RNA干擾技術(shù)在農(nóng)作物害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用

摘 要：RNA干擾（RNAi）技術(shù)作為基因沉默的工具，已被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物害蟲(chóng)防治研究。準(zhǔn)確選擇靶基因、將dsRNA或siRNA導(dǎo)入昆蟲(chóng)體內(nèi)、siRNA在昆蟲(chóng)體內(nèi)的擴(kuò)增和擴(kuò)散是RNAi技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)作物害蟲(chóng)防治的基礎(chǔ)。應(yīng)用RNAi技術(shù)能有效地保護(hù)農(nóng)作物抵抗害蟲(chóng)危害，在農(nóng)作物遺傳改良進(jìn)行精準(zhǔn)抗蟲(chóng)方面具有重大的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：RNA干擾，農(nóng)作物，害蟲(chóng)防治

中圖分類(lèi)號(hào)：S435 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2012）12-0016-04

Application of RNAi Technique in Pest Management for Crop

Guo Qiang， Fan ZhongXue*， Chu Dong， Li XiaoQing

（High-Tech Research Center， Shandong Academy of Agricultural Sciences/Shandong Provincial Key Laboratory

of Crop Genetic Improvement and Ecology and Physiology， Jinan 250100， China）

Abstract RNA interference （RNAi） technique as a tool for gene silencing has been widely used in agriculture for the management of insect pests. Accurately selecting target genes， transferring dsRNA or siRNA into insects and amplifying and spreading the siRNA within the insects are the base for the application of RNAi on pest management. The application of RNAi technique could effectively protect crops from insect pests， and it has better prospect in accurate management of agricultural pests.

Key words RNAi； Crop； Pest management

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA（dsRNA）介導(dǎo)的特異性基因表達(dá)沉默現(xiàn)象，是生物的一種古老并且進(jìn)化上高度保守的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制。它在真核生物中參與抵抗病毒入侵、抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、調(diào)控基因的表達(dá)[1]，具有重要生物學(xué)意義。RNAi技術(shù)作為基因沉默的工具，已被廣泛應(yīng)用于基因功能研究、基因治療和病毒防治等方面，也為農(nóng)作物害蟲(chóng)防治提供了新的策略，已成為生物技術(shù)領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。1 RNAi技術(shù)應(yīng)用于農(nóng)作物害蟲(chóng)防治的基礎(chǔ)

11 選擇靶基因

利用RNAi技術(shù)保護(hù)農(nóng)作物抵抗害蟲(chóng)的可行性已被證實(shí)，2007年發(fā)表在Nature Biotechnology中的兩篇文章表明利用RNAi技術(shù)可以防治害蟲(chóng)[2，3]。這種方法成功的關(guān)鍵是：選擇一個(gè)合適的靶基因，并在農(nóng)作物中表達(dá)足夠量的能被害蟲(chóng)攝取的dsRNA/siRNA。盡管針對(duì)的農(nóng)作物和害蟲(chóng)都不同，但仔細(xì)選擇靶基因是共同的。

12 害蟲(chóng)RNAi的導(dǎo)入方法

RNAi常用的導(dǎo)入方法有注射、飼喂、浸泡、組織培養(yǎng)、病毒感染、轉(zhuǎn)基因等，但在昆蟲(chóng)中主要用注射、飼喂和浸泡法進(jìn)行RNAi研究。

在絕大多數(shù)昆蟲(chóng)RNAi研究中，首選的輸入方法是將體外合成的微量的dsRNA/siRNA顯微注射到昆蟲(chóng)體腔內(nèi)。目前已在鱗翅目的煙草天蛾（Manduca sexta）[4，5]、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）[6]和棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）[7]等昆蟲(chóng)建立了通過(guò)注射dsRNA/siRNA誘導(dǎo)RNAi的體系。但是注射法具有以下缺點(diǎn)：注射壓力和傷口不可避免地影響到昆蟲(chóng)，如損傷表皮激發(fā)了免疫反應(yīng)；顯微注射是一項(xiàng)較難掌握的技術(shù)。個(gè)體較大的昆蟲(chóng)在注射后，傷口易愈合，成活率較高，而個(gè)體很小的昆蟲(chóng)，在注射難度加大的同時(shí)，成活率也相對(duì)較低。由于顯微注射的局限性，此法較難用于大規(guī)模分析。

通過(guò)喂食誘導(dǎo)RNAi在絕大多數(shù)情況下可能是最誘人的方法，這是因?yàn)椴僮骱?jiǎn)單方便，容易實(shí)現(xiàn)，對(duì)昆蟲(chóng)造成的危害性小，不影響其他基因的表達(dá)。通過(guò)飼喂表達(dá)dsRNA/siRNA的作物、人工飼料或菌株，使昆蟲(chóng)連續(xù)攝入dsRNA/siRNA，可有效抑制靶基因的表達(dá)。

將果蠅（Drosophila melanogaster）胚胎浸泡于dsRNA溶液中，可以抑制基因表達(dá)，其效果與注射法相當(dāng)，只是需要更高的dsRNA濃度[8]。將果蠅S2細(xì)胞浸泡于細(xì)胞循環(huán)基因CycE和ago的dsRNA溶液中可以有效抑制基因的表達(dá)，從而提高蛋白的合成[9]。浸泡法適用于那些容易從溶液中吸收dsRNA/siRNA的特殊昆蟲(chóng)細(xì)胞組織和昆蟲(chóng)特定發(fā)育階段，所以應(yīng)用得較少。

13 siRNA的擴(kuò)增

在果蠅中RNAi介導(dǎo)的基因敲除局限于給予dsRNA/siRNA的部位，并且沉默效應(yīng)有時(shí)間限制。實(shí)際上與線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）相比，在果蠅中還未發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性的長(zhǎng)時(shí)間的RNAi效應(yīng)。在C elegans中系統(tǒng)性的RNAi效應(yīng)是一個(gè)擴(kuò)增和擴(kuò)散沉默信號(hào)的多步驟進(jìn)程。如果一個(gè)相似的系統(tǒng)存在于昆蟲(chóng)中，它將會(huì)使我們能夠靶向所有從昆蟲(chóng)中選擇的目標(biāo)（不止腸特異性目標(biāo)），而且不再需要持續(xù)給予高水平dsRNA/siRNA，并因此能夠避免許多與dsRNA/siRNA在昆蟲(chóng)腸道不穩(wěn)定的相關(guān)問(wèn)題。

14 RNAi的擴(kuò)散

昆蟲(chóng)的系統(tǒng)性RNAi首先在鞘翅類(lèi)昆蟲(chóng)赤擬谷盜（Tribolium castaneum）（粉甲蟲(chóng)，flour beetle）中被證實(shí)。在T castaneum中鑒定了一個(gè)果蠅感覺(jué)剛毛形成基因Tc-achaete-scute（Tc-ASH）的同源基因，在一個(gè)單獨(dú)的位點(diǎn)注射Tc-ASH dsRNA至幼蟲(chóng)導(dǎo)致成熟昆蟲(chóng)的表皮剛毛缺失[10]。同時(shí)在親代昆蟲(chóng)T castaneum注射特異性的dsRNA靶向Distalless（腿發(fā)育基因）、maxillopedia（同源異型基因）和proboscipedia（一個(gè)編碼形成唇和上頜觸須時(shí)必需的同源異型蛋白的基因），卵孵化后發(fā)育的后代胚胎中產(chǎn)生RNAi效應(yīng)[11]。這些研究證明了昆蟲(chóng)的系統(tǒng)性RNAi并且RNAi可以由親代遺傳到子代。

2 RNAi技術(shù)在農(nóng)作物害蟲(chóng)防治中的應(yīng)用

RNAi被廣泛用于研究基因的功能、基因敲除、治療腫瘤和病毒感染等疾病，也被用于昆蟲(chóng)中研究RNAi的機(jī)制和功能、基因的表達(dá)和調(diào)節(jié)，例如果蠅（D melanogaster）[12]、赤擬谷盜（T castaneum）[10]、家蠶（Bombyx mori）[13]等昆蟲(chóng)。Chen等（2008）[14]注射合成的dsRNA/siRNA到甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）的四齡幼蟲(chóng)誘導(dǎo)幾丁質(zhì)合成酶（chitin synthase gene A，CHSA）沉默，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大多異常的幼蟲(chóng)不能蛻皮，或進(jìn)入下一期的幼蟲(chóng)明顯小于正常大小，并且氣管上壁不能統(tǒng)一擴(kuò)張，明顯提高了異常發(fā)生率，表明可以利用RNAi來(lái)控制害蟲(chóng)。這些研究大多是通過(guò)注射的方法將dsRNA/siRNA導(dǎo)入昆蟲(chóng)體內(nèi)，然而，注射法不適宜用于田間的害蟲(chóng)防治。

為了有效地控制害蟲(chóng)，害蟲(chóng)應(yīng)該能夠自然地通過(guò)飼喂和消化獲得dsRNA/siRNA[15]。通過(guò)飼喂轉(zhuǎn)基因植物誘導(dǎo)RNAi防治害蟲(chóng)已在鱗翅目和鞘翅目昆蟲(chóng)中試驗(yàn)成功[16，17]。Mao等（2007）[3]研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)P450基因（CYP6AE14）和谷胱甘肽基因GST1 dsRNA的棉花對(duì)取食的棉鈴蟲(chóng)（H armigera）幼蟲(chóng)誘導(dǎo)了RNAi，阻礙了幼蟲(chóng)的發(fā)育，這一技術(shù)為防治農(nóng)作物害蟲(chóng)提供了新的策略。Baum等（2007）[2]鑒定了玉米根螢葉甲（Diabrotica virgifera virgifera Leconte）290個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因，利用RNAi飼喂該蟲(chóng)幼蟲(chóng)的方法篩選出14個(gè)在低dsRNA濃度對(duì)昆蟲(chóng)具有致害效應(yīng)的基因。例如，表達(dá)V型ATP酶A基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米受到玉米根螢葉甲的損害與對(duì)照組相比明顯降低，在攝食24 h內(nèi)快速下調(diào)內(nèi)源性mRNA，誘導(dǎo)特異性RNAi反應(yīng)；編碼V型ATP酶亞單位和β-微管蛋白的dsRNA能夠使昆蟲(chóng)產(chǎn)生系統(tǒng)性基因沉默。這些研究表明，RNAi在農(nóng)作物遺傳改良進(jìn)行精準(zhǔn)抗蟲(chóng)方面具有重大的應(yīng)用前景。在這些研究中至少有14種昆蟲(chóng)通過(guò)飼喂誘導(dǎo)RNAi，表明dsRNA/siRNA作為食物成分能有效地沉默靶基因[15]。還有一種比直接喂食dsRNA/siRNA更好的喂食方法，就是將產(chǎn)生dsRNA/siRNA的轉(zhuǎn)基因植株作為昆蟲(chóng)的食物[2，3]。這種方法的好處在于能夠給予持續(xù)和穩(wěn)定的dsRNA/siRNA。

RNAi應(yīng)用于農(nóng)作物抗害蟲(chóng)具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）抗害蟲(chóng)的高效性；（2）抗害蟲(chóng)兼顧特異性與廣譜性，轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)害蟲(chóng)重要基因的dsRNA/siRNA，基于dsRNA/siRNA的特異性程度，可獲得對(duì)一種或幾種害蟲(chóng)的抗性，而不影響其它昆蟲(chóng)；（3）因?yàn)檗D(zhuǎn)基因植物表達(dá)的是dsRNA和siRNA而不是蛋白質(zhì)，所以易于在農(nóng)作物中推廣。由于插入到植物基因組DNA上的外源基因的干擾序列部分的mRNA 轉(zhuǎn)錄后形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)并被植物體內(nèi)的核酸內(nèi)切酶（Dicer）識(shí)別降解，不會(huì)被進(jìn)一步翻譯成蛋白質(zhì)，所以避免了外源蛋白質(zhì)在植株內(nèi)的積累，具有較高的生物安全性。作為植物調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育和保持遺傳穩(wěn)定性的重要機(jī)制，植物內(nèi)源的dsRNA和siRNA大量存在，因此表達(dá)了與植物自身無(wú)同源序列的dsRNA，不會(huì)對(duì)寄主植物產(chǎn)生不良的影響，也更容易被接受。

3 影響RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)的主要因素

31 dsRNA片段的長(zhǎng)度

片段的長(zhǎng)度決定了dsRNA的攝取和RNAi的效率[18]。在這些飼喂試驗(yàn)中大多數(shù)dsRNA片段的長(zhǎng)度為300～520 bp。Saleh等（2006）[18]認(rèn)為對(duì)S2細(xì)胞的dsRNA的長(zhǎng)度最少為211 bp。

32 靶基因序列

dsRNA/siRNA的序列特異性可以通過(guò)細(xì)致的生物信息學(xué)途徑做到最優(yōu)，目標(biāo)基因的序列將決定昆蟲(chóng)中可能的脫靶效應(yīng)。

33 dsRNA/siRNA濃度

對(duì)于每一個(gè)靶基因和生物體來(lái)說(shuō)，誘導(dǎo)沉默的理想濃度需要確定。但是，超過(guò)理想濃度并不能誘導(dǎo)更強(qiáng)的沉默效果[19，20]。

34 目標(biāo)昆蟲(chóng)的生活周期

雖然晚期能更易處理，但早期的沉默效果常會(huì)更好。例如，在R prolixus中，nitropin 2 dsRNA對(duì)4齡幼蟲(chóng)沒(méi)有沉默效果，而對(duì)2齡幼蟲(chóng)有42%的沉默效果[21]；同樣在草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）中，5齡幼蟲(chóng)比成蟲(chóng)誘導(dǎo)了更強(qiáng)的沉默效果[22]。

35 RNAi的持續(xù)時(shí)間

在A pisum中對(duì)水通道蛋白的沉默效應(yīng)持續(xù)了5天，然后降低[20]；Turner等（2006）[23]認(rèn)為在蘋(píng)果淺褐卷葉蛾（Epiphyas postvittana）中信息素結(jié)合蛋白dsRNA的瞬時(shí)效應(yīng)可能與目標(biāo)蛋白的周轉(zhuǎn)率有關(guān)[23]。

4 前景展望

針對(duì)害蟲(chóng)的不同時(shí)期選擇合適的dsRNA/siRNA長(zhǎng)度、序列、濃度，應(yīng)用RNAi技術(shù)防治害蟲(chóng)。目前只對(duì)少數(shù)幾種昆蟲(chóng)進(jìn)行了研究，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的成功能否轉(zhuǎn)為有效的田間害蟲(chóng)控制，以及這種方法的長(zhǎng)期影響等都需要進(jìn)一步的研究和觀察。利用RNAi技術(shù)控制農(nóng)作物害蟲(chóng)無(wú)疑具有廣闊的應(yīng)用前景，但目前還僅僅處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，相信這方面的研究突破一定會(huì)為未來(lái)的農(nóng)作物害蟲(chóng)控制提供新的途徑。參 考 文 獻(xiàn)：

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