小鼠胚胎體外培養(yǎng)研究
2012-12-31 00:00:00伊力達(dá)爾·艾尼瓦爾
【摘要】本文所選用的實(shí)驗(yàn)材料為小鼠原核胚，主要研究幾種不同溶液、溶液所含不同生長因素、不同培養(yǎng)氣象等所對(duì)小鼠原核胚發(fā)展產(chǎn)生的影響，主要目的是最終找到一種適于小鼠胚胎成長的培養(yǎng)環(huán)境以及溶液成分，進(jìn)而不斷優(yōu)化小鼠胚胎體外培養(yǎng)的體系結(jié)構(gòu)。并且為其它哺乳類動(dòng)物的胚胎體外培養(yǎng)提供一些參考。
【關(guān)鍵詞】小鼠；胚胎；體外培養(yǎng)
0.前言
在邁入新世紀(jì)以后，我國的科學(xué)技術(shù)發(fā)展十分迅猛，尤其是我國的生物科技得到了廣泛的推廣與使用，從而加快了人類社會(huì)的發(fā)展。胚胎工程是指主要針對(duì)胚胎哺乳類動(dòng)物的胚胎所進(jìn)行的工程技術(shù)操作，之后再將胚胎繼續(xù)發(fā)育，從而使人們獲得所需的成體動(dòng)物的一種全新技術(shù)。當(dāng)前，胚胎工程在蓄牧種繁殖預(yù)遺傳資源保護(hù)、利用方面得到了廣泛推廣和使用，并且在人類疾病真毒、藥物研發(fā)等研究方面蘊(yùn)含巨大應(yīng)用價(jià)值，因此，受到人們高度的關(guān)注。
1.材料預(yù)方法
1.1實(shí)驗(yàn)所需的材料
實(shí)驗(yàn)所需的動(dòng)物：清潔過的雌性預(yù)雄性小鼠，所選用的雌性小鼠年齡約在28—35日的日齡范圍內(nèi)，共約250只，而選用的雄性小鼠日齡在56天以上，共有32只。選用的實(shí)際預(yù)藥品主要有，丙酮酸鈉、青霉素鈉、鏈霉素、探索氫鈉、氯化鎂、?；撬岬?。而所選用的儀器主要有倒置顯微鏡與實(shí)體顯微鏡，離心機(jī)、PH儀、顯微圖像管理系統(tǒng)等。小鼠胚胎培養(yǎng)液主要有三種，即HTF、CZB、KSOM溶液。在配制每一種溶液時(shí)都要進(jìn)行過濾，以便除菌，并且還要放在4攝氏度的環(huán)境下進(jìn)行保存。
1.2小鼠超數(shù)排卵
從中選用體重超過25g雌性小鼠，要在小鼠腹腔中注射PMSG20IU，待48小時(shí)之后再在腹腔中注射Hcg10IU。雄性小鼠要選用體重超過30g的，嚴(yán)格按照雌性鼠預(yù)雄性鼠比例為2：1的比例放在同一個(gè)籠中混合養(yǎng)殖，在第二天早晨要檢查小鼠的陰道栓，將具有陰道栓的雌性小鼠在20—23小時(shí)范圍內(nèi)提取卵母細(xì)胞預(yù)卵丘細(xì)胞的復(fù)合體。
1.3采集小鼠的原核胚
在注射hCG后的22小時(shí)后，采用頸椎脫臼方法將小鼠處死，在用酒精消毒之后，剪開腹腔，在沿著小鼠卵巢端剪取輸卵管，將輸卵管放在生理鹽水的35mm培養(yǎng)器皿中，然后將培養(yǎng)器皿放進(jìn)實(shí)驗(yàn)室，將小鼠的輸卵管放入到洗卵液培養(yǎng)器皿中浸泡一段時(shí)間。與此同時(shí)，要求實(shí)驗(yàn)人員在體視顯微鏡下準(zhǔn)確找到輸卵管膨大位置，再使用專門的注射器將其劃破，然后輕輕擠壓小鼠輸卵管端部，從而大量溢出小鼠卵母細(xì)胞復(fù)合體。
1.4培養(yǎng)小鼠原核胚
首先，要制作一胚胎培養(yǎng)碟，然后將小鼠原核胚放入其中，并且在上部覆蓋一層石蠟油，將其放置在碳培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)至37度環(huán)境下預(yù)熱四個(gè)小時(shí)。把細(xì)胞復(fù)合體取出放在500uLHTF溶液中，利用移液槍吹打幾次，并將脫光卵丘細(xì)胞原核胚抽取出。多次反復(fù)進(jìn)行此操作，待卵細(xì)胞全部脫落后，再將其移動(dòng)到胚胎培養(yǎng)碟中培養(yǎng)。在移入時(shí)標(biāo)記為0小時(shí)，在24小時(shí)以后，便開始觀察小鼠卵細(xì)胞的分裂情況，而在48小時(shí)之后便開始觀察小鼠細(xì)胞分裂情況，在72小時(shí)后觀察小鼠桑椹胚分裂，在96小時(shí)后觀察小鼠囊胚分裂輕，而在120小時(shí)之后，便開始觀察小鼠囊胚孵化情況。
1.5實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案
實(shí)驗(yàn)1不同培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠原核胚體，將正常受精之后的小鼠原核胚分為3小組，并且分別放入到三種不同培養(yǎng)基中，即HTF、CZB、KSOM中，共培養(yǎng)約120小時(shí)。并且要不斷觀察小鼠原核胚發(fā)育狀況，對(duì)三組胚胎發(fā)育率加以統(tǒng)計(jì)，此次實(shí)驗(yàn)要進(jìn)行多次。
實(shí)驗(yàn)2置于不同濃度的EGF或者是bFGF的KSOM溶液培養(yǎng)小鼠原核胚體將受精后的正常原核胚分成7組，分別在含有EGF以及bFGF的KOSM溶液中培養(yǎng)120小時(shí)。并且要不斷觀察小鼠的原核胚發(fā)育狀況，再將各組培養(yǎng)基中小鼠胚胎發(fā)育率加以統(tǒng)計(jì)。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行幾次。
實(shí)驗(yàn)3利用WOW法培養(yǎng)小鼠原核胚，在受精后的原核胚分成2組，利用WOW法以及成組培養(yǎng)法培養(yǎng)小鼠原核胚胎。在培養(yǎng)約120小時(shí)左右，觀察其原核胚發(fā)育情況，統(tǒng)計(jì)各組胚胎發(fā)育率，此實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行多次。
實(shí)驗(yàn)4將小鼠原核胚體放在不同培養(yǎng)氣相中培養(yǎng)，將受精后的原核胚分成3組，分別放在不同的混合氣體中培養(yǎng)約120小時(shí)。觀察小鼠原核胚體發(fā)育狀況，統(tǒng)計(jì)各組胚胎發(fā)育率。此實(shí)驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行多次。
2.結(jié)果分析
2.1三組溶液對(duì)小鼠原核胚體發(fā)育產(chǎn)生的影響
通過實(shí)驗(yàn)我們得出：在這三組溶液中，其卵裂率、囊胚率、囊胚細(xì)胞并沒有較大差異。其中，在KOMS溶液中的卵裂率是最大的，而CZB溶液中囊胚率比其它兩種溶液要高，然而，HTF囊胚細(xì)胞數(shù)是最多的。
2.2 KSOM中EGF或者bFGF含量不同對(duì)小鼠原核胚體發(fā)育產(chǎn)生的影響
在培養(yǎng)基中，加入不同溶度的EGF或者是BFGF，并不會(huì)對(duì)小鼠原核胚發(fā)育產(chǎn)生較大的影響。
2.3 WOW對(duì)小鼠原核胚體發(fā)生產(chǎn)生的影響
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：從卵裂率方面來分析，WOW要高于對(duì)照組，但是，效果不是十分明顯；從小鼠受精細(xì)胞的囊胚率、囊細(xì)胞數(shù)角度分析，利用WOW法分裂能力要明顯高于對(duì)照組。因此，便得出培養(yǎng)小鼠原核胚應(yīng)該最好利用WOW法，其培養(yǎng)效果較好。
2.4培育氣相不同對(duì)小鼠原核胚胎發(fā)育產(chǎn)生的影響
通過實(shí)驗(yàn)證明，在氧氣濃度為5%的KSOM培養(yǎng)液與在肺氣組CZB溶液中的的培養(yǎng)效果最好。
3.討論
3.1不同溶液對(duì)小鼠原核胚體發(fā)育影響
對(duì)于哺乳類動(dòng)物胚體的發(fā)育來說，是受很多因素影響的，但是，最主要的影響因素是培養(yǎng)基。然而，當(dāng)前，哺乳類動(dòng)物胚體體外發(fā)育往往會(huì)選用集中溶液包含HTF、CZB、KSOM等。雖然其它類型的胚胎培養(yǎng)液也可以支持哺乳動(dòng)物胚胎的體外發(fā)育。然而，在體外培育胚胎過程中，常表現(xiàn)出一定程度的發(fā)育阻滯。在通過大量實(shí)驗(yàn)證明，HTF培養(yǎng)效果最好。
3.2不同濃度EGF或者是BFGF對(duì)小鼠胚體發(fā)育帶來的影響
通過實(shí)驗(yàn)證明，小鼠的早期胚胎在體外發(fā)育過程中，因小鼠胚體原性生長因素在胚體發(fā)育中有較強(qiáng)的分泌調(diào)控能力，能夠快速使胚體發(fā)育至囊胚時(shí)期。然而，只依靠內(nèi)源性生長因素，會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育非常緩慢，并且囊胚的發(fā)育率偏低，最終導(dǎo)致囊胚細(xì)胞較少。因此，胚胎發(fā)育需要來自怒踢生殖管道分泌的生長因子的共同參與。但是，如果不具有外源性生長因素，那么會(huì)嚴(yán)重阻礙小鼠胚胎發(fā)育。
3.3培養(yǎng)方法不同對(duì)小鼠胚體發(fā)育產(chǎn)生的影響
在體外培養(yǎng)胚胎時(shí)，采用微滴方式可以促進(jìn)胚胎的發(fā)育，但是，在選用WOW法培養(yǎng)胚胎時(shí)，因胚胎間相互隔離，能夠使胚胎分泌的因子不被稀釋，通過自分泌的方式作用在胚胎上，與此同時(shí)，又可以阻礙有毒物質(zhì)作用在胚胎上，阻礙其發(fā)育率。
3.4培養(yǎng)氣相不同對(duì)小鼠胚體發(fā)育產(chǎn)生的影響
通過上述實(shí)驗(yàn)證明，在氧氣濃度為5%的條件下，KOSM培養(yǎng)溶液效果要高度其它幾組，但是，其它兩組培養(yǎng)效果沒有較大差異。雖然小鼠胚體能夠在高濃度的氧氣環(huán)境中生長預(yù)發(fā)育，然而，在低濃度氧氣環(huán)境下，能夠提高胚胎的存活率，更會(huì)促進(jìn)胚胎的發(fā)育。
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