沉默miR-146a對認(rèn)知功能障礙大鼠干預(yù)效果及作用機制

劉嬋媛 付遠兵 趙金慧 陳漢華

(武漢科技大學(xué)附屬武漢市武昌醫(yī)院精神心理科，湖北 武漢 430070)

認(rèn)知功能障礙主要表現(xiàn)為記憶功能障礙，多發(fā)于老年群體〔1，2〕。由于我國人口老齡化問題日趨嚴(yán)重，導(dǎo)致近年來該認(rèn)知障礙病例連年上升，引起社會的廣泛關(guān)注〔3，4〕。發(fā)生老年癡呆的患者均存在認(rèn)知功能障礙，有學(xué)者表示，早發(fā)現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，并進行積極防治，對老年癡呆預(yù)防具有重要意義〔5〕。因此本文主要研究認(rèn)知功能障礙發(fā)生機制，探究新的治療方式及針對認(rèn)知功能障礙存在的治療意義。本研究通過建立認(rèn)知功能障礙大鼠模型，靶向調(diào)控miR-146a表達，觀察這種方式的作用。

1 材料與方法

1.1材料 選取40只SD健康雄性大鼠，由江蘇科惟生物技術(shù)有限公司提供，7～10月齡，平均(8.5±1.2)個月；體重215～244 g，平均(229.5±11.6)g。在相對濕度45%～55%、溫度(26.5±4.4)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)大鼠，每天接受12 h太陽照射，培養(yǎng)1 w。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。主要試劑：兔抗小鼠白細胞介素(IL)-1β、IL-6抗體(美國Hyclone公司)；大鼠抗小鼠S100β抗體(Gibco公司)；兔抗大鼠miR-146a抗體(美國Becton)；小鼠抗大鼠神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)抗體(美國 Sigma公司)；小鼠抗兔腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(美國 Invitrogen公司)；大鼠抗小鼠B細胞淋巴瘤(Bcl-2)抗體(美國 Selleck Chemicals公司)；小鼠抗兔半胱氨酸蛋白酶(caspase)3抗體(丹麥 Dako公司)。

1.2方法

1.2.1建模及分組 隨機從40只大鼠中抽出10只為正常組，另外30只建立認(rèn)知功能障礙模型：參照劉玥欣等〔6〕研究中建模方法，對大鼠進行麻醉干預(yù)后固定，頸部去毛后對表皮進行消毒處理，縱向切開皮膚，將左側(cè)頸總動脈、筋膜以及肌肉組織分離，對左側(cè)頸總動脈進行結(jié)扎，局部注射青霉素預(yù)防感染，將切口縫合。將30只認(rèn)知功能障礙大鼠隨機分為模型組、過表達miR-146a組、沉默miR-146a組各10只，過表達miR-146a組尾部靜脈注射25 mg/kg agomiR-146a，沉默miR-146a組尾部靜脈注射25 mg/kg antagomiR-146a，正常組、模型組大鼠尾部靜脈注射等量生理鹽水。

1.2.2學(xué)習(xí)記憶能力檢測 準(zhǔn)備一個高60 cm、直徑為160 cm的水池，將水池一半注入溫度為21℃的水，并在水池中設(shè)置4個入水點。在水池中央設(shè)置平臺，將所有大鼠從入水點放入水中，對各組由入水點游至平臺的時間進行記錄，若2 min還沒到達平臺，采用主動引到平臺的方式，潛伏期計為2 min。大鼠在平臺上停留一會后，再將其從其他不同入水點再次放入，進行連續(xù)測試，所有大鼠連續(xù)測試4 d，第5天撤除水池中央平臺，將大鼠自入水點放入水中，記錄1 min內(nèi)大鼠穿越平臺次數(shù)。

1.2.3標(biāo)本制備 取各組大鼠尾部靜脈血5 ml，3 000 r/min離心處理10 min后，使上清液分離，在-70℃環(huán)境中保存待檢。麻醉處理各組，將大鼠斷頭處死，取其海馬區(qū)腦組織，浸泡于5%甲醛中，24 h后進行石蠟包埋及連續(xù)切片處理。

1.2.4蘇木素-伊紅(HE)染色 將切片標(biāo)本進行烤干、脫蠟處理。使用蘇木素染色20 min后清洗3～4次，使用鹽酸酒精分化處理30 s，充分清洗后使用3%伊紅染色，再次使用酒精對切片進行脫水、脫蠟處理，對其切片進行封片后，用顯微鏡觀察。

1.2.5S100β、NSE、BDNF、TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測標(biāo)本S100β、NSE、BDNF、TNF-α、IL-1β、IL-6水平。操作按試劑盒說明書進行。

1.2.6miR-146a表達檢測反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測miR-146a表達。提取細胞總RNA，檢測RNA純度、含量，逆轉(zhuǎn)錄處理后獲得互補DNA(cDNA)，設(shè)計引物序列，采用2-ΔΔCt方法計算miR-146a表達。

1.2.7Bcl-2、caspase3相對表達量檢測 Western印跡檢測Bcl-2、caspase3表達：取160℃放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解液，6℃苯甲基磺酰氟(PMSF)冰中孵育30 min，4℃ 2 000 r/min離心15 min，取上清。每個樣品取20 g蛋白，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)入聚偏氟乙烯(PDVF)膜，7%脫脂牛奶常溫下密封2 h。加入抗體過夜。取出后使用TBST液沖洗，結(jié)合第二抗體，1 h后清洗、顯色，從而檢測Bcl-2、caspase3相對表達量。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進行F檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組腦組織病理學(xué)觀察 與正常組比較，模型組、過表達miR-146a組腦組織細胞排列不規(guī)則，并且附有嚴(yán)重的腫脹、破裂狀況；沉默miR-146a組大鼠腦組織細胞腫脹、破裂狀況情況相對過表達miR-146a組較輕，且細胞排列較規(guī)則，見圖1。

圖1 各組腦組織病理學(xué)觀察(HE染色，×400)

2.2各組學(xué)習(xí)記憶能力比較 過表達miR-146a組、模型組、沉默miR-146a組第1～4天逃避潛伏期均顯著高于正常組，穿越平臺次數(shù)均顯著低于正常組(P<0.05)；沉默miR-146a組第1～4天逃避潛伏期均顯著低于模型組、過表達miR-146a組，穿越平臺次數(shù)均顯著高于模型組、過表達miR-146a組(P<0.05)，見表1。

表1 各組學(xué)習(xí)記憶能力比較

2.3各組S100β、NSE、BDNF水平比較 與正常組比較，模型組、過表達miR-146a組、沉默miR-146a組大鼠S100β、NSE水平顯著升高，BDNF水平顯著降低(P<0.05)；與模型組、過表達miR-146a組比較，沉默miR-146a組S100β、NSE水平顯著降低，BDNF水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 各組S100β、NSE、BDNF水平及miR-146a、Bcl-2、caspase3比較

2.4各組miR-146a、Bcl-2、caspase3表達比較 與正常組比較，模型組、過表達miR-146a組、沉默miR-146a組miR-146a、Bcl-2、caspase3表達顯著升高(P<0.05)；沉默miR-146a組miR-146a、Bcl-2、caspase3水平顯著低于模型組、過表達miR-146a組(P<0.05)。見表2、圖2。

1～4：正常組、模型組、過表達miR-146a組、沉默miR-146a組圖2 Western印跡檢測Bcl-2、caspase3表達

2.5各組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 模型組、過表達miR-146a組、沉默miR-146a組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均顯著高于正常組(P<0.05)；與模型組、過表達miR-146a組比較，沉默miR-146a組TNF-α、IL-1β、IL-6水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

3 討 論

認(rèn)知是機體腦組織接受、處理信息，并將信息轉(zhuǎn)化為心理活動，進而獲取所需知識、信息的過程，其中包括語言、計算、記憶、判斷、執(zhí)行等，認(rèn)知功能障礙是指一項或多項認(rèn)知功能出現(xiàn)損傷，進而對日常生活能力、社會功能造成影響，及時防治認(rèn)知功能障礙是預(yù)防老年癡呆的關(guān)鍵〔7，8〕。臨床常采用康復(fù)訓(xùn)練、藥物等方式來進行恢復(fù)治療，但其發(fā)病機制在臨床醫(yī)學(xué)中尚未研究透徹，臨床治療效果并不十分理想〔9，10〕。專家學(xué)者通過多種途徑對認(rèn)知功能障礙發(fā)病機制進行研究。其中miRNA在多種生物體中均存在，并且在自身運轉(zhuǎn)過程中與炎癥介質(zhì)、免疫形態(tài)等相互作用〔11，12〕。研究表明，miR-146a表達變化與機體認(rèn)知障礙情況具有密切聯(lián)系〔13，14〕。

認(rèn)知功能障礙即機體記憶功能出現(xiàn)障礙，并對其神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重損傷。徐巖等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)有效的干預(yù)能夠發(fā)揮神經(jīng)功能保護作用，改善認(rèn)知功能障礙大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力。本研究結(jié)果說明認(rèn)知功能障礙大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較差。本研究還發(fā)現(xiàn)，沉默miR-146a表達的認(rèn)知功能障礙大鼠逃避潛伏期明顯縮短，穿越平臺次數(shù)明顯增加，原因可能是沉默miR-146a表達能夠改善認(rèn)知功能、神經(jīng)功能，提升學(xué)習(xí)、記憶能力，保護機體神經(jīng)系統(tǒng)。

S100β在機體中以細胞形態(tài)存在，位于神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細胞中，自身表達高低與神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度緊密關(guān)聯(lián)〔16〕。NSE作為一種酸性蛋白酶，在神經(jīng)元細胞中廣泛存在，作用于細胞內(nèi)糖酵解〔17〕。BDNF作為神經(jīng)營養(yǎng)因子，主要存在于機體腦組織神經(jīng)系統(tǒng)，具有保護神經(jīng)系統(tǒng)的作用〔18〕。本研究結(jié)果說明認(rèn)知功能障礙的發(fā)生發(fā)展伴隨著腦組織神經(jīng)系統(tǒng)損傷，沉默miR-146a表達能調(diào)控S100β、NSE、BDNF水平，減輕認(rèn)知功能障礙大鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴(yán)重程度。

研究發(fā)現(xiàn)減輕大鼠海馬區(qū)炎癥反應(yīng)，能夠減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴(yán)重程度，從而減輕大鼠認(rèn)知功能障礙〔19，20〕。TNF-α、IL-1β、IL-6是臨床常用的炎癥因子，檢測TNF-α、IL-1β、IL-6水平能夠?qū)ρ装Y反應(yīng)嚴(yán)重程度進行評價。本研究結(jié)果說明認(rèn)知功能障礙伴隨著神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，沉默miR-146a表達能夠抑制TNF-α、IL-1β、IL-6水平，減輕大鼠海馬區(qū)炎癥反應(yīng)，從而減輕大鼠認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重程度。

認(rèn)知功能障礙、神經(jīng)系統(tǒng)損傷與機體腦組織神經(jīng)細胞凋亡之間具有極為緊密的關(guān)聯(lián)性。caspase3以蛋白酶形態(tài)存在，參與機體細胞的凋亡過程。Bcl-2以蛋白形態(tài)存在于機體當(dāng)中，自身具有促進細胞存活的作用，其表達變化與細胞凋亡緊密關(guān)聯(lián)〔21，22〕。本研究結(jié)果原因可能是沉默miR-146a表達通過靶向調(diào)控線粒體細胞凋亡通路蛋白Bcl-2、caspase3表達，能夠?qū)ｑR區(qū)組織神經(jīng)細胞的凋亡起到抑制作用，達到保護神經(jīng)細胞的作用，減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷、認(rèn)知功能障礙嚴(yán)重程度。

綜上，沉默認(rèn)知功能障礙模型大鼠miR-146a表達，能夠改善大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，調(diào)控S100β、NSE、BDNF水平，靶向調(diào)控Bcl-2、caspase3表達，抑制大鼠海馬組神經(jīng)細胞凋亡，減輕大鼠神經(jīng)損傷嚴(yán)重程度以及腦組織炎癥反應(yīng)。