擬南芥和大白菜YABBY蛋白家族的生物信息學(xué)分析

摘 要：YABBY基因家族是一類含有C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域和YABBY結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在植物葉器官發(fā)育過程中起到重要的調(diào)控作用。本研究利用生物信息學(xué)的方法對擬南芥和大白菜YABBY基因家族的結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化、序列保守性以及順式反應(yīng)元件進(jìn)行了分析。主要結(jié)果如下：YABBY基因在擬南芥和大白菜染色體上呈不均勻分布；基因的結(jié)構(gòu)以含有6個內(nèi)含子為主要形式；所有擬南芥和大白菜YABBY基因都具有保守的C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域和YABBY結(jié)構(gòu)域；YABBY蛋白家族在進(jìn)化上可分為4個不同的亞組；YABBY基因的啟動子序列中存在多個能夠響應(yīng)不同激素和逆境信號的順式反應(yīng)元件。本文為進(jìn)一步研究YABBY基因在大白菜葉球發(fā)育中的調(diào)控作用和逆境響應(yīng)中的功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：擬南芥；大白菜；YABBY基因；生物信息學(xué)分析

中圖分類號：Q754 文獻(xiàn)標(biāo)識號：A 文章編號：1001-4942（2012）12-0001-06

Bioinformatic Analysis of YABBY Protein Family

in Arabidopsis and Chinese Cabbage

Li XiaoBo1， Yang CuiCui2， Qiu NianWei2*

（1. Department of Medical and Technology， Zaozhuang Vocational College of Science and Technology，

Tengzhou 277500， China； 2. School of Life Science， Qufu Normal University， Qufu 273165， China）

Abstract YABBY gene family is one kind of transcription factor featuring the existence of C2C2 zinc finger and YABBY domains， which plays important roles in regulating the development of leaf organ. In this study， the structure， phylogeny， conserved sequences and cis-acting elements of YABBY genes in Arabidopsis and Chinese cabbage were analyzed using bio-informatics. The main results were listed as follows. The YABBY genes distributed unevenly on the chromosomes； most of YABBY genes contained 6 introns； all YABBY genes contained conserved C2C2-zinc finger and YABBY domains； the YABBY gene family could be divided into four sub-family groups； there were many cis-acting elements， which responsed to hormones and stress signals， existing in the promoter region. This research laid a foundation for functional dissection of YABBY genes in Chinese cabbage leafy head development and stress response.

Key words Arabidopsis； Chinese cabbage； YABBY gene； Bioinformatic analysis

大白菜（Brassica rapa L ssp pekinensis）是我國乃至世界性的重要蔬菜作物之一，其葉球是最主要的食用器官。葉球的發(fā)育過程表現(xiàn)為葉片向上向內(nèi)卷曲。揭示葉極性或葉卷曲發(fā)生的基因調(diào)控機(jī)制對遺傳上控制葉的大小、形狀和姿態(tài)，改良葉平展度或卷曲度等遺傳性狀，具有重要的理論意義和實(shí)用價值，是進(jìn)行大白菜分子育種亟待解決的關(guān)鍵問題。

葉在空間三維軸向上的極性，包括基-頂軸（proximal-distal axis）、中-側(cè)軸（medial-lateral axis）和近-遠(yuǎn)軸（adaxial-abaxial axis）[1～3]。近-遠(yuǎn)軸極性的紊亂將導(dǎo)致葉片的上卷或者下卷。例如，hst突變體葉肉細(xì)胞近遠(yuǎn)軸極性混亂導(dǎo)致葉片上卷[4]；hyl1突變體也表現(xiàn)出葉片上卷的表型，其原因在于葉肉細(xì)胞的近遠(yuǎn)軸極性發(fā)生了紊亂，尤其是在葉片發(fā)生卷曲的部分[5]。目前，已克隆出了一些影響葉的近-遠(yuǎn)軸極性分化的基因，如HD-ZIPIII 家族的PHABULOSA（PHB）、PHAVOLUTA（PHV）[6，7]和 REVOLUTA（REV）[8，9]，YABBY家族的 FILAMENTOUS FLOWER（FIL）[10，11]、YABBY2和YABBY3 [12]，以及GARP家族的 KANADI1（KAN1）[13]等基因。

YABBY基因家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，其成員具有C2C2鋅指結(jié)構(gòu)域及YABBY結(jié)構(gòu)域，在這兩個結(jié)構(gòu)域的氨基酸殘基具有很大的保守性，而在此結(jié)構(gòu)域之外的區(qū)域幾乎不具有序列同源性[10，14，15]。在擬南芥基因組中有6個YABBY 基因家族成員，分別是FILAMENTOUS FLOWER（FIL/YABBY1）、CRABS CLAW（CRC）、INNER NO OUTER（INO/YABBY4）、YABBY2（YAB2）、YAB3 和YAB5 [10，14～17]。FIL/YAB1、YAB2 和YAB3 在葉片的遠(yuǎn)軸面表達(dá)，并且 FIL 和YAB3 過量表達(dá)的植株會產(chǎn)生遠(yuǎn)軸面化的葉片[15]，表明FIL 和YAB3 促進(jìn)葉片遠(yuǎn)軸面特征建成。另外，YABBY基因還與葉脈的形成有關(guān)[18]。

雖然YABBY基因的功能在擬南芥、水稻等植物中已經(jīng)有所研究，但到目前為止，關(guān)于大白菜YABBY基因的研究還未見報道。擬南芥和大白菜同屬于十字花科植物，本研究利用已完成的擬南芥和大白菜全基因組測序結(jié)果，采用生物信息學(xué)的方法對YABBY基因在擬南芥和大白菜中的基因組成、結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、氨基酸保守序列以及順式反應(yīng)元件等進(jìn)行了相關(guān)的分析。

1 材料與方法

11 擬南芥和大白菜YABBY家族基因序列獲得

擬南芥YABBY家族基因序列下載自TAIR網(wǎng)站（http：//wwwarabidopsisorg/indexjsp）。大白菜YABBY家族基因序列下載自大白菜基因組數(shù)據(jù)庫（http：//brassicadborg/brad/）。

12 YABBY基因結(jié)構(gòu)分析、序列比對、系統(tǒng)進(jìn)化分析和順式反應(yīng)元件分析

基因結(jié)構(gòu)分析采用網(wǎng)上在線分析軟件GSDS（http：//gsdscbipkueducn/）；YABBY蛋白家族的氨基酸多序列比對分析采用DNAMAN軟件，采用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置；擬南芥和大白菜中YABBY蛋白家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析使用MEGA40軟件，采用Bootstrap test-Neighbor Joining方法，重復(fù)500次運(yùn)算；順式反應(yīng)元件分析采用網(wǎng)上在線分析軟件PlantCARE（http：//bioinformaticspsbugentbe/webtools/plantcare/html/），分析時截取起始密碼子（ATG）上游15 kb的基因組DNA序列進(jìn)行分析，采用默認(rèn)參數(shù)設(shè)置。

2 結(jié)果與分析

21 擬南芥和大白菜YABBY基因概述

根據(jù)TAIR網(wǎng)站（http：//wwwarabidopsisorg/indexjsp）公布的擬南芥YABBY基因序列可以看出，擬南芥基因組共存在6個YABBY基因（表 1）。其中CYC、AtYABBY2和AtYABBY4位于染色體1，AtYABBY1和AtYABBY5位于染色體2，AtYABBY3位于染色體4，這說明YABBY基因在擬南芥基因組中的分布是不均勻的。 擬南芥和大白菜不同成員YABBY基因的開放閱讀框長度存在較大差異，其長度范圍分別為：495～723 bp（擬南芥）和474～717 bp（大白菜）。

大白菜基因組中共解析了11個YABBY基因，根據(jù)其在染色體上位置分別命名為BrYABBY1～BrYABBY11 （表 1）。大白菜YABBY基因與擬南芥YABBY基因類似，在基因組中也呈不均勻分布，其中染色體7和9上分別存在3個YABBY基因，染色體3上存在2個YABBY基因，而染色體4、6和8上則分別存在1個YABBY基因（表 1）。

22 擬南芥和大白菜YABBY基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化分析

在擬南芥6個YABBY基因中，有4個基因含有6個內(nèi)含子，2個基因含有5個內(nèi)含子（圖 1）。在大白菜11個YABBY基因中，有6個基因含有6個內(nèi)含子，3個基因含有5個內(nèi)含子，2個基因含有4個內(nèi)含子。這說明6個內(nèi)含子是YABBY基因的主要結(jié)構(gòu)形式。內(nèi)含子相位（Intron Phase）指的是內(nèi)含子在基因內(nèi)相對于遺傳密碼的3個核苷酸的位置。如果一個內(nèi)含子是處在2個完整的密碼間，則這一內(nèi)含子定義為相位0；如果內(nèi)含子是位于密碼子內(nèi)的第1和第2個核苷酸之后，則定義為相位1和相位2。如圖 1所示，擬南芥和大白菜的YABBY基因都存在相位0、1和2。但其中相位0為主要形式（分別22個和37個）。這說明擬南芥和大白菜YABBY基因的內(nèi)含子大部分都存在于兩個完整的密碼子之間。

23 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

從圖 2可以看出，在進(jìn)化樹的根部位置所有YABBY基因分成兩個大的類群，即A和B兩個亞族，每個亞家族均同時包含擬南芥和大白菜YABBY基因，表明這一基因家族的基本特征在大白菜和擬南芥分離之前就已經(jīng)形成；在2個亞族中大白菜YABBY基因的數(shù)目都多于擬南芥的YABBY基因數(shù)目，估計(jì)是由于YABBY基因在大白菜中擴(kuò)張的結(jié)果。

為便于分析蛋白之間是垂直同源還是平行同源的關(guān)系，根據(jù)其進(jìn)化特征將其細(xì)分成4個亞組，A和B亞族中各包含2個亞組。其中Ⅰ亞組包含7個成員，2個擬南芥YABBY基因和5個大白菜YABBY基因；Ⅱ亞組包含4個成員，2個擬南芥YABBY基因和2個大白菜YABBY基因；Ⅲ亞組僅包含1個擬南芥YABBY基因和1個大白菜YABBY基因；Ⅳ亞組則包含1個擬南芥YABBY基因

和3個大白菜YABBY基因。結(jié)合表1信息可以看出，位于同一條染色體上的YABBY基因在進(jìn)化上卻屬于不同的亞組，例如位于染色體3的BrYABBY1和BrYABBY2，位于染色體7的BrYABBY5、BrYABBY6和BrYABBY7，以及位于染色體9的BrYABBY9、BrYABBY10和BrYABBY11，這可能是這些基因獨(dú)自進(jìn)化的結(jié)果。但位于染色體7的BrYABBY7基因和位于染色體9的BrYABBY10基因卻表現(xiàn)出平行同源關(guān)系，可能是基因在進(jìn)化過程中發(fā)生了染色體的交換所致。在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ亞組中，AtYABBY1和BrYABBY6，AtYABBY3和BrYABBY9，AtYABBY4和BrYABBY5，AtYABBY5和BrYABBY2以及AtYABBY2和BrYABBY11，可以歸類為垂直同源進(jìn)化基因，它們在擬南芥和大白菜這兩種生物體中可能具有相似的功能。值得注意的是Ⅰ亞組中的BrYABBY8和Ⅱ亞組中的BrYABBY4與其它基因進(jìn)化距離相對較遠(yuǎn)，很可能是在大白菜中單獨(dú)進(jìn)化形成的；而Ⅱ亞組中的CYC與其它基因的進(jìn)化距離也相對較遠(yuǎn)，這可能是在擬南芥中單獨(dú)進(jìn)化形成的基因。

24 擬南芥和大白菜YABBY蛋白的多序列聯(lián)配分析

植物中YABBY蛋白的一個重要特征是都含有一個保守的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域（zinc finger-like domain）和一個螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域（helix-loop-helix domain）。為了確定擬南芥和大白菜中YABBY蛋白的序列特征，用DNAMAN軟件對6個擬南芥和11個大白菜的YABBY蛋白家族的氨基酸全序列進(jìn)行多序列比對分析，結(jié)果表明供試序列都具有兩個相對保守的結(jié)構(gòu)域，即位于N-末端的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域和位于C-末端的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域（圖3），這說明供試蛋白之間在生物學(xué)功能上可能具有相似性。

25 擬南芥和大白菜YABBY基因的順式反應(yīng)元件分析

基因的表達(dá)主要是其順式作用元件和反式作用因子相互作用的結(jié)果，通過分析啟動子及其上游序列的順式反應(yīng)元件可以預(yù)測基因的功能。本研究利用網(wǎng)上在線分析工具PlantCARE對擬南芥和大白菜所有YABBY基因起始密碼子上游15 kb區(qū)域進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)所有YABBY基因除了含有基本的順式反應(yīng)元件（TATA-box和CAAT-box）外，還含有多個脅迫和激素響應(yīng)元件，如熱脅迫響應(yīng)元件HSE，低溫脅迫響應(yīng)元件LTR，乙烯響應(yīng)元件ERE，生長素響應(yīng)元件AuxRR-core 和TGA-element，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件CGTCA-motif和TGACG-motif等（表 2）。表明，植物YABBY基因可能不僅與植物器官發(fā)育有關(guān)，還與植物逆境響應(yīng)和激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)。另外，不同的YABBY成員間具有的順式反應(yīng)元件存在一定的差異，如AtYABBY3、AtYABBY4、BrYABBY3和BrYABBY5基因分別具有1、1、1和4個脫落酸響應(yīng)元件ABRE，而其它的YABBY成員則不具有該響應(yīng)元件（表 2），說明不同YABBY成員可能具有不同的生物學(xué)功能。

注：A： ABRE ； B： ACE； C： 3-AF1； D： ARE ； E： AuxRR-core； F： Box I ； G： Box-W1； H： CAT-box ； I： CGTCA-motif； J： ERE ； K： GARE-motif； L： GT1-motif ； M： HSE； N： LTR； O： MBS； P： MNF1 ； Q： MRE ； R： O2-site； S： P-box ； T： Sp1； U： TATC-box； V： TC-rich repeats； W： TCA-element； X： TGA-element； Y： TGACG-motif； Z： WUN-motif。3 小結(jié)與討論

本研究利用生物信息學(xué)的方法對擬南芥和大白菜YABBY基因進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)大白菜具有比擬南芥更多的YABBY成員，并且與擬南芥相比，大白菜YABBY家族成員在染色體上的位點(diǎn)、基因序列結(jié)構(gòu)等方面顯得更為復(fù)雜，這可能與YABBY家族成員在進(jìn)化中為了適應(yīng)和參與更多的生物調(diào)節(jié)過程有關(guān)，也可能與大白菜具有較為復(fù)雜的基因組序列有關(guān)，如擬南芥基因組大小約為125 Mb，而大白菜的基因組大小約為285 Mb[19]。

根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析，YABBY每一亞族均包含擬南芥和大白菜YABBY基因，這表明該基因亞族中的基因結(jié)構(gòu)在擬南芥和大白菜分離之前就已經(jīng)構(gòu)建；同時在大白菜Ⅳ亞組中還發(fā)現(xiàn)BrYABBY7和BrYABBY10為平行同源基因，這表明在擬南芥和大白菜分離之后，大白菜中的YABBY基因按照物種特異性的方式進(jìn)行了擴(kuò)張。

通過對擬南芥和大白菜YABBY基因家族的序列保守性分析發(fā)現(xiàn)，大白菜和擬南芥YABBY基因家族之間的編碼蛋白存在較高的保守性，尤其在其N端的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)和C端的螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)更為明顯，這種序列上的保守性提示大白菜YABBY蛋白和擬南芥YABBY蛋白之間可能具有功能上的相似性。

通過對YABBY家族順式反應(yīng)元件的分析發(fā)現(xiàn)，有些YABBY基因具有多個光響應(yīng)元件、生長素響應(yīng)元件以及低溫響應(yīng)元件等。而大白菜的葉球在發(fā)生和發(fā)育過程中受到多種因素的影響，如生長素在葉片內(nèi)的不均衡分布、較低的溫度和較大的晝夜溫差、弱光和短日照，以及充足的碳素營養(yǎng)都可以促進(jìn)葉球的發(fā)生和發(fā)育[20]。這些結(jié)果暗示YABBY基因可能在大白菜葉球發(fā)育的分子調(diào)控中發(fā)揮重要的作用，但這還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。另外，除了上述響應(yīng)元件外，一些YABBY基因還具有熱脅迫、脫落酸、水楊酸以及茉莉酸甲酯等響應(yīng)元件，而脫落酸、水楊酸和茉莉酸甲酯等在植物非生物逆境和抗病反應(yīng)過程中具有重要功能。這說明，植物YABBY基因不僅與植物器官發(fā)育有關(guān)，而且與激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境響應(yīng)存在密切關(guān)系。

本研究為今后闡明大白菜葉球發(fā)育過程中YABBY蛋白的調(diào)控作用提供了一定的理論依據(jù)。隨著對YABBY蛋白研究的深入，YABBY蛋白的功能將會被進(jìn)一步了解，對YABBY蛋白家族更加詳盡的生物信息學(xué)分析以及利用分子生物學(xué)方法進(jìn)一步闡明YABBY蛋白在調(diào)控大白菜葉球發(fā)育和其它生物學(xué)進(jìn)程中的作用將是下一步的主要任務(wù)。參 考 文 獻(xiàn)：

[1] Hudson A Axioms and axes in leaf formation [J] Curr Opin Plant Biol， 1999， 2： 56-60

[2] Bowman J L Axial patterning in leaves and other lateral organs [J] Curr Opin Genet Dev， 2000， 10： 399-404

[3] Bowman J L， Eshed Y， Baum S F Establishment of polarity in angiosperm lateral organs [J] Trends Genet， 2002， 18： 134-141

[4] Telfer A， Poethig R S HASTY： a gene that regulates the timing of shoot maturation in Arabidopsis thaliana [J] Development， 1998， 125： 1889-1898

[5] Yu L， Yu X H， Shen R J，et al HYL1 gene maintains venation and polarity of leaves [J] Planta， 2005， 221： 231-422

[6] McConnell J R， Emery J， Eshed Y，et al Role of PHABULOSA and PHAVOLUTA in determining radial patterning in shoots [J] Nature， 2001， 411： 709-713

[7] McConnell J R， Barton M K Leaf polarity and meristem formation in Arabidopsis [J] Development， 1998， 125： 2935-2942

[8] Talbert P B， Adler H T， Parks D W， et al The REVOLUTA gene is necessary for apical meristem development and for limiting cell divisions in the leaves and stems of Arabidopsis thaliana [J] Development， 1995， 121： 2723-2735

[9] Otsuga D， DeGuzman B， Prigge M J，et al REVOLUTA regulates meristem initiation at lateral positions [J] Plant J， 2001， 25： 223-236

[10] Sawa S， Watanabe K， Goto K， et al FILAMENTOUS FLOWER， a meristem and organ identity gene of Arabidopsis， encodes a protein with a zinc finger and HMG-related domains [J] Genes Dev， 1999， 13： 1079-1088

[11] Sawa S， Ito T， Shimura Y， et al FILAMENTOUS FLOWER controls the formation and development of Arabidopsis inflorescences and floral meristems [J] Plant Cell， 1999， 11： 69-86

[12] Eshed Y， Baum S F， Perea J V，et al Establishment of polarity in lateral organs of plants [J] Curr Biol， 2001， 11：1251-1260

[13] Kerstetter R A， Poethig R S The specification of leaf identity during shoot development[J] Annu Rev Cell Dev Biol， 1998， 14： 373-398

[14] Bowman J L， Smyth D R CRABS CLAW， a gene that regulates carpel and nectary development in Arabidopsis， encodes a novel protein with zinc finger and helix-loop-helix domains [J] Development， 1999， 126： 2387-2396

[15] Siegfried K R， Eshed Y， Baum S F， et al Members of the YABBY gene family specify abaxial cell fate in Arabidopsis [J] Development， 1999， 126： 4117-4128

[16] Villanneva J M， Broadhvest J， Hauser B A，et al INNER NO OUTER regulates abaxial-adaxial patterning in Arabidopsis ovules [J] Genes Dev， 1999， 13： 3160-3169

[17] Lee J Y， Baum S F， Oh S H，et al Recruitment of CRABS CLAW to promote nectary development within the eudicot clade [J] Development， 2005， 132： 5021-5032

[18] Ohmori Y， Toriba T， Nakamura H， et al Temporal and spatial regulation of DROOPING LEAF gene expression that promotes midrib formation in rice [J] Plant J， 2011， 65： 77-86

[19] Wang X， Wang H， Wang J， et al The genome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa [J] Nat Genet， 2011， 43：1035-1039

[20] Ito H Effect of temperature and photoperiod on head formation of leaf head of Chinese cabbage [J] J Horti Associ Japan， 1957， 26： 154-162 山 東 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 2012，44（12）：7～10