血清饑餓法同步化牛卵巢顆粒細胞周期的研究

摘要：研究了體細胞制備過程中細胞培養(yǎng)時間、血清饑餓濃度和饑餓時間對體細胞周期同步化的影響。體細胞為牛卵巢顆粒細胞，細胞用碘化丙啶（PI）染色法，用流式細胞儀檢測細胞周期。細胞傳代培養(yǎng)至第２、１０和２５代，在０．５％和０．０５％的血清饑餓濃度下誘導處理２、３、４和５ ｄ。試驗結(jié)果表明，第２、１０和２５代的細胞在Ｇ０／Ｇ１期的比例沒有差異（Ｐ＞０．０５）。培養(yǎng)液中添加０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ較對照組（１０％ ＦＣＳ）提高了細胞Ｇ０／Ｇ１期的比例（Ｐ＜０．０５），０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ試驗組獲得了相近的細胞Ｇ０／Ｇ１期比例（Ｐ ＞ ０．０５）。血清饑餓至第5天的細胞較第2天的細胞有高的Ｇ０／Ｇ１期的比例（Ｐ＜０．０５）。結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)至不同代的牛卵巢顆粒細胞對Ｇ０／Ｇ１期的比例沒有影響，血清饑餓和延長血清饑餓的時間能夠有效誘導體細胞進入Ｇ０／Ｇ１期。

關(guān)鍵詞：牛；顆粒細胞；血清饑餓；同步化；細胞周期

中圖分類號：Ｑ８１３；Ｓ８２３．３文獻標識碼：Ａ文章編號：0439－８114（２０12）08－1632-04

自１９９７年克隆綿羊Ｄｏｌｌｙ誕生以來，體細胞克隆技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，已在許多動物中獲得了成功［１－４］。在體細胞克隆研究中，供體細胞的選擇和制備是提高體細胞克隆效率的關(guān)鍵步驟［５，６］。研究者從供體細胞的類型、供體來源、培養(yǎng)時間、核質(zhì)同步化處理方法、培養(yǎng)液組成等方面進行了大量研究，以期獲得最好的供體細胞來提高體細胞克隆的效率。在體細胞克隆過程中，供體細胞和受體細胞核質(zhì)同步化是影響克隆效率的一個關(guān)鍵因素。處于Ｇ０／Ｇ１期的供體細胞通常被認為是理想的進行克隆研究的供體細胞，血清饑餓是誘導供體細胞進入Ｇ０／Ｇ１期階段的主要方法［７－９］。雖然人們嘗試使用不同的血清濃度和不同的血清饑餓時間來誘導供體細胞進入Ｇ０／Ｇ１期，也取得了不錯的試驗結(jié)果［１０，１１］，但很少將血清饑餓濃度、饑餓時間及細胞傳代階段與細胞周期的同步化做深入的關(guān)聯(lián)分析研究。該試驗研究了牛卵巢顆粒細胞制備過程中不同的血清濃度、血清饑餓時間以及體外培養(yǎng)時間對細胞周期同步化的影響。

１材料與方法

１．１材料

黃牛卵巢采自貴陽市某屠宰場；胎牛血清購自Gibco公司；DPBS、胰蛋白酶、DMEM、青霉素、鏈霉素、DMSO和透明質(zhì)酸購自Hyclone公司；RNaseA、碘化丙啶（PI）和TritonX-100購自南京凱基生物工程有限公司。

１．2牛卵巢顆粒細胞制備

黃牛卵巢從屠宰場收集后裝入加有１００ ＩＵ/ｍＬ 鏈霉素和１００ ＩＵ／ｍＬ青霉素的３０℃ 的ＤＰＢＳ中，于４ ｈ內(nèi)運回實驗室。將卵巢帶回實驗室后以ＤＰＢＳ清洗２次，從卵巢表面抽取卵泡液，?。?ｍＬ卵泡液用等量的０．２％透明質(zhì)酸酶消化３ ｍｉｎ，用ＤＭＥＭ離心洗滌（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，６ ｍｉｎ）２次，然后用ＤＭＥＭ調(diào)整顆粒細胞的密度為１×１０６個／ｍＬ，將顆粒細胞移入加體積分數(shù)１０％ＦＣＳ、２ ｍmｏｌ／Ｌ谷氨酰胺、１００ ＩＵ／ｍL青霉素和鏈霉素的ＤＭＥＭ中進行培養(yǎng)。待細胞長至８０％～９０％時進行細胞消化傳代培養(yǎng)。細胞消化用含０．１％胰蛋白酶和０．０２％ＥＤＴＡ的消化液，在３７．５℃下進行。細胞冷凍保存液是含有２０％（V／V） ＦＣＳ和５％ ＤＭＳＯ的ＤＭＥＭ。顆粒細胞培養(yǎng)至第２、１０和２５代，在０．５％和０．０５％ FCS濃度下分別處理２、３、４和５ ｄ以誘導顆粒細胞進入Ｇ０／Ｇ１期。

１．3ＰＩ染色法檢測細胞周期

培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細胞在３７．５ ℃下用０．１％胰蛋白酶和０．０２％ ＥＤＴＡ的消化液消化處理，然后移入５ ｍL離心管中用 ＤＰＢＳ離心洗滌（１ ５００ ｒ／ｍｉｎ，６ ｍｉｎ）２次，再用ＤＰＢＳ調(diào)整細胞濃度，使每個離心管中細胞的數(shù)目達到１×１０５個。細胞在４ ℃ 條件下加入３ ｍL預冷的 ７０％ 乙醇進行固定，過夜。固定后的細胞用提前預冷的ＤＰＢＳ洗滌離心２次，然后在每管中加入含有１ ｍｇ／ｍＬ ＲＮａｓｅ Ａ 的０．５ ｍＬ ＰＢＳ，在３７ ℃的水浴中處理３０ ｍｉｎ。細胞染色是在４ ℃ 條件下以０．１ ｍｇ／ｍＬ ＰＩ 和０．１％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００避光處理２ ｈ。染色處理結(jié)束的細胞用流式細胞儀檢測其細胞周期。

１．4試驗方法

１．4．１培養(yǎng)時間對體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細胞Ｇ０／Ｇ１期的影響探討牛卵巢顆粒細胞體外培養(yǎng)時間對其細胞周期的影響，分別將培養(yǎng)至第２、１０和２５代的牛卵巢顆粒細胞用０．５％ ＦＣＳ饑餓誘導處理２ ｄ，然后用ＰＩ染色法處理細胞，用流式細胞儀檢測不同培養(yǎng)時間細胞的細胞周期。

１．4．２不同濃度的FCS對牛卵巢顆粒細胞Ｇ０／Ｇ１期的影響探討血清饑餓在對誘導體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細胞進入Ｇ０／Ｇ１期的影響，將體外培養(yǎng)至第５代的牛卵巢顆粒細胞分別用含０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ的培養(yǎng)液誘導處理２ ｄ，對照組為１０％ ＦＣＳ。然后用ＰＩ染色法處理細胞，用流式細胞儀檢測不同試驗處理細胞的細胞周期。

１．4．３血清饑餓時間對牛卵巢細胞Ｇ０／Ｇ１期的影響探討血清饑餓時間對誘導體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細胞進入Ｇ０／Ｇ１期的影響，將體外培養(yǎng)至第５代的牛卵巢顆粒細胞用含０．５％ ＦＣＳ的培養(yǎng)液分別處理２、３、４和５ ｄ，然后用ＰＩ染色法處理細胞，用流式細胞儀檢測不同處理細胞的細胞周期。

１．5統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用ＳＰＳＳ １１．５軟件分析，結(jié)果以平均數(shù)±標準差來表示。

２結(jié)果與分析

２．１培養(yǎng)時間對牛卵巢顆粒細胞Ｇ０／Ｇ１期的影響

將培養(yǎng)至第２、１０和２５代的牛卵巢顆粒細胞用０．５％ ＦＣＳ饑餓誘導處理２ ｄ，不同培養(yǎng)時間對其細胞周期的影響見表１。第２、１０和２５代牛卵巢顆粒細胞Ｇ０／Ｇ１期的百分比分別為８２．６％、８４．７％和８３．８％，各組之間差異不顯著（Ｐ＞０．０５）。

２．２不同濃度的FCS對牛卵巢顆粒細胞Ｇ０／Ｇ１期的影響

將體外培養(yǎng)至第５代的牛卵巢顆粒細胞用加有０．５％ ＦＣＳ 和０．０５％ ＦＣＳ 的培養(yǎng)液誘導處理２ ｄ，不同濃度的ＦＣＳ對牛卵巢顆粒細胞進入Ｇ０／Ｇ１期的影響見表２。由表2可知，０．５％ ＦＣＳ和０．０５％ ＦＣＳ試驗組較對照組顯著提高了Ｇ０／Ｇ１期細胞的百分比（Ｐ＜０．０５），但試驗組間差異不顯著（Ｐ＞０．０５），兩者均獲得了比較高比例的Ｇ０／Ｇ１期細胞，但對照組（１０％ ＦＣＳ）僅有６２．４％的細胞處于Ｇ０／Ｇ１期。

２．３血清饑餓時間對牛卵巢顆粒細胞Ｇ０／Ｇ１期的影響

將體外培養(yǎng)至第５代的牛卵巢顆粒細胞用加有０．５％ ＦＣＳ的培養(yǎng)液分別處理２、３、４和５ ｄ，饑餓時間對誘導體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細胞進入Ｇ０／Ｇ１期的影響見表３。從表3中可以看出，隨著饑餓處理時間的增加，Ｇ０／Ｇ１期細胞的百分比呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢。饑餓處理５ ｄ較２ ｄ顯著提高了Ｇ０／Ｇ１期細胞的百分比（Ｐ＜０．０５），饑餓處理２ ｄ和５ ｄ后的Ｇ０／Ｇ１期細胞的百分比分別為８１．２％和８７．６％。

３小結(jié)與討論

體細胞克隆技術(shù)中供體細胞的細胞周期和受體細胞核質(zhì)同步化是影響克隆效率的一個關(guān)鍵因素。供體細胞處于Ｇ０／Ｇ１階段有益于供體細胞和受體細胞的核質(zhì)同步化以及重構(gòu)胚的再程序化，而且能夠正常的濃縮染色體，在第一次細胞分裂的末期維持正常的染色體倍數(shù)［１２］。在長期的研究中，人們采用了幾種不同的研究方法得到處于Ｇ０／Ｇ１階段的供體細胞［１３，１４］。在供體細胞的細胞周期同步化中，人們常以血清饑餓誘導供體細胞進入Ｇ０／Ｇ１期。在牛成纖維細胞的研究中，通過０．０５％濃度的血清誘導供體細胞取得了成功，同時通過延長低濃度血清誘導成纖維細胞的時間，提高了Ｇ０／Ｇ１階段細胞的比例［１5］。在當前的研究中，０．５％和０．０５％濃度的ＦＣＳ在誘導牛卵巢顆粒細胞獲得高比例Ｇ０／Ｇ１期細胞方面沒有顯著差異，但０．５％和０．０５％的ＦＣＳ較１０％的ＦＣＳ顯著提高了牛卵巢顆粒細胞Ｇ０／Ｇ１期細胞的比例。這表明低濃度的血清誘導可以提高牛卵巢顆粒細胞Ｇ０／Ｇ１期的比例，但不同水平的低濃度血清對誘導牛卵巢顆粒細胞進入Ｇ０／Ｇ１期沒有影響。結(jié)合以前的研究報道和本試驗的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)并非血清饑餓就可以誘導體細胞獲得高比例的Ｇ０／Ｇ１期，這中間除了有不同實驗室工作環(huán)境和操作工藝存在差別的原因外，可能還與細胞類型及細胞來源有關(guān)。本研究中，通過延長０．５％濃度ＦＣＳ對牛卵巢顆粒細胞的誘導時間，發(fā)現(xiàn)饑餓處理５ ｄ的牛卵巢顆粒細胞較處理２ ｄ的牛卵巢顆粒細胞均獲得了較高的Ｇ０／Ｇ１期細胞百分比。在對牛成纖維細胞的血清饑餓誘導研究中有和本試驗的結(jié)果基本一致，研究人員將血清饑餓的時間延長至１４ ｄ，得到了高比例的Ｇ０／Ｇ１期牛成纖維細胞［１６］。以前的研究和我們的試驗結(jié)果說明通過延長血清饑餓的時間同樣可以獲得高比例的Ｇ０／Ｇ１期供體細胞。

在體細胞克隆研究中，人們發(fā)現(xiàn)Ｄｏｌｌｙ的端粒長度明顯短于同齡羊，而與供體乳腺細胞的端粒長度相當。這就提出了一個問題，體細胞克隆動物是否會遺傳供體核縮短了的端粒給后代，從而導致過早衰老。但之后幾年大量的研究表明，端粒復原存在于大部分克隆動物中，端?？s短可能不是造成克隆動物高死亡率的最主要原因。但在供體細胞體外制備過程中，人們又在擔心體外長期培養(yǎng)的細胞可能會給供體細胞本身和重構(gòu)胚體外培養(yǎng)帶來負面影響。而且有人認為供體細胞衰老對重構(gòu)胚的發(fā)育潛能有影響，所以通常選擇體外培養(yǎng)短期階段的體細胞進行克?。郏保罚?。但大量的研究也表明，體外長期培養(yǎng)的細胞在重構(gòu)胚構(gòu)建及重構(gòu)胚發(fā)育方面優(yōu)于短期培養(yǎng)的細胞［１８］。在本試驗中，培養(yǎng)至第２、１０和２５代的牛卵巢顆粒細胞均獲得了相近比例的Ｇ０／Ｇ１期細胞。這表明體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細胞是否衰老對通過血清饑餓誘導細胞獲得Ｇ０／Ｇ１期細胞的比例沒有影響。因此，在牛卵巢顆粒細胞制備用作供體細胞的研究中，血清饑餓誘導可以提高細胞Ｇ０／Ｇ１期的比例，但不同水平的低濃度血清對誘導牛卵巢顆粒細胞進入Ｇ０／Ｇ１期沒有影響，延長饑餓誘導的時間可以提高Ｇ０／Ｇ１期細胞的比例；體外傳代時間對牛卵巢顆粒細胞Ｇ０／Ｇ１期細胞比例的影響不顯著。

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