黑莓品種‘Arapaho’離體葉片不定芽誘導影響因素分析及再生體系建立

王魯北，張春紅，王小敏，吳文龍，李維林

〔江蘇省·中國科學院植物研究所(南京中山植物園)，江蘇 南京 210014〕

黑莓(Rubus spp.)隸屬于薔薇科(Rosaceae)懸鉤子屬(Rubus L.)，為半灌木漿果類果樹，其果實營養(yǎng)豐富，具有防衰老和提高人體免疫力等功效［1－2］，是近年來國內外新興起的第三代果樹之一，具有很高的經濟價值，因而，開展優(yōu)良黑莓品種的培育和推廣具有重要的應用和經濟價值。目前，黑莓育種多以實生選優(yōu)、雜交育種、輻射育種等手段為主［3］，但是這些方法具有一定的局限性，進程也比較慢，嚴重制約了黑莓優(yōu)良品種的選育。隨著分子生物技術的發(fā)展，基因工程技術為黑莓育種開辟了一條新途徑，通過基因工程方法，可以有針對性地引入特定基因，從而獲得具有優(yōu)良性狀的轉基因黑莓植株。

‘Arapaho’是由美國阿肯色州大學于1992年推出的一個黑莓品種［4］。該品種于2004年被引入南京，表現(xiàn)出直立、無刺、早熟的優(yōu)良特性，但適應性較差［5］。因此，可利用轉基因技術導入相關抗逆基因，以提高‘Arapaho’的抗逆性，使其更適宜在南京地區(qū)種植。

目前常用的遺傳轉化方法為葉盤法，其成功的關鍵在于擁有一個高效而穩(wěn)定的不定芽離體再生系統(tǒng)，因此，離體葉片再生體系的建立是開展果樹生物技術育種的重要基礎。然而，目前有關黑莓組織培養(yǎng)的研究均以莖尖和腋芽培養(yǎng)為主，關于葉片再生培養(yǎng)的研究報道較少［6－9］，而有關黑莓品種‘Arapaho’離體葉片再生體系的研究尚未見報道。

鑒于此，作者以黑莓品種‘Arapaho’葉片為外植體，對影響葉片不定芽植株再生的培養(yǎng)條件(包括基本培養(yǎng)基類型、6－BA和IBA質量濃度、暗培養(yǎng)時間及外植體的葉位和接種方式)以及不定芽生根的適宜IBA質量濃度進行比較研究，篩選出適合黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽植株再生的培養(yǎng)體系，以期為其品質改良和遺傳轉化奠定研究基礎。

1 材料和方法

1.1 材料及基本培養(yǎng)條件

黑莓品種‘Arapaho’無菌苗葉片取自江蘇省·中國科學院植物研究所黑莓組織培養(yǎng)實驗室。該無菌苗誘導自大田植株當年生新梢上帶腋芽的莖段，并在含0.5 mg·L－16－BA和0.3 mg·L－1NAA的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)30～40 d。取無菌苗中上部完全展開的葉片，剪去葉尖及葉緣并保留2～3 mm葉柄，作為外植體。

除特殊說明外，均取無菌苗形態(tài)學第1位至第5位的葉片，葉面朝上接種在培養(yǎng)基上，接種后均先暗培養(yǎng)3周后再進行光照培養(yǎng)。參照文獻［10］設置培養(yǎng)基的pH和瓊脂濃度及基本培養(yǎng)條件(如光照強度、培養(yǎng)溫度和時間等)。

1.2 方法

1.2.1 基本培養(yǎng)基類型和外源激素質量濃度的比較 采用4因素3水平正交實驗設計方法〔L9(3)4〕，4個因素包括基本培養(yǎng)基類型(MS、WPM和N6)、6－BA質量濃度(1.0、2.0和4.0 mg·L－1)、IBA質量濃度(0.1、0.5和1.0 mg·L－1)和空列，培養(yǎng)40 d后觀察并統(tǒng)計葉片不定芽誘導率及平均不定芽數(shù)。每處理4瓶，每瓶接種5片葉，并重復3次。

1.2.2 暗培養(yǎng)時間的比較 將外植體葉片接種于含有2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上，分別經過0(CK)、7、14、21和28 d的暗培養(yǎng)后再進行光照培養(yǎng)，40 d后統(tǒng)計葉片不定芽誘導率及平均不定芽數(shù)。每處理接種4瓶，每瓶接種5片葉，并重復3次。

1.2.3 葉位的比較 分別取無菌苗形態(tài)學的1和2位、3和4位、5和6位、7和8位、9和10位葉片，接種于含有2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計葉片不定芽誘導率及平均不定芽數(shù)。每處理4瓶，每瓶接種5片葉，并重復3次。

1.2.4 接種方式的比較 按照葉面朝上和葉面朝下2種方式將葉片接種于含有2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計葉片不定芽誘導率及平均不定芽數(shù)。每處理4瓶，每瓶接種5片葉，并重復3次。

1.2.5 生根培養(yǎng)基中IBA添加量的比較 誘導培養(yǎng)30 d后將不定芽從外植體上切下，接種于含有0.5 mg·L－16－BA和0.3 mg·L－1NAA的MS培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，不定芽高約2 cm時，將其從基部切下，分別接種于含有0.05、0.10、0.20和0.50 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上誘導生根；20 d后測量和統(tǒng)計不定芽的生根率及單株的平均根干質量、根數(shù)和根長。每處理3瓶，每瓶3～4個不定芽，并重復3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

參照以下公式分別計算不定芽誘導率、平均不定芽數(shù)、生根率和平均根數(shù)：不定芽誘導率=(形成不定芽的葉片數(shù)/接種的葉片總數(shù))×100％；平均不定芽數(shù)=不定芽總數(shù)/形成不定芽的葉片數(shù)；生根率=(生根的不定芽數(shù)/接種的不定芽總數(shù))×100％；平均根數(shù)=根總數(shù)/生根不定芽總數(shù)。

采用Excel 2007軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和差異顯著性分析。

2 結果和分析

2.1 葉片不定芽誘導過程中影響因素的分析

2.1.1 基本培養(yǎng)基類型和外源激素質量濃度的比較 接種2周左右，葉片邊緣貼近培養(yǎng)基的地方開始出現(xiàn)少量綠色或黃綠色愈傷組織；培養(yǎng)20 d后，在葉片部分傷口及愈傷組織處可以看到明顯的綠色芽點，尤以葉片和葉柄相連接處傷口的芽點數(shù)居多；隨后，芽點迅速生長，發(fā)育為不定芽。

正交實驗結果(表1)表明：在基本培養(yǎng)基類型和外源激素質量濃度不同的培養(yǎng)基中葉片的不定芽誘導率存在差異，在9個處理組中，含有2.0 mg·L－16－BA和0.5 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基的不定芽誘導效果最佳，不定芽誘導率達64.52％，平均不定芽數(shù)為3.85。3個因素按不定芽誘導率由大到小依次排序為基本培養(yǎng)基類型、6－BA質量濃度、IBA質量濃度，最佳誘導培養(yǎng)基應為含有2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基；3個因素按平均不定芽數(shù)由大到小依次排序為基本培養(yǎng)基類型、IBA質量濃度、6－BA質量濃度，最佳誘導培養(yǎng)基應為含有2.0 mg·L－16－BA和0.5 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基。對于離體葉片再生體系而言，葉片不定芽誘導率是首要的考察指標，因而，含有2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基為黑莓品種‘Arapaho’離體葉片不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基。

表1 黑莓品種‘Arapaho’離體葉片不定芽誘導體系中基本培養(yǎng)基類型和外源激素質量濃度的正交實驗結果1)Table 1 Orthogonal experiment result of basic medium type and exogenous hormone concentration in induction system of adventitious bud from in vitro leaves of blackberry cultivar‘Arapaho’1)

2.1.2 暗培養(yǎng)時間的比較 暗培養(yǎng)時間對黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導的影響見表2。結果表明：與對照相比，經過不同時間的暗培養(yǎng)，不定芽誘導率和平均不定芽數(shù)有一定差異；經過21 d的暗培養(yǎng)，不定芽誘導率極顯著高于對照(P＜0.01)，但平均不定芽數(shù)與對照差異不顯著。隨暗培養(yǎng)時間的延長，葉片不定芽誘導率和平均不定芽數(shù)均呈先升高后降低的變化趨勢，其中暗培養(yǎng)時間達到21 d，不定芽誘導率最高(67.08％)；但暗培養(yǎng)時間延長至28 d，葉片不定芽誘導率下降至51.63％。說明暗培養(yǎng)時間對黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽形成有重要影響，適宜的暗培養(yǎng)時間可提高葉片的不定芽誘導率，但暗培養(yǎng)時間過長則會導致不定芽誘導率降低。綜合分析結果顯示：在黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導過程中，最適宜的暗培養(yǎng)時間為21 d。

表2 暗培養(yǎng)時間對黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導率和平均不定芽數(shù)的影響1)Table 2 Effects of dark culture time on induction rate and average number of adventitious bud from in vitro leaves of blackberry cultivar‘Arapaho’1)

2.1.3 外植體葉位的比較 外植體葉位對黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導的影響見表3。結果表明：采用不同葉位的葉片作為外植體，不定芽誘導率存在一定差異，其中，第3至第6位葉的不定芽誘導率極顯著高于第9和第10位葉，但平均不定芽數(shù)差異不顯著。第3和第4位葉的不定芽誘導率最高，達到71.74％，平均不定芽數(shù)也最多，為2.46；第5和第6位葉的不定芽誘導率為66.47％，平均不定芽數(shù)為2.31。綜合分析結果顯示：黑莓品種‘Arapaho’植株中、上部葉片的不定芽誘導能力優(yōu)于下部葉片，其中第3和第4葉位為適宜的外植體取樣葉位。

表3 外植體葉位對黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導率和平均不定芽數(shù)的影響1)Table 3 Effects of leaf position of exp lants on induction rate and average number of adventitious bud from in vitro leaves of blackberry cultivar‘Arapaho’1)

2.1.4 接種方式的比較 采用葉片正放和反放2種方式進行接種，黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導率和平均不定芽數(shù)有明顯差異。采用正放方式(即葉面朝上)接種的葉片不定芽誘導率達64.29％，平均不定芽數(shù)為2.87；采用反放方式(即葉面朝下)接種的葉片不定芽誘導率為32.87％，平均不定芽數(shù)為1.44。差異顯著性分析結果表明：2種接種方式的葉片不定芽誘導率和平均不定芽數(shù)差異極顯著(P＜0.01)。綜合分析結果表明：在黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導過程中，適宜的外植體接種方式是葉片正放。

2.2 IBA質量濃度對不定芽生根的影響

觀察結果表明：接種在生根培養(yǎng)基上10 d后，黑莓品種‘Arapaho’的不定芽開始萌根，隨后根開始進行伸長生長，20 d后形成完整植株。表4結果表明：接種在含有0.00～0.50 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上，不定芽的生根率均達到100.0％；但部分培養(yǎng)基的平均生根數(shù)、平均根長和平均單株根干質量存在顯著或極顯著差異。在不添加IBA的MS培養(yǎng)基(對照)上，不定芽的平均根長最長(4.4 cm)，但平均根數(shù)少，根細長且側根很少；在添加0.20 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上，平均根長較長(3.20 cm)，平均根數(shù)最多(6.90條)，平均單株根干質量最大(8.10 mg)，且平均根數(shù)和平均單株根干質量極顯著高于對照(P＜0.01)。綜合分析結果顯示：含有0.2 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基是最適宜于黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽生根的培養(yǎng)基，生根率可達100.0％，且側根較多、根長勢良好。

表4 生根培養(yǎng)基中IBA質量濃度對黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽生根的影響1)Table 4 Effect of IBA concentration in rootingmedium on rooting of adventitious bud from in vitro leaves of blackberry cultivar‘Arapaho’1)

3 討論和結論

通常，外源激素種類和濃度以及基本培養(yǎng)基類型是影響植株再生的關鍵因素。不同基因型黑莓離體葉片的再生能力迥異，其適宜的外源激素的種類、濃度和配比等條件差異較大。正交實驗結果表明：基本培養(yǎng)基類型對黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導的影響最大，在供試的3種基本培養(yǎng)基(MS、WPM和N6)中，MS培養(yǎng)基最適于黑莓‘Arapaho’葉片不定芽誘導；而基本培養(yǎng)基中需要添加的最佳激素組合為2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA，這與他人的相關研究結果有一定差異。由文獻［9，11］可見：MS是適合黑莓葉片再生的基本培養(yǎng)基，但培養(yǎng)基中添加的外源激素以TDZ居多。其原因可能與不同基因型黑莓的內源激素水平和生理狀態(tài)等相關。由于作者僅研究了6－BA和IBA組合對黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導的影響，而TDZ是否可以使其不定芽誘導率達到更高，則有待進一步研究。

目前，在許多植物的離體葉片培養(yǎng)中均證實暗培養(yǎng)可以促進不定芽的誘導［12－14］，本研究也得出了類似的結果。雖然暗培養(yǎng)不是黑莓品種‘Arapaho’離體葉片不定芽誘導的必需條件，但可顯著提高不定芽誘導率，而對不定芽數(shù)的影響卻不明顯。

以黑莓品種‘Arapaho’第3和第4位葉為外植體，不定芽誘導率最高；其次是第5和第6位葉；第1和第2位葉的不定芽誘導率也較高；而第7至第10位葉的不定芽誘導率最低，均在40％以下。說明黑莓品種‘Arapaho’無菌苗植株的中、上部葉片比下部葉片的再生能力強，有利于不定芽分化，這與周瑞金等［15］的研究結果相似，其原因可能與不同葉位葉片的內源激素水平分布差異有關。

離體葉片的接種方式對葉片再生效應的影響有差異。在黑莓品種‘Arapaho’葉片不定芽誘導過程中，正放(葉面朝上)葉片的不定芽誘導率及平均不定芽數(shù)均極顯著高于反放(葉面朝下)葉片?？梢姡~面朝上接種更有利于黑莓品種‘Arapaho’不定芽的誘導，這與Nehra等［16］和安偉［17］的研究結果有一定差異，其原因可能與黑莓葉片背面氣孔多、結構疏松，更有利于營養(yǎng)的吸收有關。

根據(jù)上述實驗結果，初步建立了適宜于黑莓品種‘Arapaho’離體葉片的再生體系：取無菌苗第3和第4位葉片，適當修剪后，葉面朝上接到含2.0 mg·L－16－BA和1.0 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)21 d后進行光照培養(yǎng)；30 d后將不定芽接種到含有0.5mg·L－16－BA和0.3mg·L－1NAA的MS培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)；待不定芽高約2 cm時接種到含有0.2 mg·L－1IBA的MS培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。

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