銅污染對延胡索生長和銅積累的影響

余順慧，劉雙琳，方榮美，董凱馨，張 靜，祁俊生

（重慶三峽學(xué)院三峽庫區(qū)水環(huán)境演變與污染防治重慶高校市級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶萬州404100）

銅污染對延胡索生長和銅積累的影響

余順慧，劉雙琳，方榮美，董凱馨，張 靜，祁俊生＊

（重慶三峽學(xué)院三峽庫區(qū)水環(huán)境演變與污染防治重慶高校市級重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶萬州404100）

為闡明Cu2＋污染對延胡索的毒害機(jī)理，采用土培法對延胡索進(jìn)行不同Cu2＋濃度的處理，探討重金屬對其生長、抗氧化酶活性和Cu2＋積累的影響。結(jié)果表明：Cu2＋污染下，延胡索生長受抑制，生物量下降；明顯影響延胡索的抗氧化酶活性，即隨著Cu2＋處理濃度的增加，CAT、POD及SOD的酶活性變化呈先升后降趨勢；明顯影響延胡索葉綠素含量，除Cu2＋濃度在150mg／kg時(shí)，葉綠素含量略有增加外，總體呈下降趨勢；隨著Cu2＋處理濃度的增加，延胡索地下塊莖對Cu2＋的積累逐漸增多，在Cu2＋濃度為250mg／kg時(shí)Cu2＋含量增加速度最大。生產(chǎn)上應(yīng)注意土壤中的Cu2＋含量。

銅污染；延胡索；生長；銅積累

銅是植物微量營養(yǎng)元素，過量的銅會對植物造成危害。自然界中，由于銅礦的開采，金屬冶煉及三廢的排放，含銅農(nóng)業(yè)化合物的使用，有機(jī)肥的施用，以及生活污水的排放，使農(nóng)田土壤含Cu量顯著增加。由于中藥材的生長需要吸收水分以及土壤中的營養(yǎng)元素，從而使得銅也在體內(nèi)積累，之后在用來治療疾病時(shí)就會對人類的健康造成威脅。中藥用來治病、防病的歷史在我國已經(jīng)有上千年，中藥對于我國來說是一種非常重要的商品，首先應(yīng)對人體無毒害作用。如果中藥材被金屬污染，不但不能用來治病，而且潛在威脅人體的健康。重金屬在中藥材中的含量問題，已經(jīng)有不少學(xué)者關(guān)注，他們普查了100種中藥材，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重金屬在中藥材中是普遍存在的，而且一些藥材中還有很高的含量。自20世紀(jì)90年代以來多起中藥中重金屬超標(biāo)事件的發(fā)生，引起了各界的關(guān)注，這使得國際醫(yī)藥市場的熱門話題中中藥材問題，一再出現(xiàn)，這不僅嚴(yán)重?fù)p害中國在國際的形象，也受到很大經(jīng)濟(jì)損失，解決中藥材中重金屬問題，已經(jīng)勢在必行。因此，研究土壤中重金屬污染對中藥材生長的影響具有重要意義。中藥材種類繁多，本研究以延胡索為實(shí)驗(yàn)材料，延胡索是著名的“浙八昧”之一，從明代以前就開始種植［3］。近年來，由于重金屬污染以及病蟲危害等原因，延胡索的產(chǎn)量一再降低，品質(zhì)也大不如前。延胡索具有藥效的重要指標(biāo)之一是含有生物堿，以往研究延胡索主要測定生物堿含量，有關(guān)重金屬對延胡索的產(chǎn)量和品質(zhì)的影響鮮有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室用重金屬銅、鉛等脅迫狗牙根以研究其耐性機(jī)理，并取得了一定的成績［47］。為了提高延胡索的產(chǎn)量、優(yōu)化其質(zhì)量，以及提高經(jīng)濟(jì)效益，為栽培模式提供實(shí)踐指導(dǎo)和理論依據(jù)，本試驗(yàn)通過對延胡索進(jìn)行不同銅濃度的處理，從而探討重金屬對其生長的影響。

1材料與方法

1．1材料

供試材料來自浙江省常規(guī)栽培延胡索品種（Oorydalis yanhusuo W．T．wang），由重慶三峽學(xué)院百安校區(qū)試驗(yàn)基地提供。

1．2試驗(yàn)方法

采用5個處理，1個對照，3組平行，盆栽試驗(yàn)，每盆裝5kg小粉土，向小粉土中分別加入硫酸銅，混和均勻，其含銅劑量分別為0mg／kg、100mg／kg、150mg／kg、250mg／kg、350mg／kg和400mg／kg，重復(fù)3次，每盆種植延胡索5株，對照（CK）不含銅，定期檢查生長情況。供試土壤肥力基礎(chǔ)為有機(jī)質(zhì)89%，全氮0．23%，水解氮12．58mg／kg，速效鉀50．34mg／kg，速效磷11．34mg／kg，銅13．4mg／kg。

1．3測定指標(biāo)與方法

在延胡索出現(xiàn)傷害癥狀后，收獲，取其地下塊莖洗凈稱鮮重，烘箱中80℃烘干至恒重，稱重；采用丙酮－乙醇分光光度法［8］測定葉綠素含量；采用南京建成生物工程研究所購買的SOD、POD試劑盒測定SOD活性和POD活性；采用分光光度法［9］測定CAT活性。

收獲后，延胡索地下塊莖分別用自來水、去離子水沖洗3次，80℃烘干，粉碎后，精確稱取延胡索各樣品0．200 0g，加入酸液（濃HNO3∶濃H2SO4＝4∶1），同時(shí)做空白組；用MARS240微波消解系統(tǒng)消解以上溶液后，冷卻。過濾（濾液在25mL容量瓶中定容），保存在塑料瓶中，樣品中Cu2＋含量（mg／kg干重）用AA－6300原子吸收分光光度計(jì)測定。

1．4統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS11．5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和處理，并應(yīng)用Sigmapiot10．0軟件作圖。

2結(jié)果與分析

2．1銅污染對延胡索生長的影響

如表所示，隨著Cu2＋處理濃度的增加，延胡索地下塊莖的生物量呈現(xiàn)遞減趨勢。不同Cu2＋處理?xiàng)l件下生物量差異不顯著（P＞0．05）。表明延胡索對Cu2＋有一定的耐性。Cu2＋是植物生長發(fā)育所必需的微量營養(yǎng)元素，延胡索地下塊莖的生物量隨著Cu2＋處理濃度的增加呈遞減趨勢，對植物生長有利的Cu2＋濃度范圍與植物的種類有關(guān)［10］。研究表明，在Cu2＋處理濃度為350mg／kg時(shí)延胡索地下塊莖鮮重和干重減少幅度突然增加，鮮重由250mg／kg土的2 6．6 0%增至3 5 0mg／kg土的58．62%，干重由250mg／kg土的52．67%增至350mg／kg土的72．71%（均和對照相比），說明，Cu2＋污染濃度350mg／kg對延胡索產(chǎn)量和生長有明顯的影響，在生產(chǎn)上要注意土壤中Cu2＋含量。

2．2延胡索抗氧化酶系統(tǒng)在銅污染下的變化特征

2．2．1SOD酶活性 植物體內(nèi)存在一個抗氧化酶系統(tǒng)，由SOD、POD、CAT三者組成［5－6］，三者的相互協(xié)調(diào)作用，能有效清除植物細(xì)胞內(nèi)的自由基和過氧化物。能清除細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的酶（主要是SOD）。在重金屬脅迫的逆境條件下，延胡索細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的大量活性氧自由基，被SOD及時(shí)有效的清除，從而保護(hù)植物不被重金屬污染［5－6］。由圖1可知，隨著Cu2＋濃度的增加，酶活性呈先上升后下降的變化趨勢，在Cu2＋濃度為150mg／kg時(shí)酶的活性最高，由對照0mg／kg的186．71U／g FW增加到150mg／kg的666．82U／g FW，增加71．99%；濃度大于150mg／kg酶的活性急劇下降，最低出現(xiàn)在400mg／kg時(shí)，與對照相比，降低47．77%。這說明，低濃度Cu2＋處理對酶的活性有一定的促進(jìn)作用，高濃度Cu2＋處理對酶活性有抑制作用。由于活性氧自由基對該酶活性有一定的刺激作用，因此，這有可能是活性升高的原因。但過高Cu2＋處理時(shí)，就會導(dǎo)致自由基大量積累在植物葉片細(xì)胞內(nèi)，造成對植物的過氧化傷害。因?yàn)?，在延胡索葉片細(xì)胞內(nèi)重金屬Cu2＋積累量加大，從而減弱植物葉片細(xì)胞內(nèi)保護(hù)酶系統(tǒng)清除活性氧自由基的能力，故，高濃度Cu2＋處理使延胡索SOD活性下降。這與吳國榮、周長芳等的研究結(jié)果一致［11］。

2．2．2POD酶活性POD酶和SOD酶同等重要。SOD酶的歧化產(chǎn)物雙氧水，被POD酶分解成水。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，逆境可以減弱POD酶的活性，嚴(yán)重的逆境也可能增強(qiáng)POD的活性，由于逆境誘使植物產(chǎn)生更多的過氧化物。POD活性的高低，不僅與逆境條件有關(guān)，還和植物組織受到損害的程度有關(guān)，破壞越大，其POD活性越高［6］。由圖1可知，Cu2＋處理濃度在0～150mg／kg時(shí)，延胡索葉片細(xì)胞內(nèi)的POD活性上升，由對照0mg／kg的406．56U／g FW增至150mg／kg的2 368．06U／g FW，增加82．83%；大于150mg／kg時(shí)呈下降趨勢，在400mg／kg時(shí)，酶的活性最低，與對照相比，降低26．68%。隨著Cu2＋處理濃度的進(jìn)一步增大，可能促進(jìn)延胡索細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量的增加，從而加劇膜脂過氧化，導(dǎo)致大量產(chǎn)生有害物質(zhì)，降低POD活性，從而對細(xì)胞的保護(hù)作用減弱，甚至消失。這與王愛云等的研究結(jié)果一致［］。

表 不同濃度銅處理延胡索地下塊莖的生物量Table Biomass of R．yanhusuo underground tubers under different Cu2＋stress

2．2．3CAT酶活性CAT是H2O2分解為O2和H2O的生物催化劑，能夠清除植物體內(nèi)的H2O2［6］。從圖1可知，隨著Cu2＋濃度的增加，CAT活性呈先升后降的趨勢。由對照0mg／kg的105．78U／（g·min）增至150mg／kg的305．30U／（g·min），增加65．35%；大于1 5 0mg／kg時(shí)呈下降趨勢，在400mg／kg時(shí)，酶的活性最低，與對照相比，降低18．73%。究其原因，由于低濃度Cu2可以促進(jìn)植株過氧化氫的生成，進(jìn)而刺激CAT活性升高［13］。當(dāng)Cu2濃度高于150mg／kg時(shí)，CAT活性下降，其原因是過氧化氫過量，破壞了酶系統(tǒng)。此時(shí)Cu2污染對植株表現(xiàn)出抑制作用。

圖1 不同濃度銅污染延胡索葉片的CAT、SOD 和POD酶活性Fig．1 Leaf CAT，SOD and POD activity of R．yanhusuo under different Cu2＋stress

2．3延胡索葉綠素含量在銅污染下的變化特征

由圖2可知，隨著Cu2＋處理濃度的增加，除在150mg／kg Cu2＋濃度處理時(shí)葉綠素（a＋b）含量略有增加外，整體呈下降趨勢。葉綠素含量變化表明，植物在Cu2＋濃度很低時(shí)，存在抗逆性，但Cu2＋濃度增大超過植物自身調(diào)節(jié)范圍時(shí)，葉綠素含量則迅速減少。這可能是由于Cu2＋大量進(jìn)入延胡索葉片細(xì)胞內(nèi)加速葉綠素分解，同時(shí)導(dǎo)致葉綠體結(jié)構(gòu)破壞［5］。

圖2 銅污染下延胡索葉綠素（a＋b）的含量Fig．2 Leaf chlorophyll（a＋b）content of R．yanhusuo under different Cu2＋stress

2．4銅污染對延胡索重金屬含量的影響

由圖3可知，隨著Cu2＋濃度的增加，延胡索地下塊莖Cu2＋積累量增加，各處理間差異顯著（P＜0．05），并且濃度越大，增長的幅度越大，積累量越大。在Cu2＋濃度為250mg／kg時(shí)，Cu2＋含量增加速度最大，達(dá)119．03mg／kg，比濃度為150mg／kg時(shí)增加95．37%；Cu2＋濃度為400mg／kg時(shí)，Cu2＋積累量為129mg／kg，比350mg／kg增加5．31%。生產(chǎn)上應(yīng)該注意土壤中的Cu2＋含量。

圖3 銅污染下延胡索地下塊莖中的Cu2＋含量Fig．2 Cu2＋content of R．yanhusuo underground tubers under different Cu2＋stress

3結(jié)論與討論

1）Cu2＋污染明顯影響延胡索葉綠素含量和生物量。Cu2＋污染下的延胡索葉綠素含量變化明顯，總體呈下降趨勢。綠色植物能進(jìn)行光合作用的主要色素是葉綠素，因此，葉綠素含量的多少，直接影響光合作用的強(qiáng)弱，其含量在一定程度上反映植物同化作用的能力［5，14］。

高濃度的重金屬常常會破壞植物葉綠體膜系統(tǒng)，使葉綠體合成受阻，這就有可能是延胡索葉片中葉綠素含量減少的原因。Rebechini H M等認(rèn)為，葉綠體基粒垛結(jié)構(gòu)的解體，很可能是過量Cu2＋造成的；同時(shí)Cu2＋的過量還能使相關(guān)基質(zhì)減少，從而破壞葉綠體結(jié)構(gòu)。其次，高濃度的Cu2＋會破壞延胡索的根系，減弱根系對營養(yǎng)元素的吸收、轉(zhuǎn)移，間接抑制延胡索體內(nèi)其他元素的含量，從而影響葉綠素的正常合成。此外，Cu2＋在根部積累過多，使得葉綠素前體物質(zhì)的合成受阻，而且還與葉綠體中蛋白質(zhì)上的—SH基結(jié)合，以此影響葉綠素酸脂還原酶等一系列酶的活性。由于Cu2＋是植物必須的營養(yǎng)元素，這有可能是葉綠素酶活性增加的主要原因，進(jìn)而分解植物體內(nèi)的葉綠素，引起延胡索生物量減少。

2）Cu2＋處理對延胡索抗氧化酶活性有明顯影響。CAT、POD和SOD活性隨著Cu2＋濃度的增加先升后減。植物為了使自身不受傷害，通常情況下，體內(nèi)都有各種平衡機(jī)制，植物體內(nèi)活性氧代謝也不例外。但是，由于各種外在因素的影響，使植物機(jī)能下降，體內(nèi)機(jī)制不再平衡，使得活性氧的量不斷上升，超過自身需要的范圍，而且加速膜脂過氧化，損害細(xì)胞膜系統(tǒng)的功能。重金屬脅迫中的SOD、POD 及CAT的作用，已經(jīng)在很多研究中出現(xiàn)。本試驗(yàn)結(jié)果表明：Cu2＋從植物根系進(jìn)入植物體，在體內(nèi)轉(zhuǎn)移的過程中，會發(fā)生一系列生理生化反應(yīng)，隨之產(chǎn)生過氧化物，隨其增加，出現(xiàn)對植物的傷害，從而反饋調(diào)節(jié)POD酶活性，植物對過氧化物含量以及POD酶活性的調(diào)節(jié)是一個連環(huán)機(jī)制。而POD活性下降的原因則是：隨著Cu2＋處理濃度的進(jìn)一步增大，細(xì)胞內(nèi)氧自由基含量超過了植物能調(diào)節(jié)的范圍，使得植物體內(nèi)膜脂過氧化加劇，間接刺激POD，使其活性下降，從而失去作用，對植物細(xì)胞的保護(hù)也消失。

SOD是一種超氧自由基清除劑，也是在植物體內(nèi)調(diào)節(jié)氧自由基平衡的一種酶，使氧自由基處于平衡狀態(tài)，對植物不產(chǎn)生傷害。SOD的活性高低受兩方面的影響，即體內(nèi)調(diào)節(jié)和植物抗性的大小。生物本身存在適應(yīng)環(huán)境的能力，因此在適度逆境誘導(dǎo)下，植物靠體內(nèi)酶的調(diào)節(jié)緩沖不良環(huán)境，因此，其抗逆能力有所提高。本研究結(jié)果顯示：在Cu2＋脅迫濃度很小時(shí)，延胡索葉片內(nèi)的活性氧清除酶增加，這是為了適應(yīng)環(huán)境而特有的機(jī)制。從而刺激SOD的活性增加，由此可以將葉片中產(chǎn)生的過多O2－在傷害自身前盡快清除。但是再繼續(xù)增加Cu2＋濃度，植物自身正常歧化能力已經(jīng)不能消除過多O2－，葉片中過量的O2－就會損害葉細(xì)胞多種功能膜和酶系統(tǒng)，從而使SOD酶活性削弱，因此活性出現(xiàn)下降的趨勢。

1901年Loew首次在炯草中發(fā)現(xiàn)并提取能夠催化雙氧水分解的酶，命名為Catalase［15］。植物體內(nèi)CAT的作用是將H2O2催化分解成H2O和O2，位于植物微體和相關(guān)細(xì)胞器中的CAT是一種蛋白質(zhì)，其具體性質(zhì)為單功能、陰聚體的含亞鐵血紅素，植物葉中光呼吸產(chǎn)生的過氧化氫，就是被其除去的［16］。葉綠體中，H2O2的分解過程，需要催化劑的存在，CAT是該過程的催化劑。本研究結(jié)果表明：隨著Cu2＋濃度的增加，CAT活性以先增加后減少的趨勢變化。由于低濃度Cu2＋對H2O2產(chǎn)生促進(jìn)作用，在植物體內(nèi)，營養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸過程中，會發(fā)生系列生理生化反應(yīng)，使得CAT活性增加。但隨著Cu2＋濃度增加，Cu2＋脅迫對植株表現(xiàn)出抑制作用，植物CAT活性降低。

3）Cu2＋污染能明顯增加延胡索地下塊莖中的Cu2＋含量，隨著Cu2＋濃度的增加，延胡索地下塊莖Cu2＋積累量增加。在Cu2＋濃度為250mg／kg土?xí)r，Cu2＋含量增加速度最大，達(dá)119．03mg／kg，生產(chǎn)上應(yīng)注意土壤中的Cu2＋含量。

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（責(zé)任編輯：劉 海）

Effects of Copper Pollution on Growth and Cu2＋Accumulation of Rhizoma yanhusuo

YU Shunhui，LIU Shuanglin，F(xiàn)ANG Rongmei，DONG Kaixin，ZHANG Jing，QI Junsheng＊
（Key Laboratory of Water Environment Evolution and Pollution Control in Three Gorges Reservoir，Wanzhou，Chongqing404100，China）

R．yanhusuo plants were cultured in pots adding different Cu2＋concentration to discuss effects of heavy metals on growth，antioxidant enzyme activity and Cu2＋accumulation of R．yanhusuo under different Cu2＋stress and expound the toxicant mechanism of Cu2＋pollution to R．yanhusuo．Results：Cu2＋pollution inhibits growth of R．yanhusuo．The CAT，POD and SOD activity of R．yanhusuo presents a first rising and then declining trend with increase of Cu2＋concentration．The leaf chlorophyll content of R．yanhusuo shows a declining trend overall with increase of Cu2＋concentration，except for 150mg／kg Cu2＋concentration．Cu2＋accumulation in R．yanhusuo underground tubers increases gradually with increase of Cu2＋concentration and the increase speed of Cu2＋content in R．yanhusuo underground tubers reaches the maximum when Cu2＋concentration is 250mg／kg，which indicates that soil Cu2＋content should be paid more attention to in production of R．yanhusuo．

copper pollution；Rhizoma yanhusuo；growth；Cu2＋accumulation

S19

A

1001－3601（2016）02－0083－0133－04

2015－07－07；2015－12－30修回

重慶市應(yīng)用開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目“延胡索規(guī)范化生態(tài)種植與深加工關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)”（cstc2014yykfA110024）

余順慧（1964－），女，教授，碩士，從事植物生態(tài)學(xué)研究。E－mail：ysh＿dch＠163．com

＊通訊作者：祁俊生（1964－），男，教授，博士，從事植物生態(tài)學(xué)研究。E－mail：qijunsheng＠163．com