昆蟲抗菌肽在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用潛力

摘 要：綜述了昆蟲抗菌肽的分類、抗菌機(jī)制和在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，淺析了昆蟲抗菌肽在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的優(yōu)勢(shì)和實(shí)用發(fā)展?jié)摿Α?/p>

關(guān)鍵詞：昆蟲抗菌肽；抗菌機(jī)制；農(nóng)業(yè)生產(chǎn)

中圖分類號(hào)：Q966 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2013.03.012

抗菌肽是具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性的小分子肽。昆蟲是世界上物種種群最多的生物，為適應(yīng)多樣的生活環(huán)境，昆蟲自身可形成獨(dú)特的免疫系統(tǒng)，并自行分泌抗菌肽。昆蟲抗菌肽是最先被發(fā)現(xiàn)的一類抗菌肽，多帶正電荷，水溶性好，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，無(wú)免疫原性，對(duì)宿主細(xì)胞具有選擇殺傷性，均為堿性多肽，N端為多聚腺苷酸殘基，C端均酰胺化，第二位氨基酸多為色氨酸（Try），具兩親性結(jié)構(gòu)，分子量約為4 kDa，可抗革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌。

1 昆蟲抗菌肽的分類與結(jié)構(gòu)

昆蟲抗菌肽的分子量一般小于10 kDa，主要從鱗翅目（Lepidoptera）、雙翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）等中分離提取。根據(jù)其抗菌譜，昆蟲抗菌肽分為：（1）抗革蘭氏陰性菌，即富含脯氨酸的抗菌肽（Proline-rich Peptides）和少數(shù)富含半胱氨酸的抗菌肽（Cysteine-rich Peptides）以及富含甘氨酸的抗菌肽（Glycine-rich Peptides）；（2）抗革蘭氏陽(yáng)性菌，通常多為富含半胱氨酸的抗菌肽；（3）既抗革蘭氏陽(yáng)性菌又抗革蘭氏陰性菌的無(wú)特殊氨基酸結(jié)構(gòu)的抗菌肽。

無(wú)特殊氨基酸結(jié)構(gòu)的抗菌肽，如天蠶素（Cecropins），廣泛存在于家蠶、柞蠶等中。分子內(nèi)部含有兩性分子的α-螺旋結(jié)構(gòu)，具有保守氨基酸殘基，但不含半胱氨酸和二硫橋。

富含半胱氨酸的抗菌肽，富含半胱氨酸，具有二硫橋，廣泛分布于半翅目、雙翅目等中。如昆蟲防御素（Thanatin）分子內(nèi)部含有兩性分子的α-螺旋和二硫橋，且二硫橋在抗菌過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。

富含脯氨酸的抗菌肽多在雙翅目、半翅目、鞘翅目、膜翅目等中發(fā)現(xiàn)，由約15～34個(gè)氨基酸殘基組成，脯氨酸含量占25%以上。如蜜蜂血淋巴中的Aptdaecin，其氨基酸組成成分中，脯氨酸含量高達(dá)33%。

富含甘氨酸的抗菌肽多分布于鱗翅目、膜翅目等中，具有O-糖基化。如來(lái)自Gloverins家族的抗菌肽，其一級(jí)結(jié)構(gòu)富含大量甘氨酸，且位置高度保守，無(wú)半胱氨酸，熱穩(wěn)定性好。

2 抗菌肽的抗菌機(jī)制

目前，抗菌肽的作用機(jī)制可根據(jù)作用對(duì)象的類型分為：抗真菌型、抗細(xì)菌型和抗病毒型。

2.1 抗真菌活性作用機(jī)制

Histatin 5是從人體唾液中提取出的具有抗真菌活性的多肽。Helmerhors等[1]研究發(fā)現(xiàn)，Histatin 5為陽(yáng)離子肽，主要以α-螺旋結(jié)構(gòu)或β-折疊形式存在，具有兩親性。由于堿性抗菌肽所帶的正電荷與線粒體膜上的負(fù)電荷通過(guò)靜電作用互相吸引，Histatin 5能作為線粒體引導(dǎo)肽的類似物與線粒體膜結(jié)合，且不依賴于線粒體膜表面的蛋白，因?yàn)閴A性抗菌肽和膜負(fù)電勢(shì)的因素，與線粒體結(jié)合造成線粒體膜滲透勢(shì)改變，線粒體破裂，真菌死亡。

2.2 抗細(xì)菌活性作用機(jī)制

肽分子并不是插入膜內(nèi)，而是與質(zhì)膜外小葉表面的局部連接?？咕目赏ㄟ^(guò)氨基降低菌體膜的通透性和膜電勢(shì)差，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的泄漏，最終致使菌體細(xì)胞發(fā)生裂解[2]。

潘凌子等[3]通過(guò)電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，穿膜孔洞模型的作用機(jī)制是由于抗菌肽（如蜂毒肽）能夠引起菌體細(xì)胞穿孔或破裂，導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)外流，從而使菌體發(fā)生裂解，最終死亡。

非膜裂解型的作用機(jī)制主要包括抑制細(xì)胞呼吸、生物大分子的合成及細(xì)胞壁的合成等。

Carlsson等[3]研究發(fā)現(xiàn)，40 μmol·L-1昆蟲防御素即可導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞呼吸變?nèi)酰? h后呼吸完全停止，這表明昆蟲防御素是通過(guò)抑制細(xì)菌的呼吸作用來(lái)產(chǎn)生抗菌效果的[4]。而蜂毒肽除了能夠誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞形成穿膜孔洞，還能夠抑制菌體與調(diào)控細(xì)胞分裂相關(guān)的蛋白合成，促使細(xì)胞分裂停滯于Ⅰ期（或 G1 期），進(jìn)而影響細(xì)胞分裂。樗蠶素（attacin）可通過(guò)干擾大腸桿菌胞外膜蛋白OmpC、OmpF、OmpA和LamB基因的轉(zhuǎn)錄，從而抑制胞外蛋白的合成，最終改變細(xì)菌，尤其是革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致菌體死亡[5]。

麻蠅毒素Ⅱ（SarcotoxinsⅡ）由于無(wú)法維持正在形成中的細(xì)胞壁的正常形態(tài)，進(jìn)而抑制細(xì)胞壁的形成，因此具有抗菌功效。麻蠅毒素Ⅱ?qū)σ研纬傻募?xì)胞壁則無(wú)任何影響[6]。

2.3 抗病毒活性作用機(jī)制

抗菌肽的抗病毒活性作用機(jī)制是利用抗菌肽與病毒蛋白具有相似性，從而阻止病毒對(duì)植物的侵染。如蜂毒肽及類似物K17的結(jié)構(gòu)與煙草花葉病毒的衣殼蛋白的部分氨基酸序列存在相似性，以偽裝病毒包被蛋白干擾病毒正常組裝。

3 昆蟲抗菌肽在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用潛力

現(xiàn)今的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，越來(lái)越需要提高植物自身的抗性以適應(yīng)不斷變化的環(huán)境。在農(nóng)藥和畜牧業(yè)的飼料中，需要逐漸減少抗生素的使用。昆蟲抗菌肽作為農(nóng)業(yè)中的新興抗菌藥物已被運(yùn)用到各個(gè)方面，顯示了良好的應(yīng)用潛力。

3.1 提高作物抗性

天蠶素是昆蟲抗菌肽的代表，其抗菌的高效快速性和對(duì)真核細(xì)胞的無(wú)毒性具有很高的應(yīng)用價(jià)值。李乃堅(jiān)等[7]構(gòu)建雙價(jià)天蠶抗菌肽B基因和柞蠶抗菌肽D基因?qū)肜苯?，獲得抗青枯病得T0代轉(zhuǎn)基因工程辣椒株系，經(jīng)分子生物學(xué)檢測(cè)證明，抗菌肽D、B基因成功轉(zhuǎn)入辣椒，并在T0、T1、T2代呈現(xiàn)出明顯的抗青枯病性狀。劉清神等[8]在其基礎(chǔ)上，對(duì)T3代抗菌肽轉(zhuǎn)基因辣椒的l1個(gè)株系進(jìn)行了PCR分子生物學(xué)檢測(cè)，證明T3代抗菌肽轉(zhuǎn)基因辣椒仍保持外源抗菌肽基因；對(duì)T3代轉(zhuǎn)基因辣椒群體進(jìn)行了抗青枯病測(cè)定試驗(yàn)，轉(zhuǎn)基因辣椒群體抗病力提高，表明在轉(zhuǎn)基因辣椒中天蠶抗菌肽D、B 基因得到了有效表達(dá)，從而減緩了青枯病癥狀。

董燕等[9]研究將一種新型融合抗菌肽基因轉(zhuǎn)入魚腥草，以培育抗菌活性增強(qiáng)、抗病害能力提高的魚腥草新品種。魚腥草作為一種常用中草藥，人工栽培后，其生長(zhǎng)環(huán)境發(fā)生改變，抗病蟲害能力降低，試驗(yàn)結(jié)果顯示抗菌肽Cecropin B和兔NP-1基因融合表達(dá)可提高魚腥草的抗病性。

王關(guān)林等[10]對(duì)植物的幼苗分別噴施5，20，50，100 mg·L-1蜂毒肽稀釋液后，幼苗的生理指標(biāo)中，葉綠素含量表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)，高濃度稍有抑制；用蜂毒肽稀釋液浸種后，種子的呼吸強(qiáng)度隨著蜂毒肽的濃度提高而增強(qiáng)，證明了對(duì)種子的有氧呼吸，代謝速度有加快、提高的作用，并可以促進(jìn)種子萌發(fā)，提高發(fā)芽率。浸種萌發(fā)后，幼苗的可溶性糖含量、葉綠素含量、核酸和蛋白質(zhì)的含量變化情況與幼苗噴灑類似。5，50 mg·L-1噴施幼苗后，POD、SOD、PPO等植物防御酶活性在一定時(shí)間內(nèi)比對(duì)照活性均有所升高，5 mg·L-1的中低濃度作用比較明顯，并且作用迅速。因此，蜂毒肽可以誘導(dǎo)植物細(xì)胞加強(qiáng)植物自身的防御系統(tǒng)。

Osusky等[11]分別將家蠶的天蠶素和蜂毒肽基因合成嵌合體（MsrA1）導(dǎo)入馬鈴薯植株中，在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得對(duì)早、晚疫病和軟腐病的抗性。

3.2 飼料添加劑

由于昆蟲抗菌肽分子量小，水溶性好，熱穩(wěn)定性強(qiáng)，無(wú)免疫原性，對(duì)人畜無(wú)毒副作用，尤其防御素對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌非常有效， 富含Gly的抗菌肽對(duì)革蘭氏陰性菌非常有效，它不是細(xì)胞毒素，可以被人體內(nèi)的酶系降解、消化，因此昆蟲抗菌肽可以作為飼料添加劑。

昆蟲抗菌肽熱穩(wěn)定性強(qiáng)體現(xiàn)在，可以在水中煮沸30 min不變性，能夠承受飼料生產(chǎn)中的高溫條件，可以被作為添加劑加入飼料中。例如用柞蠶抗菌肽制劑代替抗生素在斷奶仔豬飼料中的應(yīng)用研究，就取得了很好的效果[12]。

何丹林等[13]添加蠶抗菌肽AD—酵母制劑500 g·t-1對(duì)雞小腸內(nèi)容物酶活性、飼料能量和氮利用率及飼料中細(xì)菌和霉菌繁殖的影響研究表明，蠶抗菌肽AD—酵母制劑對(duì)粵黃雞小腸內(nèi)容物中淀粉酶和蛋白酶活性和飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值無(wú)不良影響；對(duì)飼料中霉菌繁殖無(wú)抑制作用，但能有效地抑制飼料中的細(xì)菌繁殖；有希望成為傳統(tǒng)飼料抗菌劑的替代品。

黃永彤等[14]分別用抗菌肽與抗生素飼養(yǎng)肉食雞，比較發(fā)現(xiàn)抗菌肽喂養(yǎng)出的雞在出欄率、平均體重等指標(biāo)中均無(wú)顯著差異，而且飼用抗菌肽的一組表現(xiàn)出對(duì)生長(zhǎng)和免疫力的提高有促進(jìn)作用，成活率提高10%。從而證明抗菌肽替代抗生素投入飼料中是可行的。并且經(jīng)過(guò)毒理試驗(yàn)證明，運(yùn)用抗菌肽做飼料添加劑安全無(wú)毒副作用，且無(wú)污染無(wú)殘留。梁潔等[15]進(jìn)一步研究證明，抗菌肽有預(yù)防與治療小雞呼吸道及消化道疾病，提高雞群存欄率，增加雞體質(zhì)量和降低料肉比的作用，可作為抗生素類飼料添加劑代替物進(jìn)行研究開發(fā)。

通過(guò)抗菌肽在酵母中的高效表達(dá)，產(chǎn)生的抗菌肽酵母制劑添加到飼料中，對(duì)預(yù)防和治療仔豬腹瀉、雛雞白痢和對(duì)蝦的病毒病都有很好的效果[16]。

3.3 食品保鮮

我國(guó)在食品工業(yè)中的防腐劑一直以苯甲酸、山梨酸及其鹽類和對(duì)羥基苯甲酸脂類等化學(xué)合成劑為主，使用防腐劑過(guò)多會(huì)影響身體健康。研究人員開始著眼于將昆蟲抗菌肽作為新型防腐劑，在食物產(chǎn)品保鮮中試驗(yàn)應(yīng)用，提高食用安全性，保持食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、風(fēng)味、顏色等。

在肉類品加工過(guò)程中，抗菌肽以很小的劑量就可以很好的控制菌群生長(zhǎng)，保持肉的風(fēng)味和色澤，同時(shí)能夠降低亞硝酸鹽的含量，從食用安全健康的角度考慮，是食品保鮮發(fā)展的新方向。

抗菌肽還可以應(yīng)用于罐裝食品，在加工過(guò)程中，因改變了保鮮劑而調(diào)整了殺菌溫度。殺菌溫度的降低，可以為人們提供更好的食物品質(zhì)和口感，并且延長(zhǎng)了保質(zhì)期。

茍仕金等[17]發(fā)明了轉(zhuǎn)基因蠅蛆抗菌肽用于食品防腐的方法，并申請(qǐng)了專利。該方法以轉(zhuǎn)基因蠅蛆為原材料， 經(jīng)過(guò)數(shù)步的分離提取， 生產(chǎn)出用于食品防腐和蔬菜水果的保鮮劑。

抗菌肽還應(yīng)用于熱加工食品，可以用來(lái)防止巴氏殺菌后的再污染，還可以用于防止食品發(fā)酵過(guò)程中的雜菌污染[18]。

羅富英等[19]運(yùn)用0.01%～0.05%濃度范圍內(nèi)的天然蠶蛹抗菌肽防腐溶液對(duì)鮮豬肉進(jìn)行防腐試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)濃度為0.05%蠶蛹抗菌肽防腐液對(duì)乳酸菌、微球菌、葡萄球菌抑菌效果分別高達(dá)89.0%，94.3%，98.8%。經(jīng)過(guò)蠶蛹抗菌肽防腐液處理的鮮豬肉在室溫下能貯藏7 d，作為天然食品防腐劑的前景非常廣闊。

3.4 生物農(nóng)藥

生物農(nóng)藥是利用生物活體或由生物產(chǎn)生的活性成分 ，以及化學(xué)合成的具天然化合物結(jié)構(gòu)的物質(zhì) ，制備出的可防治植物病蟲害和雜草及能調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的制劑。具有環(huán)境兼容性好，保護(hù)物種多樣性，對(duì)人畜無(wú)靶標(biāo)生物威脅，來(lái)源廣泛的多種優(yōu)點(diǎn)。對(duì)農(nóng)業(yè)和環(huán)境的可持續(xù)性發(fā)展都有著重大的意義。

潘凌子等[3]將植物幼苗噴施不同濃度的蜂毒肽測(cè)定其防御酶活性，證實(shí)蜂毒肽能激活植物的防御酶系統(tǒng)，對(duì)植物有保護(hù)作用。蜂毒肽稀釋液浸種的試驗(yàn)結(jié)果顯示，蜂毒肽對(duì)農(nóng)作物種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)毒害。試驗(yàn)還證明蜂毒肽對(duì)測(cè)試的13種農(nóng)作物病原菌和4種致病菌均有抑制作用，其中包括了細(xì)菌性病原菌和真菌性病原菌，尤其對(duì)白菜軟腐病菌，蜂毒肽在μg級(jí)就可以發(fā)揮作用。不僅體現(xiàn)了抑菌譜廣、速效、高效等優(yōu)點(diǎn)，而且可克服現(xiàn)有生物農(nóng)藥存在的緩效性、低效性和抑菌譜窄等不足。在室溫范圍內(nèi)， 蜂毒肽的抑菌作用對(duì)溫度不敏感，在各季節(jié)均能顯示出強(qiáng)效的抑菌作用。綜上，蜂毒肽可能作為理想的新生物農(nóng)藥，突破現(xiàn)存的農(nóng)藥發(fā)展瓶頸。

李志等[18]提出柞蠶還是重要的動(dòng)物生物反應(yīng)器資源，利用其可研究開發(fā)許多有益抗菌肽、 生物農(nóng)藥，并能為提高農(nóng)村收入，保障千億斤糧食產(chǎn)能工程的糧食安全做貢獻(xiàn)。

4 展 望

由于昆蟲體內(nèi)抗菌肽含量低，分離純化難度大，成本高，梁潔等[20]運(yùn)用轉(zhuǎn)基因酵母菌在500 L罐中發(fā)酵，其發(fā)酵液的殺菌效價(jià)達(dá)到6 734 IU·mL-1，抗菌肽產(chǎn)量高且穩(wěn)定，但應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)還需要更進(jìn)一步的研究和探索。在轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域中，昆蟲抗菌肽也逐漸成為研究的熱點(diǎn)項(xiàng)目，尤其在農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因抗性植物中特別被推崇。在臨床試驗(yàn)中也證實(shí)昆蟲抗菌肽是選擇性殺傷，暫無(wú)對(duì)寄主細(xì)胞傷害作用的報(bào)道，所以可以應(yīng)用于抗菌、抗腫瘤、抗病毒的醫(yī)藥，生物農(nóng)藥和水產(chǎn)養(yǎng)殖等產(chǎn)業(yè)中。從昆蟲抗菌肽的作用機(jī)制作為突破口，可以更深入了解其藥理藥效，準(zhǔn)確的應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。

參考文獻(xiàn)：

[1] Helmerhorst E J， Van’t H W， Breeuwer P.Characterization of histatin 5 with respect to amphipathicity， hydrophobicity， and effects on cell and mitochondrial membrane integrity excludes a candidacidal mechanism of pore formation[J].Journal of Biological Chemistry， 2000， 276（8）： 5643-5649.

[2] Bessin Y， Saint N，Marri L， et al. Antibacterial activity and pore-forming properties of ceratotoxins： A mechanism of action based on the barrel stave model[J]. Biochimica et Biophysica Acta （BBA） - Biomembranes， 2004， 1667（2）： 148-156.

[3] 潘凌子，那杰，邢卓，等.蜂毒肽對(duì)農(nóng)作物病原菌的抑殺作用[J].科學(xué)通報(bào)， 2007， 52（3）： 291-296.

[4] Carlsson A， Engstr?m P，Palva E T， et al. Attacin， an antibacterial protein from Hyalophora cecropia， inhibits synthesis of outer membrane proteins in Escherichia coli by interfering with omp gene transcription[J]. Infect Immun， 1991， 59（9）： 3040-3045.

[5] Sharma A ，Sharma R，Imamura M， et al. Transgenic expression of cecropin B， an antibacterial peptide from Bombyx mori， confers enhanced resistance to bacterial leaf blight in rice[J]. FEBS Lett， 2000， 484（1）： 7-11.

[6] Ando K， Natori S. Inhibitory effect of sarcotoxin IIA， an antibacterial protein of Sarcophaga peregrina， on growth of Escherichia coli[J]. Faculty of Pharmaceutical Sciences， 1988， 103（4）： 735-739.

[7] 李乃堅(jiān)，余小林，李穎，等.雙價(jià)抗菌肽基因轉(zhuǎn)化辣椒[J].熱帶作物學(xué)報(bào)， 2000， 21（4）： 45-41.

[8] 劉清神，李乃堅(jiān)，黃自然，等.T3代抗菌肽轉(zhuǎn)基因辣椒的PCR檢測(cè)及青枯病抗性測(cè)定[J]. 廣東蠶業(yè)， 2005， 39（2）： 20-24.

[9] 董燕，張瑩，易浪，等. 抗菌肽cecropinB和兔NP_1融合基因轉(zhuǎn)化魚腥草的研究[J].中國(guó)中藥雜志， 2010， 35（13）： 1160-1165.

[10] 王關(guān)林，邢卓，潘凌子，等.蜂毒肽對(duì)農(nóng)作物生理指標(biāo)及防御系統(tǒng)酶影響的研究[J].作物學(xué)報(bào)， 2006， 32（4）： 593-596.

[11] Osusky M，Zhou G， Osuska L， et al. Transgenic plants expressing cationic peptide chimeras exhibit broad-spectrum resistance to phytopathogens[J]. Nat Biotech， 2000， 18（11）： 1162-1166.

[12] 金小寶， 朱家勇. 昆蟲抗菌肽及其應(yīng)用[J].中國(guó)寄生蟲病防治雜志， 2004， 17（2）： 125-127.

[13] 何丹林， 溫劉發(fā)， 鄧春柳，等.蠶抗菌肽AD-酵母制劑對(duì)粵黃雞腸道消化酶和飼料品質(zhì)的影響[J].中國(guó)家禽， 2004， 26（7）： 9-10.

[14] 黃永彤， 黃自然，黃建清，等.抗菌肽與抗生素飼喂肉雞的效果比較[J].廣東飼料， 2004， 13（2）： 24-25.

[15] 梁潔， 李運(yùn)南， 董加喜.抗菌肽飼喂肉雞的應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代食品科技， 2009， 25（4）： 416-434.

[16] 文加才， 秦永忠， 宋愛剛.陽(yáng)離子抗菌肽的研究進(jìn)展[J].國(guó)外醫(yī)藥（抗生素分冊(cè)）， 2002， 23（6）： 267-271.

[17] 茍仕金，茍鴻鷹，王成余.轉(zhuǎn)基因家蠅蛆中提取的基因抗菌肽用于食品防腐和蔬菜水果保鮮劑：中國(guó)，01106362.9[P]. 2001-10-31.

[18] 李志， 王東風(fēng)，張慶良.黑龍江省蠶業(yè)資源綜合利用產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及展望[J].北方蠶業(yè)， 2010， 31（4）： 1-3.

[19] 羅富英， 寧學(xué)林， 吳桂枝，等.天然蠶蛹抗菌肽對(duì)鮮豬肉的防腐抑菌效果研究[J].食品工業(yè)科技， 2010， 31（3）： 117-118.

[20] 梁潔，彭中健，梁淑娃，等.轉(zhuǎn)基因酵母菌深層發(fā)酵生產(chǎn)抗菌肽的研究[J].現(xiàn)代食品科技， 2009， 25（6）： 639-645.