小鼠NPC細(xì)胞RFX1ChIPSeq數(shù)據(jù)分析

摘要：利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中小鼠Embryonic Stem Cells （ESC）與Neural Progenitor Cells （NPC）的基因芯片結(jié)果及NPC時(shí)期的RFX1ChIPSeq數(shù)據(jù)，進(jìn)行有關(guān)RFX1的分析，結(jié)果表明：RFX1結(jié)合位點(diǎn)富集在1，2，4，5，7，9，11染色體上，Y染色體上最少，其他染色體上比較均衡；在基因組中結(jié)合位點(diǎn)分布區(qū)域主要在基因的promoter區(qū)域，約有53.2%，其次是intergentic，占22.5%，body區(qū)域，占13.1%，enhancer區(qū)域，占11.2%.說(shuō)明RFX1是以結(jié)合在基因的promoter區(qū)為主要形式對(duì)目的基因進(jìn)行調(diào)控.同時(shí)在DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)中用生物信息學(xué)方法探索了RFX1靶基因的生物學(xué)功能分類.

關(guān)鍵詞：神經(jīng)先祖細(xì)胞；RFX1；ChIPSeq

中圖分類號(hào)：Q341文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

轉(zhuǎn)錄因子RFX1（regulatory factor X1）是RFX基因家族（小鼠基因組中含有7個(gè)RFX家族成員）第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的成員，以結(jié)合蛋白的形式存在于主要組織相容性復(fù)合物分類II基因（major histocompatibility complex （MHC） class II）啟動(dòng)子中＼[1＼]，且在人類基因組中具有大量的結(jié)合位點(diǎn)＼[2＼].前人的研究表明RFX1是RFX家族中最典型的成員，在各種組織中都有表達(dá)，尤其在哺乳動(dòng)物腦組織中表達(dá)量特別高＼[3＼]，其除了控制乙肝病毒I型增強(qiáng)子＼[4＼]及與纖毛起源形成有關(guān)外，有可能還對(duì)靶基因的活性具有重要的調(diào)控作用.

RFX1含有一個(gè)Cterminal抑制區(qū)域，與二聚化功能域相重疊；含有一個(gè)Nterminal激活區(qū)域，主要在基因的啟動(dòng)子區(qū)對(duì)基因起到抑制或激活作用＼[5＼].以往研究表明RFX1不是一個(gè)常規(guī)的轉(zhuǎn)錄因子，早期可能沒(méi)有活性，當(dāng)它的啟動(dòng)子與其他因子形成復(fù)合物時(shí)被激活或抑制[6-7].除了MHCII基因外，幾個(gè)潛在靶基因可能被RFX1與臨近的RFX2，RFX3共同調(diào)控.RFX1激活白介素5受體α基因＼[8＼]、促進(jìn)大鼠神經(jīng)特異性基因煙胺比林谷氨酸運(yùn)載體類型3基因的表達(dá)＼[9＼]，敲除線蟲中與RFX1同源基因，呈現(xiàn)嚴(yán)重的感覺(jué)器官缺陷癥，說(shuō)明RFX1在神經(jīng)系統(tǒng)中具有一定的作用，可能參與調(diào)控了感覺(jué)神經(jīng)的分化過(guò)程＼[10＼].RFX1與HDAC1（Histone deacetylase）相互作用抑制COL1A12和ID2的表達(dá)＼[11-13＼].RFX1通過(guò)與HDAC1及DNMT1（DNA methyltransferases）相互作用抑制分化抗原CD11a與CD70的表達(dá)，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡綜合癥中有重要的作用＼[14＼].RFX1抑制cmyc基因、增殖細(xì)胞核抗原PCNA（proliferating cell nuclear antigen）、微管相關(guān)蛋白MAP1A、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子FGF1的表達(dá)＼[15-18＼].Xie等2008年通過(guò)生物信息方法預(yù)測(cè)RFX1在人基因組中含有15 319個(gè)結(jié)合位點(diǎn)＼[19＼]，小鼠中敲除RFX1導(dǎo)致胚胎早期致死＼[20＼]，人類染色體含有RFX1的一段19p13.12缺失，會(huì)導(dǎo)致多種先天性畸形，包括耳聾、淚道狹窄、斜視、雙側(cè)頸靜脈竇、先天性心臟畸形、胼胝體發(fā)育不全、小腦蚓部發(fā)育不全＼[21＼]，說(shuō)明RFX1在生物進(jìn)程中具有重要的調(diào)控作用.然而RFX1轉(zhuǎn)錄因子在靶基因中的結(jié)合位點(diǎn)特殊性及其相關(guān)調(diào)控機(jī)制還不完全清楚.

因此本文利用劍橋大學(xué)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中小鼠ESC與NPC的基因芯片結(jié)果及NPC時(shí)期的RFX1ChIPSeq數(shù)據(jù)，在DAVID（the Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery）（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行有關(guān)RFX1的結(jié)合位點(diǎn)及其靶基因功能分類等相關(guān)的生物信息學(xué)分析.

1材料與方法

11材料

NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中小鼠Embryonic Stem Cells （ESC）與Neural Progenitor Cells （NPC）的基因芯片結(jié)果及NPC時(shí)期的RFX1ChIPSeq數(shù)據(jù)，在DAVID（the Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery）（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行分析.

12實(shí)驗(yàn)方法

表達(dá)譜數(shù)據(jù)信號(hào)值使用的是文章已經(jīng)處理好的數(shù)據(jù)，Normalized signal intensity in log2；差異表達(dá)基因使用samr程序篩選，篩選標(biāo)準(zhǔn)，Pvalue<0.02% （delta=1.8），fold_change>2；RFX1 （peak detection）結(jié)合位點(diǎn)掃描使用 MACS程序，篩選標(biāo)準(zhǔn)：Pvalue<10-8，tag>10.

基因注釋及功能分析按照DAVID（the Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery）（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp）數(shù)據(jù)庫(kù)中提供的應(yīng)用指南進(jìn)行.

利用服務(wù)器，浪潮天梭10 000；具體配置，兩個(gè)計(jì)算節(jié)點(diǎn)，一個(gè)管理節(jié)點(diǎn)，20個(gè)核，40G內(nèi)存，硬盤146*6 G，CPU XeonE5620，運(yùn)算速度2 000億次/s；系統(tǒng)，RedHatLinux AS 5.4，對(duì)上述數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析.

2結(jié)果

21NPC的RFX1ChIPSeq數(shù)據(jù)分析

利用劍橋大學(xué)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中小鼠ESC與NPC的基因芯片結(jié)果及NPC時(shí)期的RFX1ChIPSeq數(shù)據(jù)，進(jìn)行有關(guān)RFX1的分析見(jiàn)圖1（a）在圖1中，RFX1ChIPSeq數(shù)據(jù)在軟件中顯示的RFX1在8號(hào)染色體區(qū)域的閱讀分布，可以看到RFX1富集峰、較低峰、本地區(qū)域的背景；（b）對(duì)照組在相同條件下的軟件閱讀圖；（c）RFX1基因在8號(hào)染色體上的基因結(jié)構(gòu)與位置，長(zhǎng)方體為外顯子、橫線為內(nèi)含子、兩側(cè)短長(zhǎng)方體為UTR，預(yù)測(cè)小鼠基因組RFX1結(jié)合位點(diǎn)信息.對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行初步分析顯示共有45 018個(gè)基因，其中下調(diào)的有2 432個(gè)，上調(diào)的有2 713個(gè).對(duì)NPC的RFX1ChIPSeq數(shù)據(jù)分析，將含有RFX1峰值的基因進(jìn)行了相關(guān)的分析，受RFX1調(diào)控的基因共有1 166個(gè)，其中494個(gè)是下調(diào)基因，672個(gè)是上調(diào)基因，RFX1可能在ESC向NPC分化中調(diào)控這些基因的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)精確分化.

22RFX1調(diào)控的基因分析

DAVID生物信息資源，能夠從大量基因列表中對(duì)其進(jìn)行快速、高效、多樣化的功能分析.與GoMiner，Gostat，Ontoexpress，GoToolBox，F(xiàn)atiGO，GFINDer，GOBar，GSEA等同類數(shù)據(jù)庫(kù)相比較，DAVID具有獨(dú)特特征和信息容量、集成和擴(kuò)展的后端注釋數(shù)據(jù)庫(kù)、先進(jìn)的模塊化富集算法、強(qiáng)大的綜合數(shù)據(jù)探索能力等優(yōu)勢(shì).Gene Functional Classification根據(jù)基因功能共同存在的注釋術(shù)語(yǔ)而非簡(jiǎn)單的基因名字將功能相關(guān)的基因一起作為一個(gè)單元，以較大的生物網(wǎng)絡(luò)為平臺(tái)，進(jìn)行探索和查看，而不是集中在單個(gè)基因水平上的搜尋.Function Annotation Chart 根據(jù)所提交的基因的注釋中提供的與其最為相關(guān)的典型的基因術(shù)語(yǔ)豐度進(jìn)行分類分析，包含GO terms， proteinprotein interactions， protein functional domains， disease associations， biopathways， sequence features， homology， gene functional summaries， gene tissue expression等40多種注釋分類.

將RFX1調(diào)控的1 166個(gè)基因在DAVID（the Database for Annotation， Visualization and Integrated Discovery）（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp）數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行GO分析，基本注釋涉及到了Fuctional_Categories（其子目錄TERMS共有5項(xiàng)，有3項(xiàng)被檢測(cè)到，分別是COG_ONTOLOGY，SP_PIR_KEYWORDS和UP_SEQ_FEATURE），Gene_Ontology（其子目錄TERMS共有23項(xiàng)，有3項(xiàng)被檢測(cè)到， 分別是GOTERM_BP_FAT和GOTERM_CC_FAT，GOTERM_MF_FAT），Pathways（其子目錄TERMS共有6項(xiàng)，有3項(xiàng)被檢測(cè)到，分別是BBID，BIOCARTA和KEGG_PATHWAY），Protein_Domains（其子目錄TERMS共有18項(xiàng)，有3項(xiàng)被檢測(cè)到，分別是INTERPRO，PIR_SUPERFAMILY，SMART）4個(gè)方面（表1），將每項(xiàng)注釋進(jìn)行了詳細(xì)分析.

2.2.1RFX1調(diào)控的基因功能分類

對(duì)這些基因的Fuctional_Categories分析（圖6），“√”標(biāo)注的選項(xiàng)是經(jīng)過(guò)網(wǎng)站的一些參考值對(duì)其進(jìn)行初步的篩選而優(yōu)先推薦的功能分類范疇；Chart后柱狀圖長(zhǎng)短表示有多少基因參與該分類生物進(jìn)程，是以百分?jǐn)?shù)的形式顯示.

圖6 Chart中是以PValue值排布的，越小值越可信，排在上面.選取COG_ONTOLOGY分類進(jìn)行簡(jiǎn)單分析，由圖7（在網(wǎng)站中點(diǎn)擊圖6顯示的Chart得到圖7）可知，在COG_ONTOLOGY分類中的基因主要參與了細(xì)胞分裂與染色體分離、胞內(nèi)運(yùn)輸與分泌、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞分裂與染色體支架4個(gè)生物進(jìn)程.

在SP_PIR_KEYWORDS分類中的基因參與了近70個(gè)生物進(jìn)程，主要以磷酸化、細(xì)胞核形成、乙?；?、選擇性剪輯進(jìn)程為主；UP_SEQ_FEATURE分類中的基因參與了60個(gè)生物進(jìn)程，主要以遺傳突變、剪接變體為主.很多基因涉及到幾個(gè)分類的很多進(jìn)程.

2.2.2 RFX1調(diào)控的基因本體論

在Gene_Ontology中分為23個(gè)小類，只有3類被標(biāo)記為“√”，是網(wǎng)站優(yōu)先推薦，比較有意義的分類見(jiàn)圖8.其中GOTERM_BP_FAT含有203個(gè)分項(xiàng)，以轉(zhuǎn)錄調(diào)控、負(fù)向調(diào)控為主；GOTERM_CC_FAT含有80個(gè)小項(xiàng)，以參與微管支架、胞內(nèi)非膜綁定細(xì)胞器的形成為主；GOTERM_MF_FAT含有59個(gè)小項(xiàng)，以參與核酸結(jié)合、DNA結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子活化為主.

3結(jié)論與討論

利用劍橋大學(xué)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中小鼠Embryonic Stem Cells （ESC）與Neural Progenitor Cells （NPC）的基因芯片結(jié)果及NPC時(shí)期的RFX1ChIPSeq數(shù)據(jù)，進(jìn)行有關(guān)RFX1的分析，RFX1結(jié)合位點(diǎn)富集在1，2，4，5，7，9，11染色體上，Y染色體上最少，其他染色體上比較均衡；以基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS為參照，距離TSS在-2～1 kb之間的為promoter，距離TSS在-50～2 kb之間的為enhancer，RFX1在基因組中結(jié)合位點(diǎn)分布區(qū)域主要在基因的promoter區(qū)域，約有53.2%，其次是intergentic，占22.5%，在body區(qū)域的分布，占13.1%，11.2%分布在enhancer區(qū)域.說(shuō)明RFX1是以結(jié)合在基因的promoter區(qū)為主要形式對(duì)目的基因進(jìn)行調(diào)控.

對(duì)基因芯片結(jié)果進(jìn)行初步分析顯示共有45 018個(gè)基因，其中下調(diào)的有2 432個(gè)，上調(diào)的有2 713個(gè)，結(jié)合NPC的RFX1ChIPSeq數(shù)據(jù)分析，含有RFX1峰值的基因共有1 166個(gè)，其中494個(gè)是下調(diào)基因，672個(gè)是上調(diào)基因.將這些基因在DAVID Bioinformatics Resources數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行基因注釋分析，這些基因被網(wǎng)站自動(dòng)篩選優(yōu)化分為以下幾類，F(xiàn)unctional_Categories（網(wǎng)站篩選分類后優(yōu)先推薦以“√”標(biāo)注顯示，分別為COG_ONTOLOGY，SP_PIR_KEYWORDS，UP_SEQFEATURE 3個(gè)子類）；Gene_Ontology（網(wǎng)站篩選分類后優(yōu)先推薦GOTERM_BP_FAT，GOTERM_CC_FAT，GOTERM_MF_FAT 3個(gè)子類）；Pathways（網(wǎng)站篩選分類后優(yōu)先推薦BBID，BIOCARTA，KEGG_PATHWAY 3個(gè)子類）；Protein_Domains（網(wǎng)站篩選分類后優(yōu)先推薦INTERPRO，PIR_SUPERFAMLIY，SMART 3個(gè)子類）.這些子類又分為Signal transduction mechanisms，membrane，phosphoprotein，transport等等若干TERM描述.

672個(gè)上調(diào)基因在分類中涉及多個(gè)功能重復(fù)出現(xiàn)頻率超過(guò)40次的有25個(gè)基因，下調(diào)的494個(gè)基因中重復(fù)出現(xiàn)頻率超過(guò)16次的有50個(gè)基因，基因重復(fù)次數(shù)與重復(fù)基因數(shù)呈現(xiàn)指數(shù)相關(guān).上調(diào)基因中在brain的發(fā)育與形態(tài)建成具有重要的作用，而下調(diào)基因中并未發(fā)現(xiàn)與brain相關(guān)的基因；上調(diào)基因中涉及7項(xiàng)、下調(diào)基因中涉及3項(xiàng)與cancer相關(guān)的TERM描述，分別涉及71，30個(gè)基因，包含Ccnd1，Mapk3，Pik3r1，Akt2，Pik3cd，Kras，Sos1等熱點(diǎn)基因.

綜上小鼠NPC細(xì)胞中有關(guān)RFX1數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，顯示了RFX1調(diào)控基因的廣泛性及多功能性，為今后RFX1調(diào)控機(jī)理的研究提供了良好的理論基礎(chǔ).

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