應(yīng)用正交設(shè)計對大白菜純度鑒定中EST—SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化

摘 要：以3份大白菜雜交種及其親本為試驗材料，利用改良CTAB法提取基因組DNA，采用正交設(shè)計對Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA和Taq酶5因素4水平進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，適用于大白菜純度鑒定EST-SSR檢測體系為：在10 μL反應(yīng)體系中包含3.0 mmol·L-1 MgCl2、 400 μmol·L-1 dNTPs、0.20 μmol·L-1 SSR 引物、4 ng模板DNA和0.05 U Taq酶。利用該優(yōu)化的體系，對3份大白菜雜交種進(jìn)行單株育苗試驗，每份雜交種取單株140株進(jìn)行純度鑒定。結(jié)果顯示，擴(kuò)增帶型清晰、穩(wěn)定，純度檢測結(jié)果與田間試驗結(jié)果基本吻合，可用于大白菜種子純度分子標(biāo)記的進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：大白菜；純度鑒定；正交設(shè)計；EST-SSR；優(yōu)化

中圖分類號：S634.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.03.001

大白菜（Brassica campestris L. ssp. pekinensis）是十字花科蕓薹屬 一年生草本植物，原產(chǎn)地中海沿岸和中國，栽培面積和消費(fèi)量在中國居各類蔬菜之首。在大白菜雜交種生產(chǎn)與銷售過程中，建立以質(zhì)量檢測為中心的良種繁殖與種子管理體系，對穩(wěn)定和推廣優(yōu)良品種起著重要作用。目前，大白菜雜交種純度鑒定直接可靠的方法是田間小區(qū)種植鑒定，但這一方法易受環(huán)境的影響，時間長，且費(fèi)工占地。理想的種子純度鑒定技術(shù)不但要準(zhǔn)確可靠，還要簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、實用性強(qiáng)，這是種子純度鑒定實現(xiàn)商業(yè)化的前提，也是該技術(shù)的發(fā)展趨勢。近年來，植物分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展使人們對作物的分析進(jìn)入了分子水平，DNA分子標(biāo)記技術(shù)因其能更有效地鑒別不同的甚至親緣關(guān)系很近的基因型，在分析生物遺傳多樣性、構(gòu)建品種指紋圖譜和種子純度鑒定等方面已成為更加理想的方法。

SSR（Simple Sequence Repeats）即簡單序列重復(fù)，又稱微衛(wèi)星標(biāo)記（microsatellite），是由少數(shù)幾個核苷酸（一般為 1～6個）為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列[1-2]。它廣泛分布在真核生物的基因組中，并在兩側(cè)都有物種特異性的側(cè)翼序列，鑒于基序的重復(fù)次數(shù)變化很大，因此，與其他DNA分子標(biāo)記相比具有更高的多態(tài)性。由于其具有數(shù)量豐富、重復(fù)性好、可靠性高、呈共顯性遺傳、易于分析等特點(diǎn)，可用來高效、準(zhǔn)確地檢測生物體中的遺傳變異。隨著功能基因組學(xué)的迅速發(fā)展，GenBank中積累了許多重要物種的大量EST序列，這些序列獲取簡便，沒有任何費(fèi)用，已經(jīng)成為發(fā)展SSR標(biāo)記的重要來源，因此，基于表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，EST）的微衛(wèi)星（simple sequence repeats，SSR）標(biāo)記技術(shù)不僅保留了SSR標(biāo)記技術(shù)的所有優(yōu)點(diǎn)，而且凸顯了其便捷、花費(fèi)低、效率高的優(yōu)勢[3-4]。

利用EST-SSR技術(shù)對植物基因組研究時應(yīng)對該物種的EST-SSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，以建立一套適用于該物種的EST-SSR檢測體系。目前，EST-SSR技術(shù)雖然已用于大白菜品種鑒定和種質(zhì)資源分析的研究[5]，但有關(guān)大白菜純度鑒定中EST-SSR檢測體系及其優(yōu)化方法的研究報道較少。本研究從PCR擴(kuò)增的關(guān)鍵影響因素對EST-SSR體系進(jìn)行優(yōu)化，以建立一套穩(wěn)定、準(zhǔn)確的適用于大白菜純度鑒定的EST-SSR檢測體系，為大白菜種質(zhì)資源研究、品種鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料為3份市售大白菜雜交種及其親本，具體名稱如表1所示。

1.2 試驗方法

1.2.1 基因組DNA的提取 采用M. Somma等提出的CTAB法。每個品種隨機(jī)挑取200粒均勻、飽滿的種子，將其催芽，光照培養(yǎng)，待長出真葉后，采集幼嫩單株140株進(jìn)行DNA提取。利用NanoDrop Spectrophotometer ND-1000核酸蛋白測定儀和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的DNA濃度和質(zhì)量，并將其稀釋為50 ng·μL-1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 EST-SSR位點(diǎn)選擇 在前期研究基礎(chǔ)上[4]，選擇多態(tài)性較強(qiáng)的BC1位點(diǎn)作為優(yōu)化的對象。該位點(diǎn)可對3份大白菜雜交種進(jìn)行純度鑒定，通過互為差異的特征譜帶，尋找雜交種特征譜帶帶型為雙親互補(bǔ)帶型的引物，確定引物BC1可以同時對3份大白菜雜交種進(jìn)行純度鑒定。位點(diǎn)信息及PCR引物序列詳見表2。

1.2.3 SSR-PCR 反應(yīng)體系的優(yōu)化 以大白菜 2 號及其親本為試驗材料，選用已開發(fā)引物BC1，應(yīng)用L16（ 45 ） 正交試驗設(shè)計（表3）， 對Mg2+ 濃度、dNTP、引物濃度、模板濃度、Taq DNA 聚合酶進(jìn)行 5 因素 4 水平上的篩選， 以確定最佳組合，其中各處理均為10 μL反應(yīng)體系，除表中各變化因素外，每個處理中還含有1 μL 10×PCR Buffer（Mg2+ free），加ddH2O補(bǔ)足10 μL，試驗設(shè) 2 個重復(fù)。

1.2.4 SSR-PCR擴(kuò)增程序 在ABI Veriti梯度PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行，94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性60 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35 個循環(huán)，72 ℃延伸7 min后于4 ℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于-20 ℃冰箱保存。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測 在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳。電泳儀采用BIO-RAD 3000 高壓電泳儀。電泳條件為：先100 V 10 min，后調(diào)整為250 V 30 min，上樣量為1 μL。銀染：染色8 min （加入6 mL10%硝酸銀溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配）、漂洗（不超過15 s）、顯影（加入9 g氫氧化鈉，臨用前加入3 mL甲醛溶液）、終止、清洗；掃描成像并記錄結(jié)果。

1.2.6 反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測 利用優(yōu)化的體系，對可用引物BC1進(jìn)行純度鑒定的 3 份大白菜雜交種進(jìn)行單株育苗試驗，每個品種選取單株幼苗 140 株進(jìn)行純度鑒定，統(tǒng)計結(jié)果并與田間試驗結(jié)果進(jìn)行對比，從而確定所優(yōu)化體系的可用性、穩(wěn)定性及準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取與檢測

DNA的提取是進(jìn)行PCR的基礎(chǔ)步驟與環(huán)節(jié)，其質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到試驗的成敗。本試驗采用改良CTAB法提取純化得到質(zhì)量較高的基因組DNA（圖1），主帶清晰，無拖尾帶，無雜質(zhì)及RNA干擾，純度較高，可很好地應(yīng)用于大白菜純度鑒定EST-SSR檢測體系優(yōu)化。

2.2 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系的優(yōu)化

按表3設(shè)計的16個處理進(jìn)行EST-SSR反應(yīng)后，獲得的產(chǎn)物進(jìn)行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，在16個處理中均能擴(kuò)增出產(chǎn)物，處理2、7、12、13、14擴(kuò)增主帶位置出現(xiàn)較強(qiáng)非特異性譜帶干擾；處理5、6、9、10、11、15靈敏度過高，特征譜帶較深，非特異性擴(kuò)增明顯；處理1、4、8、16中處理16靈敏度相對適中，非特異性譜帶較少，主帶清晰突出，為本研究最佳組合。因此，該組合所用PCR反應(yīng)體系為最佳體系，即在10 μL反應(yīng)體系中包含3.0 mmol·L-1 MgCl2、 400 μmol·L-1 dNTPs、0.20 μmol·L-1 SSR 引物、4 ng模板DNA和0.05 U Taq酶。

2.3 反應(yīng)體系穩(wěn)定性檢測

對3份大白菜雜交種進(jìn)行隨機(jī)育苗試驗，每份雜交種提取單株140株，利用引物BC1進(jìn)行EST-SSR分子標(biāo)記純度鑒定。純度鑒定結(jié)果如圖3～5。大白菜‘秋綠75’不純單株3株，不純單株編號為4、18、26，種子純度為97.85%；大白菜‘秋綠60’不純單株2株，不純單株編號為1、16，種子純度為98.57%；大白菜‘津白56’不純單株3株，不純單株編號為9、10、26，種子純度為97.85%。所得純度結(jié)果與傳統(tǒng)田間純度鑒定結(jié)果基本一致，從而確保所篩選引物和建立體系的可靠性及穩(wěn)定性。

3 討 論

目前，種子純度鑒定技術(shù)為適應(yīng)商業(yè)化育種的需要已經(jīng)逐漸發(fā)展到分子水平，隨著近年來GenBank上公布的常見物種EST序列的日益增多，及SSR引物設(shè)計軟件的不斷更新完善，使得EST-SSR標(biāo)記技術(shù)凸顯了其多態(tài)性高、特異性強(qiáng)、呈現(xiàn)共顯性的特點(diǎn)，同時由于其還具有獲取便捷、信息量大、花費(fèi)低、效率高等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于水稻、小麥、大麥、葡萄、玉米、甘蔗等植物分子連鎖圖譜的構(gòu)建和遺傳多樣性分析[6-10]。

利用正交試驗設(shè)計對EST-SSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，反應(yīng)體系中的Mg2+ 濃度、dNTP、引物濃度、模板濃度、Taq DNA 聚合酶各因素均會對反應(yīng)結(jié)果造成影響，從單因素變量考慮，一般認(rèn)為引物濃度越大，擴(kuò)增產(chǎn)物濃度越高，但同時產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增、引物二聚體、甚至堿基錯配的幾率也越大；DNA模板濃度過高，有可能會過早的消耗盡引物，造成隨機(jī)延伸或終止，出現(xiàn)背景彌散或加重，但一般而言模板的量只要不是極度過多或過少，對反應(yīng)體系造成的影響不是十分顯著；Taq酶濃度會影響擴(kuò)增效率，酶濃度過高會產(chǎn)生錯配擴(kuò)增。而對于多因素變量而言，很難確定在某一處理中單因素所起的影響整體反應(yīng)結(jié)果的作用，因為各因素之間存在著微妙的相互結(jié)合、消耗和競爭的共同作用效果，比如Taq酶的活性決定于Mg2+的濃度，而作為PCR反應(yīng)的重要底物dNTPs，當(dāng)其含量不足時將直接影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行，但它能與Mg2+結(jié)合，當(dāng)其含量過高時將與Taq酶競爭Mg2+，使Taq酶活性下降，擴(kuò)增產(chǎn)物減少，因此，Mg2+和dNTPs濃度的變化對最后的擴(kuò)增結(jié)果影響較大。因此，在實際操作中，應(yīng)根據(jù)試驗情況進(jìn)行選擇或做適當(dāng)調(diào)整[11-13]。

利用正交試驗設(shè)計對大白菜EST-SSR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，目的是得到主帶單一、清晰、穩(wěn)定、非特異性擴(kuò)增較少的譜帶，用于純度判定。正交試驗設(shè)計是研究多因素多水平的一種設(shè)計方法，它根據(jù)正交性從全面試驗中挑選出部分有代表性的點(diǎn)進(jìn)行試驗，這些有代表性的點(diǎn)具備了均衡分散性、齊整可比性的特點(diǎn)，可有效解決理論上需要進(jìn)行的試驗次數(shù)與實際可行試驗次數(shù)之間的矛盾。科學(xué)地提高了試驗效率，從而確定了大白菜EST-SSR純度鑒定的優(yōu)化體系，為大白菜分子標(biāo)記純度鑒定的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 郭寶生，張建宏，劉素恩，等.棉花品種分子標(biāo)記遺傳多樣性檢測[J].華北農(nóng)學(xué)報，2010（S1）：47-49.

[2] 李麗，王海崗，張曉麗，等.SSR分子標(biāo)記在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（3）：15-18.

[3] 蘭青闊，李歐靜，張繼波，等. 津南芹菜EST-SSR指紋圖譜的構(gòu)建及遺傳差異分析[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，18（5）：7-11.

[4] 趙新，王永，蘭青闊，等. EST-SSR標(biāo)記在大白菜雜交種種子純度鑒定中的應(yīng)用[J].分子植物育種，2012（10）：1145-1150.

[5] 趙美華，逯保德，蘭創(chuàng)業(yè)，等.大白菜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（1）：12-16.

[6] Cho Y G， Ishil T， Tenmykh S， et al. Diversity of microsatellites derived from genomic libraries and Gen Bank sequences in rice（Oryza sativa L.）[J].Theoretical and Applied Genetics，2000，100：713-722.

[7] Nicot N， Chiquet V， Gandon B， et al. Study of simple sequence repeat （SSR）markers from wheat expressed sequence tags（ESTs）[J].Theoretical and Applied Genetics，2004，109：800-805.

[8] Thiel T， Michalek W， Varshney R K ， et al. Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley （Hordeum vulgare L .）[J].Theoretical and Applied Genetics，2003，106（3）：412-422.

[9] Xu Y， Ma R C， Xie H， et al. Development of SSR markers for the phylogenetic analysis of almond trees from China and the Mediterranean region[J]. Genome， 2004， 47：1091-1104.

[10] 楊春霞，溫強(qiáng)，葉金山，等. 枳殼EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)[J]. 分子植物育種，2011，9 （1）：123-127.

[11] 石磊，李麗，鄭曉鷹，等. 大白菜SSR檢測體系的優(yōu)化[J]. 分子植物育種，2007，5（1）：110-116.

[12] 佟海申，宋琳，張志剛，等.大白菜EST—SSR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物[J].科技導(dǎo)報，2010，28（3）：73-81.

[13] 吳春燕，高義，宋廷宇，等.正交設(shè)計優(yōu)化大白菜ISSRPCR反應(yīng)體系[J].北方園藝，2012（5）：127-129.