鋼針和竹針針刺對(duì)長(zhǎng)時(shí)間電刺激誘發(fā)的骨骼肌細(xì)胞膜電位變化的作用

摘要：目的：比較金屬針與非金屬針針刺對(duì)長(zhǎng)時(shí)間電刺激誘發(fā)的骨骼肌細(xì)胞膜電位變化的影響。方法：取雄性蟾蜍半腱肌，分離出兩束肌細(xì)胞（隨機(jī)分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組），每束骨骼肌細(xì)胞數(shù)量在20個(gè)左右。采用細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)，記錄長(zhǎng)時(shí)間電刺激對(duì)骨骼肌細(xì)胞膜電位的作用。實(shí)驗(yàn)組在刺激結(jié)束后即刻給予不銹鋼針或竹針斜刺。結(jié)果：長(zhǎng)時(shí)間電刺激導(dǎo)致骨骼肌細(xì)胞的膜電位向去極化方向發(fā)展；不銹鋼針和竹針針刺均具有促進(jìn)長(zhǎng)時(shí)間電刺激后骨骼肌細(xì)胞膜電位恢復(fù)的作用，二者作用無顯著差異。結(jié)論：針刺對(duì)骨骼肌損傷的療效與針的材質(zhì)無關(guān)，只要取“阿是穴”斜刺，則可能取得良好的治療效果。

關(guān)鍵詞：針刺；骨骼肌細(xì)胞；膜電位；細(xì)胞內(nèi)記錄

中圖分類號(hào)：G804.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007—3612（2012）07—0045-04

針灸治療骨骼肌損傷具有療效明顯、療程短、安全、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)，近年來也得到了廣泛應(yīng)用。針刺對(duì)骨骼肌的治療作用機(jī)制研究也取得了一定的進(jìn)展。關(guān)于針刺作用機(jī)制的研究主要有兩種觀點(diǎn)：其一是神經(jīng)一體液論，認(rèn)為針刺的作用是通過激發(fā)某些神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，使舒血管神經(jīng)的活動(dòng)增強(qiáng)，或者是通過降低運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的活動(dòng)，從而解除肌肉痙攣，緩解肌肉疼痛。其二是外周機(jī)制論，認(rèn)為針刺可以通過某些不依賴于神經(jīng)體液的途徑而直接影響損傷肌肉結(jié)構(gòu)與功能的作用機(jī)制。研究證明，針刺促進(jìn)延遲性肌肉結(jié)構(gòu)變化的恢復(fù)作用與針刺后骨骼肌細(xì)胞膜內(nèi)鈣離子，鉀離子濃度改變有關(guān)。

目前，用針刺治療骨骼肌損傷均采用金屬針，那么非金屬針是否也能取得與金屬針一樣的治療作用？

用金屬針治療是否存在著電場(chǎng)或磁場(chǎng)的作用？本研究采用微電極技術(shù)，首先對(duì)單個(gè)骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)記錄，觀察其膜電位在長(zhǎng)時(shí)間電刺激后的變化；并選用不銹鋼針和竹針分別對(duì)骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行針刺處理，觀察金屬針刺與非金屬針刺對(duì)骨骼肌細(xì)胞膜電位變化的作用是否存在差異，從而探討針刺治療骨骼肌損傷是否與針的材質(zhì)有關(guān)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 蟾蜍，體重40～50g，雄性，取其半腱肌分離出兩束肌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

1.2 標(biāo)本制備 按常規(guī)方法破壞蟾蜍的腦和脊髓，剪除軀干上部及內(nèi)臟，剝?nèi)ハ轮つw，置于任氏液內(nèi)；用鋼針固定下肢，除去下肢大腿的縫匠肌，大收肌、大內(nèi)直肌和小內(nèi)直肌后，找到長(zhǎng)腱肌肉一半腱肌。在盡量保持長(zhǎng)腱情況下將半腱肌摘出，用針固定遠(yuǎn)心端的脛骨基端側(cè)肌腱和近心端的坐骨側(cè)肌腱于硅膠墊上。于解剖顯微鏡下，用鐘表鑷子剝?nèi)ソY(jié)締組織及肌外衣，再剝掉表面幾層肌細(xì)胞，直至剩下左右兩束，每束約20個(gè)左右的肌細(xì)胞為止。將剩下的兩束完整的、兩邊均附著在肌腱上的肌細(xì)胞束用針在肌腱處重新固定好，放置半小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞內(nèi)記錄 實(shí)驗(yàn)隨機(jī)選取其中一束肌細(xì)胞為對(duì)照肌，另一束為實(shí)驗(yàn)肌。采用細(xì)胞內(nèi)微電極技術(shù)，記錄骨骼肌細(xì)胞膜電位。微電極的尖端直徑小于0.5μm，充灌3mmol/L氯化鉀溶液，電極電阻10～15MΩ。主要儀器：MEZ-8201直流放大器；VC-10記憶示波器；SEN-7301電子刺激器（以上均為日本光電公司產(chǎn)品）；XC-603型微電極推進(jìn)器、垂直式微電極拉制器和二道生理記錄儀（國(guó)產(chǎn)）。電刺激參數(shù)：刺激強(qiáng)度2～4V，波寬50ms，時(shí)間45min，頻率2Hz。實(shí)驗(yàn)組在刺激停止后即刻，采用微電極推進(jìn)器將不銹鋼針或竹針沿肌束方向斜推進(jìn)入骨骼肌細(xì)胞束內(nèi)進(jìn)行針刺。兩種針的直徑相近，約為0.5mm。實(shí)驗(yàn)在室溫（24℃）條件下進(jìn)行。需要明確的是斜刺并非將針刺人肌纖維單個(gè)細(xì)胞內(nèi)，因?yàn)閮煞N針的直徑遠(yuǎn)大于肌細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)觀察的是（有或無）斜刺的同一條肌束中，肌纖維的靜息電位的變化；針刺前后記錄的肌纖維也并非相同的纖維。但是由于實(shí)驗(yàn)中的其他條件（同一塊肌肉、浴液溫度、酸堿及離子環(huán)境等）控制都一樣，各組靜息電位的變化是源于處理方式（有無針刺及使用的是竹針還是不銹鋼針）的不同。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。為了統(tǒng)計(jì)方便，去掉膜電位的負(fù)號(hào)，以絕對(duì)值表示，單位：mV（毫伏）。其絕對(duì)值變小即表示細(xì)胞的膜電位降低，向去極化方向發(fā)展。其絕對(duì)值變大即表示細(xì)胞的膜電位增高，向復(fù)極化方向發(fā)展。各組數(shù)據(jù)均以Mean±SD表示。

2 結(jié)果

2.1 骨骼肌細(xì)胞膜電位隨時(shí)間的變化 實(shí)驗(yàn)開始后，隨機(jī)選取兩肌束中肌細(xì)胞進(jìn)行靜息膜電位記錄，觀察記錄開始、靜置任氏液內(nèi)1h和2h后膜電位的變化?？梢?，在2h之內(nèi)，膜電位沒有顯著變化（圖1）。

2.2 金屬針和非金屬針針刺對(duì)骨骼肌細(xì)胞膜電位的影響

2.2.1 長(zhǎng)時(shí)間電刺激對(duì)骨骼肌細(xì)胞膜電位的影響實(shí)驗(yàn)肌和對(duì)照肌在電刺激45min后，于無針刺處理、單純休息10min的情況下，對(duì)比兩束肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前后膜電位的變化及幅值，見表1和圖2。

2.2.2 不銹鋼針和竹針針刺對(duì)長(zhǎng)時(shí)間電刺激誘發(fā)的骨骼肌細(xì)胞膜電位變化的影響 在電刺激45min后，對(duì)實(shí)驗(yàn)肌即刻進(jìn)行不銹鋼針或竹針刺處理，對(duì)照肌無針刺處理，單純休息10min的情況下，對(duì)比肌細(xì)胞膜電位的變化及幅值，見表1和圖2。

3 分析與討論

針刺療法是我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)臨床治病的主要手段之一。在治療肌肉疾患和促進(jìn)肌肉功能恢復(fù)方面，針刺療法占有重要的地位。從進(jìn)針的角度看，目前在治療肌肉疾患時(shí)所使用的針刺方法主要有直刺和斜刺兩類（直刺時(shí)針與皮膚約呈直角，斜刺時(shí)針與皮膚間有一定的傾斜角）。現(xiàn)有資料表明，兩種針刺方法均有較好的臨床療效，也有人已注意到在治療某些肌肉疾患時(shí)，斜刺比直刺效果更為顯著。斜刺阿是穴對(duì)肌肉損傷治療作用的臨床和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，往往在針刺后數(shù)秒到幾分鐘內(nèi)就會(huì)出現(xiàn)條索軟化、疼痛消失、功能恢復(fù)的明顯療效。電鏡下觀察，針刺可使損傷肌肉超微結(jié)構(gòu)的紊亂恢復(fù)正常，同時(shí)使肌肉收縮蛋白的免疫標(biāo)記密度和相應(yīng)的收縮結(jié)構(gòu)改變得到改善。有文獻(xiàn)報(bào)道，大負(fù)荷斜蹲后骨骼肌細(xì)胞出現(xiàn)z線扭曲、肌原纖維等改變；而直刺和斜刺均可減少這些變化，在對(duì)Z線扭曲的作用上斜刺優(yōu)于直刺。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)臨床及實(shí)驗(yàn)研究，選用斜刺方式。

有關(guān)針刺對(duì)運(yùn)動(dòng)性損傷肌的促恢復(fù)作用在人體及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中均得到證實(shí)。除電鏡對(duì)骨骼肌超微結(jié)構(gòu)的觀察外，屈竹青等對(duì)針刺前后細(xì)胞內(nèi)鈣、鎂、鈉、鉀等離子的分析及細(xì)胞膜、肌漿網(wǎng)膜ATP酶活性的測(cè)定也發(fā)現(xiàn)，針刺的作用是通過細(xì)胞膜Na-Ca交換，促使細(xì)胞內(nèi)增多的Ca²⁺外排而完成的。針刺的作用機(jī)制目前認(rèn)為可能是通過加強(qiáng)收縮蛋白的組裝、合成，使損傷肌肉的結(jié)構(gòu)與機(jī)能恢復(fù)正常，同時(shí)使疼痛緩解。盡管對(duì)于針刺作用機(jī)理的研究很多，但是關(guān)于針刺對(duì)細(xì)胞電學(xué)特性方面影響的研究十分匱乏。本研究即采用電生理學(xué)的微電極技術(shù)，于蟾蜍骨骼肌細(xì)胞上證實(shí)了長(zhǎng)時(shí)間電刺激可以誘發(fā)其細(xì)胞膜電位向去極化方向發(fā)展，斜刺具有促進(jìn)長(zhǎng)時(shí)間電刺激后骨骼肌細(xì)胞膜電位恢復(fù)的效應(yīng)。而且不論是金屬針（不銹鋼針）還是非金屬針（竹針）均有此效應(yīng)，二者的作用元顯著性差異，提示針刺治療骨骼肌損傷的作用效果并非源于金屬針的電場(chǎng)或磁場(chǎng)作用。

本研究所采用的實(shí)驗(yàn)標(biāo)本是從一塊骨骼肌上分離出的兩束肌細(xì)胞。首先我們觀察了在無電刺激、無針刺的條件下，于任氏液內(nèi)單純放置1～2h，骨骼肌細(xì)胞膜電位的變化。如圖1所示，肌細(xì)胞膜電位并無明顯變化。說明我們后續(xù)實(shí)驗(yàn)中將整個(gè)時(shí)程控制在兩小時(shí)內(nèi)，來觀察長(zhǎng)時(shí)間電刺激引起的骨骼肌細(xì)胞膜電位的變化，以及針刺對(duì)長(zhǎng)時(shí)間電刺激后骨骼肌細(xì)胞膜電位變化的影響作用是可行的。

我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間電刺激后，骨骼肌細(xì)胞膜電位降低，向去極化方向發(fā)展，如表2所示。這一研究結(jié)果與國(guó)外一些學(xué)者的研究結(jié)果是一致的。例如，Sigward使用大白鼠的比目魚肌和趾伸肌，利用電刺激的方式誘發(fā)肌肉標(biāo)本運(yùn)動(dòng)至疲勞，并采用微電極技術(shù)直接觀察了對(duì)照組和電刺激組的膜電位變化，發(fā)現(xiàn)電刺激肌肉收縮至疲勞可使肌細(xì)胞膜電位降低，即使膜電位向去極化的方向發(fā)展。關(guān)于長(zhǎng)時(shí)間電刺激后，引起的骨骼肌細(xì)胞膜電位降低，向去極化方向發(fā)展的機(jī)制仍在探索中。Sigaard的研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)時(shí)間電刺激后引起的骨骼肌細(xì)胞膜電位降低的同時(shí)，肌細(xì)胞內(nèi)鉀離子濃度也降低，因此他認(rèn)為二者之間存在聯(lián)系。我國(guó)學(xué)者也發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間電刺激后骨骼肌細(xì)胞膜內(nèi)離子濃度及酶活性均發(fā)生變化。因此，我們實(shí)驗(yàn)中所發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)時(shí)間電刺激后骨骼肌細(xì)胞膜電位向去極化方向發(fā)展，很可能也與肌細(xì)胞內(nèi)離子濃度的變化有關(guān)，但仍需進(jìn)一步探討。

本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過45min電刺激后，給予其中一束肌細(xì)胞針刺處理，另一束肌細(xì)胞元針刺處理的實(shí)驗(yàn)條件下，兩束肌細(xì)胞的膜電位變化幅度之間出現(xiàn)顯著性差異。進(jìn)行不銹鋼針針刺處理的肌細(xì)胞膜電位變化幅度是（12.83±2.74）mV，而無針刺處理的肌細(xì)胞膜電位變化幅度卻是（28.05±2.88）mV。經(jīng)檢驗(yàn)，兩者之間存在顯著性差異。竹針針刺組的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行竹針針刺處理的肌細(xì)胞膜電位變化幅度是（14.14±4.04）mV，也與無針刺處理的肌細(xì)胞膜電位變化幅度之間存在顯著性差異。但是，不銹鋼針和竹針兩個(gè)處理組之間不存在顯著性差異。針刺后膜電位出現(xiàn)恢復(fù)，恢復(fù)程度在不銹鋼針針刺組和竹針針刺組分別達(dá)到85.18%和84.32%。這說明長(zhǎng)時(shí)間電刺激后對(duì)骨骼肌細(xì)胞進(jìn)行金屬針刺或進(jìn)行非金屬針刺的處理，均有促進(jìn)肌細(xì)胞膜電位恢復(fù)的作用，使骨骼肌細(xì)胞膜電位向復(fù)極化方向發(fā)展，但是效果無明顯差異。因此，我們可以推斷目前常用的金屬針刺對(duì)骨骼肌損傷的治療作用并非由于金屬針的電場(chǎng)或磁場(chǎng)作用引起。

4 結(jié)論

針灸具有悠久的歷史，古人曾用石針刺透肌膚和穴位。石針的磨制非常費(fèi)時(shí)費(fèi)力，容易折斷，也不易普及。所以后來古人改用竹針來制造針具，例如把老竹經(jīng)油炸處理后削成為既堅(jiān)又韌的竹針，這就是“箴”。再進(jìn)一步，當(dāng)金屬冶煉術(shù)發(fā)展起來后，又改用青銅針具或貴金屬針具，如金針、銀針等，這就是“鍼”。隨著冶金技術(shù)的進(jìn)步，人們制成了金屬針（稱為微針），并用微針對(duì)經(jīng)脈進(jìn)行治療。金屬針逐漸代替了以往的砭、箴，從而加強(qiáng)了針灸術(shù)的實(shí)用性，加快了針灸的發(fā)展進(jìn)程。我們的研究，第一次從細(xì)胞膜電位的變化這個(gè)角度，采用細(xì)胞內(nèi)記錄的方式，不僅證實(shí)了斜刺具有促進(jìn)長(zhǎng)時(shí)間電刺激引起的骨骼肌細(xì)胞膜去極化的恢復(fù)作用，而且金屬針刺和非金屬針刺均有相似效果，充分說明目前所用的金屬針刺治療骨骼肌損傷的效果并非源于金屬針刺的電場(chǎng)或磁場(chǎng)效應(yīng)。