根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米自交系A(chǔ)188愈傷組織再生條件的優(yōu)化

摘 要：以A188玉米自交系的愈傷組織為材料，研究了影響農(nóng)桿菌介導(dǎo)玉米轉(zhuǎn)化和再生的各種因素，建立了該自交系的遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果表明，10～15 mm的幼胚最易誘導(dǎo)出胚性愈傷組織；在侵染液和共培養(yǎng)基中加入乙酰丁香酮能顯著提高轉(zhuǎn)化效率；合適的菌液濃度（OD600=04）、共培養(yǎng)時(shí)間（3 d）、共培養(yǎng)溫度（24℃）有利于提高轉(zhuǎn)化效率。

關(guān)鍵詞：玉米；根癌農(nóng)桿菌；愈傷組織；再生體系

中圖分類號(hào)：S513.01 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2012）12-0028-04

Optimization of Conditions for Agrobacterium tumefciens-Mediated

Transformation and Regeneration of Maize Inbred Line A188 Callus

Qiu PingPing1， Xin XiangQi2， Liu WenHao1， Su WenMin1， Zhu XiaoPing1*

（1.College of Plant Protection， Shandong Agricultural University， Taian 271018， China；

2.Institute of Plant Protection， Shandong Academy of Agricultural Sciences， Jinan 250100， China）

Abstract The factors affecting the Agrobacterium tumefciens-mediated transformation and regeneration of maize （Zea mays L.） embryogenic callus were optimized， and the genetic transformation system was established for the maize inbred line A188. The results indicated that 1.0～1.5 mm immature embryos were easier to induce embryogenic callus； the addition of acetosyringone in infection solution and common medium could increase the transformation efficiency significantly； appropriate bacterial concentration （OD600=0.4）， incubation time （3 days） and co-culture temperature （24℃） were benefit to increasing formation efficiency.

Key words Maize； Agrobacterium tumefciens； Callus； Regeneration system

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以其操作簡(jiǎn)單、低成本、轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)較低的優(yōu)點(diǎn)在植物遺傳轉(zhuǎn)化研究中得到了廣泛應(yīng)用，尤其是在雙子葉植物遺傳轉(zhuǎn)化中取得了顯著效果[1，2]。單子葉植物不是農(nóng)桿菌的天然宿主，不易通過農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。但是一些研究表明農(nóng)桿菌也可以轉(zhuǎn)化單子葉植物玉米，并初步建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系[3，4]。

1975年，Green和Phillips利用玉米幼胚成功誘導(dǎo)出植株以來，利用玉米幼胚在不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織并再生出植株的成功研究頗多[5～7]，并證明幼胚是玉米誘導(dǎo)愈傷組織并再生植株的理想材料[8，9]。本試驗(yàn)擬針對(duì)玉米自交系A(chǔ)188幼胚進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和再生體系優(yōu)化，以期建立高效表達(dá)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化體系。

1 材料與方法

11 材料

111 菌株和質(zhì)粒 根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株LBA4404和大腸桿菌（Escherichia coli）菌株DH5α均由本實(shí)驗(yàn)室保存；帶有Bar選擇標(biāo)記基因、Ubiquitin啟動(dòng)子和PGIP目的基因（辣椒多聚半乳糖醛酸酶可逆性抑制蛋白）的雙元植物表達(dá)載體pCBUPGIP由本研究室構(gòu)建。

112 植物材料及培養(yǎng)基 玉米自交系A(chǔ)188由本實(shí)驗(yàn)室保存，玉米幼胚取自田間生長(zhǎng)的玉米植株。

組培過程中的培養(yǎng)基除了生根培養(yǎng)基用MS作為基本培養(yǎng)基外，其他均使用N6培養(yǎng)基作為基本培養(yǎng)基。各培養(yǎng)基成分詳見表1。

12 方法

121 農(nóng)桿菌培養(yǎng) 植物表達(dá)載體pCBUPGIP通過凍融法轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌菌株LBA4404中。攜帶目標(biāo)載體的農(nóng)桿菌菌株LBA4404在附加50 mg/L卡那霉素和100 mg/L利福平的YEP培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)至OD600=800，然后4℃、4 000 r/min離心5 min，收集菌體，用N6基本液體培養(yǎng)基重懸，分別稀釋至OD600=02、03、04、05、06、08，加入100 mg/L的乙酰丁香酮，暫放28℃，緩慢搖動(dòng)，用于侵染。

122 玉米愈傷組織的誘導(dǎo) 取玉米A188自交系授粉后10～15 d的幼穗，剝?nèi)グ~，用70%酒精和01%升汞先后進(jìn)行消毒。然后挑取大小分別為08～10、10～15、15～20 mm的幼胚，盾片向上接種于N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，24℃暗培養(yǎng)。

123 受體材料的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化和再生 選取結(jié)構(gòu)致密、顏色鮮亮、較松散的愈傷組織，用鑷子夾碎成2 mm大小的小塊，愈傷于上述準(zhǔn)備好的菌液中浸泡20 min，期間不停地緩慢搖晃，然后棄去菌液，用滅菌濾紙吸干表面多余菌液，轉(zhuǎn)至N6共培養(yǎng)基上，20～28℃分別暗培養(yǎng)2、3、5、7、8 d。其后將愈傷組織用含400 mg/L羧芐青霉素的無菌水沖洗4～5次，每次10 min。將洗好的愈傷用滅菌濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)至N6恢復(fù)培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)7 d。

將上述愈傷轉(zhuǎn)至N6選擇培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)15 d，10～15 d繼代1次，篩選繼代4～5次。將經(jīng)過篩選的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至N6分化培養(yǎng)基上分化培養(yǎng)，25℃光/暗（16 h/8 h），誘導(dǎo)胚狀體形成和幼苗分化。然后進(jìn)行生根培養(yǎng)，待長(zhǎng)出健壯的根系移栽至溫室培養(yǎng)。

按照以下公式計(jì)算愈傷誘導(dǎo)率和轉(zhuǎn)化率：

愈傷誘導(dǎo)率（%）=（長(zhǎng)出的愈傷組織塊數(shù)/接入的幼胚數(shù)）×100；

轉(zhuǎn)化率（%）=（愈傷組織出現(xiàn)綠芽塊數(shù)/侵染的愈傷組織塊數(shù)）×100。

轉(zhuǎn)化率以經(jīng)過草丁膦（PPT）篩選后能存活的愈傷組織出現(xiàn)綠芽為基準(zhǔn)，因?yàn)椴荻§?duì)愈傷組織是正向篩選，沒有轉(zhuǎn)化成功的愈傷組織對(duì)草丁膦沒有抗性會(huì)逐漸死亡。

124 轉(zhuǎn)化株的PCR鑒定 取含PGIP基因的質(zhì)粒為陽性對(duì)照，非轉(zhuǎn)化植株的DNA為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定。PGIP基因引物：

上游引物：ATGAAAAAAACTAATCGTGTTAC；

下游引物：TCATTTACATGGTGGCAAT。

2 結(jié)果與分析

21 幼胚大小對(duì)愈傷組織形成的影響

由圖1可以看出，當(dāng)幼胚大小在08～10 mm之間時(shí)愈傷誘導(dǎo)率為42%，10～15 mm之間時(shí)，愈傷誘導(dǎo)率明顯提高，達(dá)到86%，15～20 mm之間時(shí)愈傷誘導(dǎo)率下降至63%。由此可見當(dāng)幼胚大小在10～15 mm之間時(shí)，幼胚處于最佳萌發(fā)期，萌發(fā)活性最高，最易誘導(dǎo)產(chǎn)生胚性愈傷組織。

22 菌液濃度對(duì)玉米愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響

試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，不同侵染液濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響差異顯著。侵染液OD600在01～04之間時(shí)，隨著農(nóng)桿菌濃度的增加，A188愈傷組織轉(zhuǎn)化率從78%升高至113%；而當(dāng)OD600大于04時(shí)，隨著農(nóng)桿菌濃度的增加，愈傷組織轉(zhuǎn)化率逐漸下降。由此可以看出OD600=04時(shí)，玉米A188愈傷組織轉(zhuǎn)化率最高。

23 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)玉米愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響

用OD600=04的農(nóng)桿菌LBA4404菌液侵染生長(zhǎng)良好的愈傷組織，然后分別共培養(yǎng)2、3、5、7、8 d。如圖3所示，共培養(yǎng)3 d時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)89%，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化率逐漸降低。共培養(yǎng)時(shí)間過短，T-DNA不能有效地向植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移，所以轉(zhuǎn)化率不高；但是隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，吸附在愈傷組織上的農(nóng)桿菌增殖增加，使以后的抑菌難度增加，并且農(nóng)桿菌對(duì)玉米愈傷組織的損傷增加，所以不能過度延長(zhǎng)共培養(yǎng)時(shí)間。

24 共培養(yǎng)溫度對(duì)玉米愈傷組織轉(zhuǎn)化率的影響

玉米A188愈傷組織經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后分別在20、22、24、26、28℃下共培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計(jì)愈傷組織轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖4?？梢钥闯鲈?4℃時(shí)愈傷組織轉(zhuǎn)化率最高，隨著溫度的升高轉(zhuǎn)化率逐漸降低。由此可知24℃是最佳共培養(yǎng)時(shí)間。

25 玉米A188遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

對(duì)再生體系的各條件優(yōu)化后，經(jīng)過組織培養(yǎng)成功得到轉(zhuǎn)基因玉米A188植株。圖5中，A為剛挑取培養(yǎng)2 d 的玉米A188幼胚；B為誘導(dǎo)2個(gè)月后篩選出的胚性愈傷組織，用來侵染；侵染后篩選出的愈傷組織經(jīng)恢復(fù)培養(yǎng)逐漸成熟，C為恢復(fù)培養(yǎng)一周后的愈傷；D為愈傷組織進(jìn)行分化培養(yǎng)2周后，愈傷組織逐漸綠化并開始分化綠色生長(zhǎng)點(diǎn)，并進(jìn)一步分化出小苗；E為分化出的小苗進(jìn)行生根培養(yǎng)一個(gè)月后的健壯植株，準(zhǔn)備移栽；F為轉(zhuǎn)化植株在無菌土中的長(zhǎng)相。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米A188高效轉(zhuǎn)化再生體系：（1）取授粉后10～15 d的玉米幼穗，剝?nèi)グ~挑取10～15 mm幼胚，盾片向上接種于N6誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，24℃暗培養(yǎng)，10～14 d繼代1次，至產(chǎn)生Ⅱ型胚性愈傷組織。取繼代4～5次、結(jié)構(gòu)致密、顏色鮮亮的Ⅱ型胚性愈傷組織作為農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的受體材料。

（2）農(nóng)桿菌菌株LBA4404在附加50 mg/L Kanamycin和100 mg/L利福平的YEP培養(yǎng)液中，28℃培養(yǎng)至OD600=800，然后4℃、4 000 r/min離心5 min，收集菌體，用N6基本液體培養(yǎng)基重懸，稀釋至OD600=04，加入100 mg/L的乙酰丁香酮，暫放28℃，緩慢搖動(dòng)，用于侵染。

（3）選取結(jié)構(gòu)致密、顏色鮮亮、較松散的愈傷組織，用鑷子夾成2 mm大小的小塊，于上一步準(zhǔn)備好的菌液中浸泡20 min，期間不停地緩慢搖晃，然后棄去菌液，用滅菌濾紙吸干表面多余菌液，轉(zhuǎn)至N6共培養(yǎng)基上，24℃暗培養(yǎng)3 d。

（4）3 d后將愈傷組織用含400 mg/L的羧芐青霉素的無菌水沖洗4～5次，每次10 min。將洗好愈傷用滅菌濾紙吸干表面水分，轉(zhuǎn)至N6恢復(fù)培養(yǎng)基上，避光培養(yǎng)7 d。

（5）將愈傷轉(zhuǎn)至N6選擇培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)15 d，10～15 d繼代1次，篩選繼代4～5次。

（6）將經(jīng)過篩選的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)至N6分化培養(yǎng)基上分化培養(yǎng)，25℃光/暗（16 h/8 h），誘導(dǎo)胚狀體形成和幼苗分化。然后進(jìn)行生根培養(yǎng)，待長(zhǎng)出健壯的根系移栽至溫室培養(yǎng)。

26 轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR鑒定結(jié)果

提取再生植株葉片基因組DNA作為模板，利用PGIP基因引物進(jìn)行PCR特異片段的擴(kuò)增，得到約661 bp條帶，與陽性對(duì)照位置相同，和預(yù)期的PGIP基因的位置相一致；而陰性對(duì)照卻無任何條帶（圖6）。說明PCR陽性克隆的細(xì)胞中含有目的基因序列，可以初步確定為轉(zhuǎn)化株。

1～4：轉(zhuǎn)基因植株；5：陽性對(duì)照；6：陰性對(duì)照；

M：DL2000 Plus

3 結(jié)論與討論

大量研究證實(shí)愈傷組織可分為三類：Ⅰ型愈傷組織呈結(jié)構(gòu)緊密的塊狀；Ⅱ型愈傷組織是比較理想的愈傷組織，結(jié)構(gòu)良好，高度松散，顏色鮮亮，也稱其為胚性愈傷組織；Ⅲ型愈傷組織呈柔軟、松散、水浸狀，不具有分化植株的能力。Ⅱ型愈傷組織主要是通過胚胎發(fā)生途徑分化出植株，Ⅰ型愈傷組織則主要通過器官發(fā)生途徑分化出植株。玉米植株的再生主要受受體材料、基因型和培養(yǎng)條件的影響，本研究主要對(duì)受體材料和培養(yǎng)條件進(jìn)行研究，并建立了高效表達(dá)的再生體系。

研究發(fā)現(xiàn)在農(nóng)桿菌侵染愈傷組織時(shí)，在侵染液和共培養(yǎng)基中都加入乙酰丁香酮能顯著提高轉(zhuǎn)化效率，表明在增加農(nóng)桿菌菌液和愈傷組織之間的親和性上起到了作用。在此基礎(chǔ)上還需在提高農(nóng)桿菌對(duì)愈傷組織的侵染力、提高轉(zhuǎn)化率等方面作進(jìn)一步的研究。參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 王關(guān)林，方宏筠 植物基因工程[M] 北京：科學(xué)出版社，1998，585-586，598

[2] Grant J， Dommisse E， Christey M Genetransfer to plants using Agrobacterium[A] In： Murray D R， edAdvanced methods in plant breeding and biotechnology[C] Wallingford：CAB International， 1991， 50-73

[3] Chan M，Lee T，Chang H Transformation of indica rice （Oryza sativa L） mediated by Agrobacterium tumefaciens[J] Plant and Cell Physiology， 1992， 33： 577-583

[4] Armstrong C， Green C Establishment and maintenance of friable， embryogenic maize callus and the invalvement of L-prolins[J] Planta，1985， 164：207-214

[5] Green C，Phillips R L Plant regeneration from tissue cultures of maize[J] Crop Science， 1975， 15： 417-418

[6] 權(quán)瑞黨，尚 梅，張舉仁，等農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米自交系愈傷組織的轉(zhuǎn)化[J] 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2003，2：3-6

[7] 張紅梅，王國(guó)英農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)展[J] 作物雜志，2000，79（6）：1-4

[8] 王昌濤，楊愛國(guó)，高樹仁，等玉米不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)及植株再生的研究[J] 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，36（5）：515-518

[8] 王漢寧，張金文，孔維萍，等玉米幼胚愈傷組織誘導(dǎo)及再生[J] 玉米科學(xué)，2006，14（5）：71-73，86

[9] 曹墨菊，張 穎，劉玉貞，等玉米幼胚培養(yǎng)胚性愈傷的影響因素分析[J] 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005，18（5）：647-652 山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2012，44（12）：32～35