水稻基因類型與生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)精米中砷積累的影響

段桂蘭，張紅梅，劉云霞，胡瑩，程旺大，*

1.中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，北京100085

2.浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，嘉興314016

砷(As)在自然界中普遍存在，其含量豐度在地殼中為第20 位。As 對(duì)動(dòng)植物都具有強(qiáng)烈的毒害作用，無機(jī)As 是一種公認(rèn)的致癌物[1]，過量攝入As 或長(zhǎng)期微量暴露As 都會(huì)對(duì)人體健康構(gòu)成嚴(yán)重危害，并誘發(fā)皮膚、腎臟、膀胱等器官和組織的癌變[2]。

自然環(huán)境中的As 主要通過飲用水、食物鏈或含As 氣體等途徑被人體吸收。As 污染的地下水嚴(yán)重危害著世界上70 多個(gè)國(guó)家或地區(qū)的數(shù)億人的身體健康[3]。在孟加拉國(guó)有1.3 億居民長(zhǎng)期飲用受As污染的水源，8 000 多萬(wàn)人的飲用水As 含量超標(biāo)(世界衛(wèi)生組織規(guī)定的飲用水As 含量標(biāo)準(zhǔn)為10 μg·L-1)[4]。我國(guó)也有飲用水As 含量比較高的地區(qū)，比如新疆、內(nèi)蒙古和臺(tái)灣等地，在某些As 污染嚴(yán)重的地區(qū)已出現(xiàn)了典型的地方性As 中毒現(xiàn)象，如“烏腳病”[5-6]。高As 含量的地下水在一些地區(qū)不僅作為飲用水，更是農(nóng)作物的主要灌溉水源，特別是水稻的灌溉水[7-8]。在孟加拉，地下水抽取量的大約95%被用于灌溉，主要用于旱季稻的生產(chǎn)，每年通過灌溉水進(jìn)入稻田的As 約為1 000 t[9-10]。

水稻是我國(guó)及東南亞地區(qū)的主要糧食作物，全球一半以上的人口以稻米為主食，我國(guó)的水稻總產(chǎn)量和種植面積分居世界第1 和第2 位[11]。同時(shí)，由于水稻的淹水生長(zhǎng)環(huán)境和硅富集、根泌氧等生理特性，使水稻對(duì)As 的吸收和富集能力明顯強(qiáng)于小麥、大麥等其他大宗農(nóng)作物，導(dǎo)致大米中As 的背景值濃度通常比其他農(nóng)作物籽粒中As 的背景濃度高1個(gè)數(shù)量級(jí)[12-13]。而且，在東南亞地區(qū)的稻米中，毒性最強(qiáng)的無機(jī)As 是As 的主要存在形態(tài)[14-15]。因此，對(duì)于東南亞地區(qū)以大米為主食的居民，稻米的食用已成為人體攝入As 的最重要途徑之一[16-19]。各國(guó)政府在大力控制飲用水As 污染的同時(shí)，應(yīng)重視水稻As 污染對(duì)人類健康的風(fēng)險(xiǎn)，切實(shí)解決有關(guān)地區(qū)的水稻As 污染問題[15,20]。

為控制大米As 污染，最直接有效的方法就是停止使用As 污染的稻田種植水稻，并停止使用As污染的地下水灌溉水稻。但是，在東南亞地區(qū)，人多地少，水資源緊缺，大米需求量大，因此，對(duì)于東南亞地區(qū)大面積的輕度或中度As 污染的稻田，需要有效可行的措施以同時(shí)確保水稻生產(chǎn)的產(chǎn)出和安全。大量研究已證明不同品種的水稻，其稻米中的As累積能力差異較大[21-23]。通過在中國(guó)、美國(guó)和孟加拉國(guó)多個(gè)田間實(shí)驗(yàn)，Norton 等[24]發(fā)現(xiàn)，300 多個(gè)水稻品種中，其籽粒As 濃度相差達(dá)3 ～34 倍，遺傳變異占總變異的40%～64%。不同地區(qū)所產(chǎn)的水稻，其籽粒中的As 濃度也存在顯著的差異，Meharg等[15]分析了從4 大洲的10 個(gè)國(guó)家的大米背景值A(chǔ)s濃度，發(fā)現(xiàn)埃及(0.04 mg·kg-1)和印度(0.07 mg·kg-1)的樣品總As 濃度最低，而美國(guó)(0.25 mg·kg-1)和法國(guó)(0.28 mg·kg-1)的樣品總As 濃度最高;大米中無機(jī)As 占總As 的比例也有顯著的地區(qū)性差異，孟加拉和印度所產(chǎn)大米的無機(jī)As 含量比較高，而美國(guó)產(chǎn)大米的有機(jī)As 含量比例較高。同樣，通過在中國(guó)、印度和孟加拉國(guó)的As 污染稻田布置田間實(shí)驗(yàn)，結(jié)果也證明水稻基因型與環(huán)境效用及其相互作用對(duì)水稻籽粒中As 積累均有極顯著影響[22]。這些研究結(jié)果說明，針對(duì)某一特定地區(qū)的土壤環(huán)境和水資源特征，篩選或培育低As 積累的水稻品種是經(jīng)濟(jì)有效地降低大米As 積累的重要途徑。

浙江省在經(jīng)濟(jì)不斷發(fā)展的同時(shí)，重金屬污染問題日益受到人們的關(guān)注，重金屬污染的綜合防治是未來幾年環(huán)保專項(xiàng)行動(dòng)的重中之重。水稻一直是浙江的主要農(nóng)作物，水稻的安全生產(chǎn)與糧食增產(chǎn)、社會(huì)穩(wěn)定、人們的健康密切相關(guān)。本研究在浙江省嘉興市選擇不同區(qū)域的5 塊水稻田，比較了20 個(gè)當(dāng)?shù)刂髟缘乃酒贩N在這些實(shí)驗(yàn)點(diǎn)種植所得精米中的As 含量。同時(shí)在嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院布置了人工添加As 的盆栽模擬實(shí)驗(yàn)，研究在較高As 污染條件下水稻基因型差異對(duì)籽粒As 積累的影響。通過大田實(shí)驗(yàn)與盆栽模擬相結(jié)合的方法，明確了水稻基因型與環(huán)境效應(yīng)及其相互作用對(duì)精米中As 積累的影響，并且篩選得到一些當(dāng)?shù)刈蚜Ｖ械虯s 積累水稻基因型。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)點(diǎn)介紹及盆栽實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)于2009 年開始進(jìn)行。5 個(gè)大田實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分別是:1)嘉興市秀洲區(qū)王江涇鎮(zhèn)的嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)基地(N 30°50.133'，E 120°43.046')，該地塊的土壤As 濃度較低，可作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照地塊;2)嘉興市南湖區(qū)新豐鎮(zhèn)已連續(xù)8 年以上施用生豬養(yǎng)殖排泄物和沼液田塊(N 30°04.007'，E 120°54.348')，由于長(zhǎng)期施用沼渣或沼液，可能導(dǎo)致土壤中的As、銅(Cu)、鋅(Zn)等重金屬長(zhǎng)期積累;3)嘉興市南湖區(qū)余新鎮(zhèn)工業(yè)污染田(N 30°42.174'，E 120°48.611')，該地塊由于工業(yè)廢棄物的排放，可能導(dǎo)致土壤中重金屬積累;4)桐鄉(xiāng)市高橋鎮(zhèn)可能污染田(N 30°32.300'，E 120°34.422');5)桐鄉(xiāng)市屠甸鎮(zhèn)可能的工業(yè)污染田(N 30°35.264'，E 120°37.638')。

盆栽實(shí)驗(yàn):在浙江省嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院的溫室大棚進(jìn)行盆栽實(shí)驗(yàn)。在盆栽之前，將市農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)基地水稻土風(fēng)干、磨碎后過2 mm 篩，然后將肥料與As 拌入土壤，N、P、K 肥料分別以CO(NH2)2、CaHPO4·H2O 和KCl 的方式加入，包括P 肥0.15 g·kg-1(以P2O5計(jì))、K 肥0.20 g·kg-1(以K2O 計(jì))和N肥0.20 g·kg-1(以N 計(jì));As 以Na3AsO4·12H2O 的方式加入，10 mg·kg-1(以As 計(jì))。將肥料和As 攪拌均勻的土壤裝入塑料盆缽中，每盆10 kg 土壤。加水保持3 ～4 cm 水位，平衡1 周后用于水稻秧苗移栽。每盆栽1 棵水稻秧苗，同時(shí)做3 組平行。所有的實(shí)驗(yàn)盆在溫室里隨機(jī)擺設(shè)，不定期加水，并且調(diào)換塑料盆的位置，直到水稻收割。

1.2 植物材料及栽培方法

在前期篩選實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上[25]，水稻(Oryza sativa L.)種子從嘉興市農(nóng)科院獲得，包括當(dāng)?shù)刂髟云贩N或即將進(jìn)入省區(qū)試的品系(有可能成為主栽的品種)，包括粳稻18 個(gè)和糯稻2 個(gè)共20 個(gè)水稻基因型(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用的20 個(gè)水稻品種Table 1 Twenty rice genotypes used in this study

水稻種子經(jīng)線菌靈浸種、催芽后，統(tǒng)一于嘉興市農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)基地育秧。25 d 后，將秧苗移栽到各個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的稻田。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)內(nèi)20 個(gè)水稻基因型隨機(jī)移栽，每個(gè)基因型種植5行，每行10 穴，每穴1 株秧苗，秧苗的行列間距為20 cm。水稻移栽前后，以及水稻生長(zhǎng)到收割這段時(shí)期中，田間的管理措施如施肥、灌溉、排水和農(nóng)藥等都是按照當(dāng)?shù)剞r(nóng)民傳統(tǒng)進(jìn)行。

1.3 植物樣品的制備與分析方法

水稻成熟后，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)的40 ～50 株水稻收集50 個(gè)稻穗，然后手工將稻谷從稻穗上脫落下來，裝入網(wǎng)袋，于室內(nèi)通風(fēng)處自然風(fēng)干。自然風(fēng)干后用脫殼機(jī)將稻谷分成谷殼和糙米兩部分，糙米進(jìn)一步經(jīng)過去糠處理，最后用不銹鋼粉碎機(jī)粉碎成粉，室溫保存待分析。

土壤樣品于水稻收獲后采集，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)小區(qū)根據(jù)對(duì)角線布點(diǎn)，多點(diǎn)取樣，再混合成一個(gè)混合樣品的原則，取3 個(gè)0 ～20 cm 的土壤混合樣品。土壤樣品風(fēng)干、磨碎后過2 mm 篩。室溫保存待分析。

大米樣品分析:稱取0.2 g 精米粉末于50 mL離心管中，加入2 mL 優(yōu)級(jí)純硝酸，混勻后室溫下平衡過夜，用微波消煮爐(MARS5,CEM Microwave Technology Ltd.Matthews,USA)進(jìn)行消煮，消煮程序是55℃，10 min;75℃，10 min;95℃，30 min?？瞻缀蜆?biāo)準(zhǔn)樣品(GBW 07605 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心)同時(shí)消煮，以確保消煮及以后測(cè)定的準(zhǔn)確度和用于回收率的計(jì)算。消煮后的樣品用超純水(EASYpure LF,Barnstead International,Dubuque,IA,USA)稀釋至50 mL，用定量濾紙過濾以除去雜質(zhì)，4℃保存?？侫s 濃度用電感耦合等離子體質(zhì)譜系統(tǒng)(ICPMS 7500，安捷倫科技，美國(guó))進(jìn)行測(cè)定。

土壤樣品的分析:稱取0.1 g 土壤樣品于50 mL離心管中，加入2.5 mL 優(yōu)級(jí)純硝酸，混勻后室溫下平衡過夜。平衡后的土壤溶液采用開放式消煮爐消解，消解程序是100℃，1 h;120℃，1 h;140℃，一直消煮到溶液清澈。空白和標(biāo)準(zhǔn)樣品同時(shí)消煮。稀釋和測(cè)定方法與大米樣品的方法一致。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11.5 軟件進(jìn)行方差分析和多重比較(Student-Newman-keuls 檢驗(yàn))(P ＜0.05)，采用SigmaPlot 9.0 軟件作圖。

2 結(jié)果(Results)

2.1 土壤中總As 含量

嘉興市農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)基地的土壤As 含量較低，為6.26 mg·kg-1;新豐鎮(zhèn)生豬養(yǎng)殖排泄物和沼液施肥田塊的土壤As 含量為7.89 mg·kg-1，相對(duì)于農(nóng)科院對(duì)照土壤，As 含量提高了26.08%;余新鎮(zhèn)工業(yè)污染田塊的土壤As 含量為13.34 mg·kg-1，比對(duì)照土壤提高了113.08%;高橋鎮(zhèn)可能污染田塊的土壤As含量為7.14 mg·kg-1，比對(duì)照土壤提高了14.13%;屠甸鎮(zhèn)工業(yè)園區(qū)附近田塊的土壤As 含量為8.20 mg·kg-1，比對(duì)照土壤提高了31.07%。

2.2 精米中As 含量的基因型差異

為比較水稻籽粒As 積累的基因型差異，本研究比較了20 個(gè)水稻品種在不同栽培環(huán)境條件下的精米中As 含量。結(jié)果表明，在所有的環(huán)境條件下，20 個(gè)水稻品種的精米As 含量都呈現(xiàn)顯著的基因型差異(表2，圖1)。如余新鎮(zhèn)種植的精米，基因型18(G18)的As 濃度是57.80 μg·kg-1，而基因型20(G20)的As 濃度是126.39 μg·kg-1。相同條件下，不同基因型精米中As 濃度的最大值與最小值的比值在1.82 ～2.19之間，變異系數(shù)在人工添加As 的盆栽模擬條件下最大，達(dá)到22.69%，其他條件下在15.10%～18.68%之間(表2，圖1)。

圖1 20 種不同品種水稻在各地區(qū)種植的精米中As 濃度注:箱形圖的上下邊界代表75%及25%分位數(shù)(四分位數(shù))，中線代表中位數(shù)，誤差線代表10%及90%分位數(shù)，各個(gè)點(diǎn)代表不同水稻品種的精米中As 濃度值。Fig.1 As concentrations in polished grains of 20 rice genotypes harvested from different sites

表2 各地區(qū)種植的20 種不同水稻品種的精米中As 濃度差異Table 2 Difference of As concentrations in polished grains of 20 rice genotypes harvested from each site

2.3 精米中As 含量的環(huán)境變異

為比較水稻籽粒As 積累的基因型差異，本研究比較了6 種環(huán)境條件下種植的精米As 含量。結(jié)果表明，所有水稻品種的精米As 含量都呈現(xiàn)顯著的環(huán)境變異(表3，圖1)，例如，基因型20(G20)在盆栽條件下栽培時(shí)，精米中As 的濃度最高，達(dá)到255.78 μg·kg-1，而在農(nóng)科院對(duì)照土壤條件下栽培時(shí)，精米As 濃度最低，為69.70 μg·kg-1。同一品種在不同環(huán)境條件下，精米中As 含量的最大值與最小值的比值在1.86 ～3.76之間，但不同品種對(duì)環(huán)境變化的響應(yīng)不同，變異系數(shù)在25.62%～63.95%之間(表3，圖1)。

表3 各水稻品種在不同地區(qū)種植時(shí)精米中的As 濃度差異Table 3 Difference of As concentrations in polished grains of the same genotype harvested from different sites

2.4 精米中As 含量的方差分析

通過方差分析(表4)，發(fā)現(xiàn)水稻基因型對(duì)精米中As 含量有極顯著的影響，F(xiàn)品種=12.38 ＞F0.01(19,139)=2.04 ，P ＜0.001;環(huán)境條件對(duì)精米中As 含量有極顯著的影響，F(xiàn)地區(qū)=369.62 ＞F0.01(5,139)=3.15，P ＜0.001 ;同樣，水稻品種和種植地區(qū)的相互作用均對(duì)精米中As 含量有極顯著影響，F(xiàn)品種×地區(qū)=3.33 ＞F0.01(95,139)=1.54，P ＜0.001。

表4 精米中As 濃度的方差分析Table 4 Analysis of variance in As concentrations in polished grains

2.5 籽粒低As 積累水稻品種的篩選

在相同條件下，將20 個(gè)水稻品種的精米As 含量由低到高進(jìn)行排序，最低的序列為1，最高的序列為20。通過對(duì)6 種條件下同一品種的序列數(shù)求平均值，得到該品種的精米中As 含量由低到高的排序(圖2)。結(jié)果表明，一些基因型的精米As 積累在所有條件下均較低。例如，基因型1、2、3、5 和11(G1、G2、G3、G5 和G11)的平均排序都在5 以下，說明這些籽粒As 低積累的基因型推廣應(yīng)用后精米As污染的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低;與此相反，也有一些基因型的精米As 積累在所有條件下都較高，例如，基因型6、10 和20(G6、G10 和G20)的平均排序都在15 以上，因此，這些品種應(yīng)盡量避免在As 污染的地區(qū)種植。

圖2 20 種水稻的精米中As 濃度的排列序數(shù)Fig.2 Rank of As concentrations in polished grains of 20 rice genotypes

3 討論(Discussion)

稻田及稻米的As 污染及其控制技術(shù)是我國(guó)及其他東南亞地區(qū)非常突出且急需解決的環(huán)境問題之一。篩選或培育籽粒低As 積累的水稻品種，被廣泛認(rèn)為是一條經(jīng)濟(jì)、有效的降低稻米As 積累的重要途徑[20,22]。本研究所比較的20 個(gè)水稻品種包括粳稻和糯稻，這些品種大多數(shù)都是浙江省嘉興市農(nóng)科院育成的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗品種，已在我國(guó)浙江、上海、江蘇等地稻區(qū)推廣種植。重金屬的積累是水稻安全生產(chǎn)的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[26]，筆者前期已經(jīng)對(duì)部分品種的重金屬積累能力進(jìn)行鑒定，例如，秀水128和秀水09 的籽粒中鎘、鉛、As 等有毒元素積累都較低，被作為環(huán)保型的新品種而推廣種植[23]。在本研究中，這2 個(gè)水稻品種被再次證明其精米中的As濃度較低(圖2)。另外，甬粳16、Y-05-8、秀水134等基因型的精米As 積累也較低。推廣種植這些低As 積累的水稻品種可為輕、中度As 污染稻田的大米安全生產(chǎn)提供一條經(jīng)濟(jì)、有效的途徑。

大米中As 的積累不僅受水稻基因型的調(diào)控，同時(shí)也受到環(huán)境條件以及環(huán)境與基因型交互作用的顯著影響(表3、表4 和圖1)。本研究在浙江省嘉興市5 個(gè)不同區(qū)域選擇5 塊水稻田，這些田塊的土壤總As 含量差別顯著，在6.26 ～13.34 mg·kg-1之間，而且As 的污染來源不同，有工業(yè)廢棄物排放、施用有機(jī)肥等原因造成的土壤As 污染。結(jié)果表明，同一水稻基因型，在不同地區(qū)種植時(shí)，其精米中的As含量差異顯著。例如，秀水114(G10)，在嘉興市農(nóng)科院實(shí)驗(yàn)基地種植時(shí)，精米中的As 濃度是66.58 mg·kg-1，在新豐鎮(zhèn)有機(jī)肥施肥田塊種植時(shí)，精米中的As 濃度是102.58 mg·kg-1，而在人工添加As 的盆栽時(shí)，精米中的As 濃度達(dá)到207.70 mg·kg-1，變異系數(shù)是41.18%。另外，值得注意的是，精米中的As 含量與土壤總As 含量并沒有明顯的相關(guān)性。本研究的5 個(gè)大田實(shí)驗(yàn)中，余新鎮(zhèn)工業(yè)污染田塊的土壤As 濃度最高(13.34 mg·kg-1)，顯著高于新豐鎮(zhèn)施生豬養(yǎng)殖排泄物田塊的土壤As 濃度(7.89 mg·kg-1)，但兩地區(qū)所產(chǎn)精米的As 平均濃度卻沒有顯著差異。這可能與土壤中As 的生物有效性有關(guān)，Duan 等[27]證明，生豬養(yǎng)殖排泄物和沼液中的As 具有較高的從土壤到植物的生物轉(zhuǎn)移系數(shù)，其生物有效性較高。

稻米中As 的積累受到環(huán)境、遺傳及環(huán)境與遺傳交互作用的顯著影響。因此，大米的安全生產(chǎn)首先必須確保農(nóng)田土壤環(huán)境的潔凈，嚴(yán)禁在As 污染嚴(yán)重或高背景值的“問題土壤”條件下種植水稻，在輕、中度As 污染地區(qū)需要采取適當(dāng)?shù)拇胧┙档偷咎锿寥乐蠥s 的生物有效性，同時(shí)需要篩選并推廣種植籽粒中低As 積累的水稻品種。多措施并用、多學(xué)科交叉將是實(shí)現(xiàn)東南亞地區(qū)大米安全生產(chǎn)的有效途徑。

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