨著飲水型砷中毒事件不斷在世界各地被報道[1-5]，地下水中高濃度砷已經(jīng)成為主要的公眾健康問題[6]，引起了各國政府和研究者的廣泛關(guān)注。

有研究報道，我國高砷地下水主要分布在內(nèi)蒙古、山西、新疆、寧夏和臺灣等8 個省和自治區(qū)[7-10]。然而，在對江漢平原地質(zhì)環(huán)境調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，該地區(qū)的地下水砷含量遠(yuǎn)超國家飲用水標(biāo)準(zhǔn)。江漢平原是我國重要的產(chǎn)糧區(qū)，砷在該地區(qū)淺層地下水系統(tǒng)中富集，在江漢平原種植的水稻將增加人體健康風(fēng)險，從而擴(kuò)大我國砷中毒暴露人口數(shù)量。因此，迫切需要加強(qiáng)該地區(qū)高砷地下水的防治，而高砷地下水防治策略制定的前提，是需要對地下水富砷成因機(jī)理全面深入的了解。

但是，到目前為此，對地下水富砷成因機(jī)理的研究大多將生物因子和非生物因子分割開來。實(shí)際上，地下水富砷成因是多種因素造成的，而生物與非生物因子如何協(xié)同影響高砷地下水的形成卻鮮有研究報道。

本研究利用高砷沉積物中土著細(xì)菌為生物材料，不同砷含量沉積物為研究對象，結(jié)合不同生物量和pH 條件在室內(nèi)開展厭氧培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，探討微生物活動對沉積物中砷遷移和轉(zhuǎn)化的影響。研究結(jié)果有助于完善地下水富砷成因機(jī)理。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 沉積物的采集及砷形態(tài)分析

根據(jù)前期調(diào)查地下水砷含量結(jié)果，選定江漢平原仙桃市沙湖鎮(zhèn)(30°09'N，113°41'E)為含水層沉積物采樣位點(diǎn)，于2011 年11 月鉆孔采樣，孔深50 m。采集不同層位的原狀土，利用保鮮膜密封，然后裝入密封袋，再密封在PVC 管內(nèi)，快速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，在4℃下避光保存。實(shí)驗(yàn)所用沉積物來自埋深9 ～15 m 的含水層。測得采樣點(diǎn)地下水pH 值為7.3。

選取3 個巖性特征相似，已知砷含量的沉積物樣，分別設(shè)為S1、S2 和S3，砷含量分別為14.8、23.6和30.2 μg·g-1。去除表面污染層，于121℃下滅菌30 min，過夜冷卻后重復(fù)滅菌1 次，以保證沉積物滅菌徹底。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng)

樣品運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，立刻在YQX-II 厭氧手套箱(常州恒德儀器公司)中選取約50 g 沉積物，破碎后放進(jìn)已裝有300 mL 無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(簡稱NB 培養(yǎng)基)[11]的三角瓶中，橡皮塞封口，用力搖勻，置于厭氧手套箱中培養(yǎng)，每隔6 h 搖勻1 次。培養(yǎng)1 d 后取50 mL 的懸浮液，接入300 mL 新鮮的無菌NB 培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。依此方式再擴(kuò)大培養(yǎng)1 次，待用。

1.3 實(shí)驗(yàn)方案

從已滅菌的S2 樣品中分別稱取100 g 沉積物，置于1 000 mL 三角瓶中，并加入500 mL 已滅菌的NB 培養(yǎng)基。向三角瓶中分別加入上述菌懸液50、100 和150 mL，設(shè)置3 個不同細(xì)菌生物量處理組，前2 組三角瓶中分別補(bǔ)充100 和50 mL 去離子無菌水，使各三角瓶中總液體體積相同，橡皮塞封口。為了營造厭氧培養(yǎng)條件，每12 h 向三角瓶的溶液中注入氮?dú)?0 min。所有混合液均在25℃的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。另稱取2 份沉積物，設(shè)定2 個對照組(CK1 和CK2)，CK1 既沒有接種細(xì)菌也沒有加入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，而是直接加入650 mL 無菌去離子水，CK2 沒有接種細(xì)菌但加入650 mL 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。對照組與實(shí)驗(yàn)組的培養(yǎng)條件完全一致。以上所有操作均在無菌條件下進(jìn)行，每個處理均設(shè)置3 個平行。

從S1 和S3 中稱取沉積物，設(shè)定細(xì)菌處理組，但只接種上述菌懸液100 mL，培養(yǎng)條件與上文一致。

另外，從S2 中稱取沉積物，如設(shè)置實(shí)驗(yàn)組，接種菌懸液100 mL，利用0.1 mol·L-1HCl 和0.1 mol·L-1NaOH 調(diào)節(jié)混合液的pH 值，使起始pH 分別為5、7 和9，培養(yǎng)條件與上文一致。

1.4 樣品分析

在不同培養(yǎng)時間間隔內(nèi)分別從三角瓶中取20 mL 懸浮液。所取樣品在5 000 r·min-1下離心20 min。上清液再用0.45 μm 濾膜過濾，濾液中砷形態(tài)及含量按Le 等[12]方法測定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，相關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算及統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0 軟件，并用Origin 8.0 作圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 細(xì)菌的生物量對沉積物中砷遷移的影響

不同生物量處理?xiàng)l件下，沉積物-培養(yǎng)基懸浮液中砷含量隨培養(yǎng)時間的變化如圖1 所示。圖1a 顯示的是懸浮液中總砷含量的變化。可以看出，細(xì)菌接入1 d 后，在培養(yǎng)的懸浮液中就檢測到砷，并隨培養(yǎng)時間的延長而快速增加，而沒有接入細(xì)菌的2 個對照(CK1 和CK2)懸浮液中砷含量變化很小，特別是沉積物-去離子水的對照(CK1)懸浮液中砷含量更低，實(shí)驗(yàn)期間最高也只有12 μg·L-1，沉積物-培養(yǎng)基的對照(CK2)懸浮液中砷含量在培養(yǎng)14 d 后達(dá)到最高，為35 μg·L-1。在初始接種菌懸液為50、100 和150 mL 的3 個細(xì)菌處理組中，砷含量在接種后的第2 ～10 天內(nèi)快速增加，實(shí)驗(yàn)期間最高分別達(dá)到269、541 和584 μg·L-1，其中150 mL 菌懸液細(xì)菌處理組在第18 天比第14 天的砷含量低。這些結(jié)果表明，細(xì)菌活動能加速沉積物中的砷釋出，且隨環(huán)境中細(xì)菌生物量的增加而加強(qiáng)。從圖1a 中還可以看出，在培養(yǎng)的前4 天內(nèi)，100 mL 菌懸液處理組的總砷釋出量明顯低于150 mL 菌懸液處理組，而從第6 天開始，兩者的總砷釋出量差距縮小。因此，作者推斷:隨著總砷含量的增加，細(xì)菌活性下降，導(dǎo)致砷釋出速度下降，從而出現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)后期，100 mL 和150 mL菌懸液處理組的總砷釋出量差距逐漸縮小的情況。

細(xì)菌活動下懸浮液中As(III)含量變化如圖1b 所示。由圖可知，As(III)含量變化總體上與總砷變化趨勢一致。結(jié)合圖1a 和圖1b 可以看出，懸浮液中總砷以As(III)為主。即使初始接種菌懸液為150 mL 的處理組，在培養(yǎng)第18 天的As(III)含量也沒有出現(xiàn)下降。在整個培養(yǎng)過程中，2 個對照菌懸液的As(III)含量同樣也保持較低水平，幾乎沒有增加。這說明接種菌懸液更有利于沉積物中As(III)的釋出。

圖1 接種不同生物量菌懸液條件下懸浮液中總砷(a)和As(III)(b)濃度隨培養(yǎng)時間的變化注:CK1 表示既沒有接種細(xì)菌也沒有補(bǔ)充培養(yǎng)基的對照;CK2 表示補(bǔ)充培養(yǎng)基但沒有接種細(xì)菌的對照。Fig.1 Temporal changes of total As(a)and As(III)(b)concentrations in suspension solution during incubation with different bacterial biomass

2.2 細(xì)菌對沉積物中砷遷移的影響

圖2 展示出細(xì)菌對不同沉積物中砷遷移的影響?？梢钥闯?，在接種細(xì)菌初始生物量相同的情況下，不同砷含量沉積物中的砷均快速釋出。但是，由S2 和S3 沉積物與菌懸液和培養(yǎng)基組成的處理組中，總砷和As(III)的釋出量差別都較小。3 個處理組懸浮液中總砷和As(III)的含量在培養(yǎng)結(jié)束時均達(dá)到最高，總砷分別為:422、541 和561 μg·L-1，As(III)分別為:298、391 和414 μg·L-1。所釋出的總砷分別占沉積物中初始總砷的18.5%、14.9%和12.1%，而懸浮液中As(III)分別占已釋出總砷的70.6%、72.3%和73.8%。可以得出的結(jié)論是:在初始生物量一定的條件下，沉積物中砷含量越高，細(xì)菌活動下總砷相對釋出量就越低;而且As(III)占所釋出總砷的比值就越高。

圖2 細(xì)菌作用于不同砷含量沉積物時懸浮液中總砷(a)和As(III) (b)濃度隨培養(yǎng)時間的變化注:S1、S2 和S3 分別表示砷含量為14.8、23.6 和30.2 μg·g-1 的沉積物樣品。Fig.2 Temporal changes of total As(a)and As(III)(b)concentrations in suspension solution during bacterial incubation from sediments with different arsenic contents

2.3 不同pH 條件下細(xì)菌對沉積物中砷遷移的影響

細(xì)菌在不同pH 條件下對沉積物中砷釋出的影響如圖3 所示。當(dāng)懸浮液初始pH 值為5、7 和9時，在細(xì)菌活動下，砷都能從沉積物中釋出，只是pH值為5 的處理組中砷的釋出最慢，另2 個處理組的釋出較快。在培養(yǎng)的前8 天，弱堿性pH 9 處理組的砷遷移量較pH 7 處理組的低，隨后超過pH 7 處理組。經(jīng)過18 d 的培養(yǎng)后，3 個處理中總砷釋出量占沉積物初始總砷的7.7%、14.7%和15.1%，懸浮液中As(III)分別占已釋出總砷的77.6%、80.9%和92.1%。說明在酸性條件下，細(xì)菌對砷釋出的影響最弱，而在弱堿性和中性條件下，細(xì)菌對砷釋出的影響差別較小，并且弱堿性更有利于As(III)的釋出。

圖3 細(xì)菌在不同初始pH 值條件下懸浮液中總砷(a)和As(III)(b)濃度隨培養(yǎng)時間的變化Fig.3 Temporal changes of total As(a)and As(III)(b)concentrations in suspension solution during bacterial incubation with different initial pH

3 討論(Discussion)

本研究表明，在厭氧培養(yǎng)條件下，土著細(xì)菌的活動加速了砷從沉積物向懸浮液遷移，而且還發(fā)現(xiàn)釋出的砷以As(III)為主。這與作者在江漢平原監(jiān)測到地下水中含有高濃度砷，并且以As(III)為主的結(jié)果一致。同時，作者實(shí)驗(yàn)室利用16S rDNA 克隆文庫方法對該鉆孔中地下水系統(tǒng)細(xì)菌多樣性分析，發(fā)現(xiàn)該含水層沉積物中有大量微生物存在，而且其優(yōu)勢菌群主要由伯克氏菌目(Burkholderiales)、假單胞桿菌目(Pseudomonadales)和腸桿菌目(Enterobacteriales)構(gòu)成，這些細(xì)菌為該地區(qū)淺層地下水富砷提供了重要的生物條件。江漢平原是典型的農(nóng)耕區(qū)，長期的墾殖使得地下水中富含有機(jī)質(zhì)，這為微生物提供了有利的生長條件。

細(xì)菌加速沉積物中砷遷移可能的原因是:在厭氧條件下，細(xì)菌通過富集砷，在胞內(nèi)將As(V)還原成As(III)，然后排出胞外，導(dǎo)致As(III)濃度增加[13];As(III)的遷移能力比As(V)強(qiáng)[14]，導(dǎo)致沉積物中砷脫離結(jié)合位點(diǎn)[15]被釋放。也可能因?yàn)槌练e物中Fe(III)被土著細(xì)菌還原成Fe(II)，As(V)同時也被還原成As(III)，與Fe 一起共同從沉積物表面解吸[16]。這可以從培養(yǎng)結(jié)束后，懸浮液中的砷以As(III)為主得到證明。

在不同初始生物量對砷遷移的影響研究中，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌活動對砷遷移的影響隨生物量的增加而加強(qiáng)。但是，當(dāng)生物量增加到一定程度后，在培養(yǎng)后期，150 mL 菌懸液處理組無論是總砷還是As(III)的遷移相對于100 mL 菌懸液處理組都有減慢的趨勢。這可能是由于細(xì)菌生物量增加，懸浮液中營養(yǎng)物質(zhì)減少，生物活性降低，從而使細(xì)菌對砷遷移的作用降低所致。也可能是由于懸浮液中砷特別是As(III)的濃度增加，砷鈍化細(xì)菌胞內(nèi)酶活性[17]，影響細(xì)菌生長，使懸浮液中細(xì)菌生物量減少，從而降低細(xì)菌對砷遷移的影響。

本研究結(jié)果顯示，沉積物中砷含量越高，細(xì)菌活動下總砷的相對釋出量越低;而且As(III)占釋出總砷的比值越高。眾所周知，砷是一種有毒類金屬物質(zhì)，沉積物中以無機(jī)砷為主，其中As(III)對生物的毒性更強(qiáng)[18-21]。砷不僅影響細(xì)菌細(xì)胞的形態(tài)發(fā)育，而且抑制細(xì)菌的代謝[22]。因此，當(dāng)沉積物中砷含量超過土著細(xì)菌的耐受范圍時，將對細(xì)菌產(chǎn)生毒害作用，從而降低細(xì)菌對砷遷移的影響。

在不同的pH 條件下培養(yǎng)細(xì)菌懸浮液，對沉積物中砷的釋放具有一定差異。酸性處理組比堿性處理組的砷遷移低，說明堿性條件有利于砷從沉積物中遷移。Park 等[23]研究發(fā)現(xiàn)，堿性環(huán)境有利于砷從河床沉積物中解吸附，并且，吸附在沉積物顆粒表面的砷很容易受pH 值的變化脫離結(jié)合位點(diǎn)，游離到液相中。當(dāng)然，酸性和堿性條件都不利于菌懸液中細(xì)菌的生長，這是砷遷移受到影響的最主要原因。本研究中，弱堿性處理組在培養(yǎng)的前8 天內(nèi)，砷遷移量較pH 7 處理組的低，隨后超過pH 7 處理組。可能是因?yàn)榧?xì)菌在接種后沒有適應(yīng)堿性環(huán)境，細(xì)菌發(fā)育和繁殖受到抑制，經(jīng)過一定時間培養(yǎng)后，胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)被激活，細(xì)菌抵抗高砷環(huán)境的能力增強(qiáng)而快速生長[17];也可能是因?yàn)榧?xì)菌分泌的代謝產(chǎn)物降低了懸浮液的pH 值[21,23-24]，改善了生長條件，因此細(xì)菌得以快速生長，從而提高了菌懸液中細(xì)菌的砷遷移能力。作者調(diào)查發(fā)現(xiàn)，江漢平原淺層地下水系統(tǒng)屬于弱堿性環(huán)境。另外，大量細(xì)菌的長期活動，導(dǎo)致了該地區(qū)沉積物中砷向地下水中富集，而形成高砷地下水。

[1] Wang S,Mulligan C N.Occurrence of arsenic contamination in Canada:Sources,behavior and distribution[J].Science of the Total Environment,2006,366(2-3):701－721

[2] Chakraborti D,Mukherjee S C,Pati S,et al.Arsenic groundwater contamination in middle Ganga Plain,Bihar,India:A future danger?[J].Environmental Health Perspectives,2003,111(9):1194－1201

[3] Shrestha R R,Shrestha M P,Upadhyay N P,et al.Groundwater arsenic contamination,its health impact and mitigation program in Nepal[J].Journal of Environment Science and Health,Part A Environmental Science,2003,38(1):185－200

[4] Murphy T,Guo J.Aquatic Arsenic Toxicity and Treatment[M].Leiden:Backhuys Publisher,2003:19-26,51－67

[5] 王焰新,蘇春利,謝先軍,等.大同盆地地下水砷異常及其成因研究[J].中國地質(zhì),2010,37(3):771－780 Wang Y X,Su C L,Xie X J,et al.The genesis of high arsenic groundwater:A case study in Datong Basin[J].Geology in China,2010,37(3):771－780(in Chinese)

[6] Phan K,Sthiannopkao S,Kim K W,et al.Health risk assessment of inorganic arsenic intake of Cambodia residents through groundwater drinking pathway[J].Water Research,2010,44(19):5777－5788

[7] Wade T J,Xia Y,Wu K,et al.Increased mortality associated with well-water arsenic exposure in Inner Mongolia,China[J].International Journal of Environmental Research Public Health,2009,6(3):1107－1123

[8] Xia Y,Wade T J,Wu K,et al.Well water arsenic exposure,arsenic induced skin-lesions and self reported morbidity in Inner Mongolia[J].International Journal of Environmental Research Public Health,2009,6(3):1010－1025

[9] Duan M Y,Xie Z M,Wang Y X,et al.Microcosm studies on iron and arsenic mobilization from aquifer sediments under different conditions of microbial activity and carbon source [J].Environmental Geology,2009,57(5):997－1003

[10] 孫貴范.中國面臨的水砷污染與地方性砷中毒問題[J].環(huán)境與健康展望,2003,111(4):39－43

[11] Ohta H,Hattori T.Bacteria sensitive to nutrient broth medium in terrestrial environments[J].Soil Science and Plant Nutrition,1980,26(1):99－107

[12] Le X C,Yalcin S,Ma M.Speciation of submicrogram per liter levels of arsenic in water:On-site species separation integrated with sample collection[J].Environmental Science&Technology,2000,34(11):2342－2347

[13] Xie Z M,Luo Y,Wang Y X,et al.Arsenic resistance and bioaccumulation of an indigenous bacterium isolated from aquifer sediments of Datong Basin,northern China[J].Geomicrobiology Journal,2012a,DOI:10.1080/01490451.694975

[14] Oremland R S,Stolz J F.The ecology of arsenic[J].Science,2003,300(5621):939－944

[15] Oremland R S,Stolz J F.Arsenic,microbes and contaminated aquifers[J].Trends in Microbiology,2005,13(2):45－49

[16] 王兆蘇,王新軍,陳學(xué)萍,等.微生物鐵氧化作用對砷遷移轉(zhuǎn)化的影響[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2011,31(2):328－333 Wang Z S,Wang X J,Chen X P,et al.The effect of microbial iron oxidation on arsenic mobility and transformation[J].Acta Scientiae Circumstantiae,2011,31(2):328－333(in Chinese)

[17] Xie Z M,Zhou Y F,Wang Y X,et al.Influence of arsenate on lipid peroxidation levels and antioxidant enzyme activities in Bacillus cereus strain XZM002 isolated from high arsenic aquifer sediments[J].Geomicrobiology Journal,2012b,DOI:10.1080/01490451.746405

[18] Macur R E,Wheeler J T,McDermott T R,et al.Microbial populations associated with the reduction and enhanced mobilization of arsenic in mine tailings[J].Environmental Science&Technology,2001,35(18):3676－3682

[19] Masscheleyn P H,Delaune R D,Patrick Jr W H.Effect of redox potential and pH on arsenic speciation and solubility in a contaminated soil[J].Environmental Science&Technology,1991,25(8):1414－1419

[20] Matera V,Le Hécho I,Laboudigue A,et al.A methodological approach for the identification of arsenic bearing phases in polluted soils[J].Environmental Pollution,2003,126(1):51－64

[21] Xie Z M,Wang Y X,Duan M Y,et al.Arsenic release by indigenous bacteria Bacillus cereus from aquifer sediments at Datong Basin,northern China[J].Frontiers of Earth Science in China,2011,5(1):37－44

[22] Xie Z M.Biomobilization and bioaccumulation mechanisms of arsenic in shallow groundwater system:A case study at Datong Basin(Post-doctoral Research Report)[R].Wuhan:China University of Geosciences,2008:30－31

[23] Park J M,Lee J S,Lee J U,et al.Microbial effects on geochemical behavior of arsenic in As-contaminated sediments[J].Journal of Geochemical Exploration,2006,88(1-3):134－138

[24] 郭華明,唐小惠,楊素珍,等.土著微生物作用下含水層沉積物砷的釋放與轉(zhuǎn)化[J].現(xiàn)代地質(zhì),2009,23(1):86－93 Guo H M,Tang X H,Yang S Z,et al.Indigenous bacteria-mediated release and transformation of As in aquifer sediment from the Hetao Basin,Inner Mongolia[J].Geoscience,2009,23(1):86－93(in Chinese)