白藜蘆醇對力竭游泳大鼠肝臟組織的保護作用研究

侯媛媛，劉麗萍，王建斌，李敬春，孫志佳

（1.河北體育學院，石家莊 050041；2.邢臺醫(yī)學高等?？茖W校，河北 邢臺 054000；3.河北省體育科學研究所，石家莊 050000）

白藜蘆醇對力竭游泳大鼠肝臟組織的保護作用研究

侯媛媛1，劉麗萍1，王建斌2，李敬春3，孫志佳1

（1.河北體育學院，石家莊 050041；2.邢臺醫(yī)學高等?？茖W校，河北 邢臺 054000；3.河北省體育科學研究所，石家莊 050000）

目的：探討白藜蘆醇對肝臟組織的保護作用，進而為白藜蘆醇應用于運動領域提供實驗依據。方法：選取雄性SD大鼠30只，隨機分為3組，每組10只，分別為安靜對照組、運動對照組和實驗組 （運動＋100 mg／kg Res）。各組大鼠每日稱重后，實驗組每天灌胃100 mg／kg Res，其他兩組分別灌胃相同體積的溶酶，連續(xù)2周。于第15天，運動對照組和實驗組進行力竭游泳，運動后即刻，測定血清中谷丙轉氨酶 （ALT）活性和肝臟組織中超氧化物歧化酶 （SOD）活性、總抗氧化能力 （T－AOC）和丙二醛 （MDA）含量。結果：運動對照組大鼠肝臟組織 MDA含量顯著高于安靜對照組 （p＜0.01），實驗組肝臟組織MDA含量顯著低于運動對照組 （p＜0.01）；運動對照組大鼠肝臟組織SOD活性顯著低于安靜對照組 （p＜0.01），實驗組肝臟組織SOD活性顯著高于運動對照組 （p＜0.01）；運動對照組大鼠肝臟組織T－AOC水平顯著高于安靜對照組 （p＜0.05），實驗組肝臟組織T－AOC水平顯著高于運動對照組 （p＜0.01）；運動對照組大鼠血清中ALT水平顯著高于安靜對照組 （p＜0.01），實驗組血清中ALT水平顯著低于運動對照組 （p＜0.01）。結論：①力竭運動后，機體內源性自由基水平迅速升高，造成肝臟組織損傷。②補充白藜蘆醇能夠增強肝臟組織抗氧化能力，起到保護肝臟的作用。

白藜蘆醇；力竭游泳；肝臟；保護作用

歐美人群因高膽固醇、高脂肪、高熱量的飲食習慣和吸煙、嗜酒等不良生活方式，心血管疾病發(fā)生率極高，但有著相同生活習性的法國人，其冠心病等心血管疾病的發(fā)病率和死亡率遠遠低于英國、美國。這種現(xiàn)象就是人們常說的 “法國悖論”（Franch Paradox）［1－2］。這可能與法國人習慣適度地飲用紅葡萄酒有關，進一步研究發(fā)現(xiàn)在紅葡萄酒中白藜蘆醇濃度高達1.5—3 mg／L［3］。特別是自1997年Jang等在 《科學》雜志上發(fā)表有關白藜蘆醇防癌活性的報道以來，針對白藜蘆醇生物活性及其作用機制的研究日趨廣泛，對白藜蘆醇的研究逐漸成為了近些年的熱點。

白藜蘆醇 （resveratrol，Res）化學名稱為芪三酚 （3，4，5－trihydroxy－stibene）， 分 子 式 C14H12O3， 分 子 量228.5，屬于非黃酮類多酚化合物［4］。目前已經在21個科、31個屬的72種植物中發(fā)現(xiàn)了白藜蘆醇，如決明、藜蘆、虎杖、葡萄、花生、桑葚、鳳梨等［5］。經研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇有許多藥理和保健作用，如保護心血管、抗腫瘤、免疫調節(jié)、保肝利肝、抗氧化、鎮(zhèn)咳平喘等［6］。目前世界上已經有十余個國家和地區(qū)在開發(fā)白藜蘆醇原料及制劑。在日本，含白藜蘆醇及其苷的植物提取物已作為食品添加劑。在美國，它已作為一種膳食補充劑［7］。然而，白藜蘆醇在運動領域中應用的研究相對較少。本實驗以SD雄性大鼠為研究對象，在建立力竭性游泳運動訓練模型的基礎上，研究白藜蘆醇對大鼠肝臟的影響，進而為白藜蘆醇在運動領域中的應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Sprague－Dawley（SD）大鼠30只，8周齡，體重180±10 g，由四川大學華西醫(yī)學中心實驗動物中心提供。成都體育學院動物實驗室內飼養(yǎng) （室內通風、干燥，室溫18—25℃，相對濕度30%—50%），標準大鼠飼養(yǎng)籠3個，大小為0.5×0.35×0.2 m3，每籠10只動物。電熱暖器4個，溫、濕度計各1個，國家標準嚙齒類動物飼料，溫開水，消毒用高壓鍋1個。動物房安靜、干燥、通風，每天更換清潔飲水，清除糞、尿，清潔籠具底盤。

1.2 主要實驗試劑

（1）白藜蘆醇。純度＞98%，購自成都川大華西康達藥物研究所，為反式白藜蘆醇 （批準文號：衛(wèi)食健字 ［2006］第1012號），使用前用3%二甲基亞砜 （DMSO）溶解并以生理鹽水稀釋至DMSO的濃度為2%。

（2）冰醋酸 （A.R.）。重慶北碚精細化工廠提供。

（3）無水乙醇 （A.R.）。安徽特酒總廠提供。

（4）考馬斯亮藍蛋白測試盒。

（5）丙二醛測試盒。

（6）超氧化物歧化酶測試盒。

（7）總抗氧化能力測試盒。

（8）谷丙轉氨酶測試盒。

以上測試盒均由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 主要實驗設備儀器

（1）德國產全自動生化分析儀Olimpus AU5400。

（2）上海安亭科學儀器廠生產的TGL－16G臺式高速冷凍離心機。

（3）深圳市沙頭角國華儀器廠生產的HH系統(tǒng)恒溫水浴鍋。

（4）中國廣東科龍電器股份有限公司生產的BCD－203A容聲冰箱。

（5）武漢自動化儀表廠生產的TN－100托盤扭力天平。

（6）上海悅豐儀器儀表有限公司生產的AB－S／A分析天平。

（7）德國產R－200D電子秤。

（8）上海第二天平儀器廠生產的 MP－200－1型雙圈牌電子秤。

（9）中國杭州段式制作游泳槽。

（10）上海第三分析儀器廠生產的組織勻漿機。

（11）上海第三分析儀器廠生產的微量移液器。

1.4 實驗方法與分組

1.4.1 動物模型建立

本實驗采用游泳力竭運動動物模型。SD大鼠采用負重的游泳方式，負重重量為體重的3%，泳池水深50 cm，水溫31±1℃，每m2水面5—6只大鼠同時游泳，當大鼠游至連續(xù)3次沒入水底，每次超過10 s，不能自主浮上水面且放在平面無法完成翻正反射，視為力竭［8］。

1.4.2 灌服方法

各組大鼠每天灌服藥液。具體灌胃法為：根據 《醫(yī)學動物實驗方法》，用帶20號注射針頭 （針尖磨鈍）的5 ml針管抽取一定的藥溶液，從大鼠口腔順咽喉食道后壁方向將針頭送入，先推少量藥液，大鼠無異常反應后再將余下部分緩緩推入，灌完藥后讓大鼠在籠中自由活動5分鐘，并觀察有無不良反應。操作熟練準確，未傷及大鼠口腔、咽喉、食管和氣管等器官，無藥液誤入氣管現(xiàn)象出現(xiàn)。對大鼠實施灌胃操作，每日1次，連續(xù)灌服2周。

1.4.3 藥液的配置

白藜蘆醇用3%二甲基亞砜溶解，并用生理鹽水稀釋至濃度分別為1.5 mg／ml、5 mg／ml、10 mg／ml、20 mg／ml、30 mg／ml，溶酶為2%二甲基亞砜。各組大鼠所給溶劑的體積均按10 ml／kg體重計算。

1.4.4 實驗分組

30只大鼠隨機分為3組：安靜對照組10只，不進行游泳運動，灌胃等體積溶酶；運動對照組10只，進行游泳運動，灌胃等體積溶酶；實驗組 （運動＋白藜蘆醇組）10只，進行游泳運動，灌胃100 mg／kgRes。

1.4.5 實驗步驟

各組大鼠每日稱重后，實驗組每天灌胃100 mg／kg Res，安靜對照組和運動對照組分別灌胃相同體積的溶酶，連續(xù)2周。運動對照組和實驗組大鼠于第12、13、14天，分別進行10、20、30分鐘的無負重適應性游泳。于第15天，兩組大鼠稱體重，每只大鼠負荷3%體重，置于水深50 cm、水溫 （31±1）℃的游泳槽中游泳。游泳力竭后即刻進行股動脈取血并迅速取出肝組織，測定血清中谷丙轉氨酶 （ALT）活性和肝臟組織中超氧化物歧化酶 （SOD）活性、總抗氧化能力 （T－AOC）和丙二醛 （MDA）含量。

1.5 指標采集與檢測方法

1.5.1 血清制備

力竭運動后即刻取股動脈血3 ml，室溫靜置30 min后，再以3500 r／min轉速離心20 min，取上清液即血清，測定ALT活性。

1.5.2 組織取樣

上述取血后的大鼠，迅速取其相應部位肝臟0.2 g，剔除結締組織膜，用4℃預冷生理鹽水洗凈，用濾紙吸去水分，加入低溫磷酸鹽緩沖液勻漿，再以8000 r／min轉速離心15 min（在0℃條件下），取上清液，4℃冰箱保存?zhèn)溆?，測定SOD、T－AOC活性和MDA含量。

1.5.3 指標測試方法

指標測試均采用分光光度法，嚴格按照測試盒的操作程序進行測定。

1.6 統(tǒng)計學處理

所有原始數(shù)據均輸入SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行分析處理。每組樣本測得數(shù)據以均數(shù)±標準差 （ˉX±SD）表示，組間的兩兩比較采用單因素方差分析 （One－Way ANOVA），組間差異采用LSD檢驗。顯著性水準取α＝0.05，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著性差異。

2 實驗結果

2.1 大鼠一般情況

各組大鼠均反應良好，活動靈活，進食飲水情況較好，二便正常，毛發(fā)濃密整潔，毛色潔白光亮，體型勻稱，長勢良好。

2.2 白藜蘆醇對力竭游泳大鼠肝臟組織的影響

由表1可知，運動對照組大鼠肝臟組織MDA含量顯著高于安靜對照組 （p＜0.01），實驗組肝臟組織 MDA含量顯著低于運動對照組 （p＜0.01）；運動對照組大鼠肝臟組織SOD活性顯著低于安靜對照組 （p＜0.01），實驗組大鼠肝臟組織SOD活性顯著高于運動對照組 （p＜0.01）；運動對照組大鼠肝臟組織T－AOC水平顯著高于安靜對照組 （p＜0.05），實驗組大鼠肝臟組織T－AOC水平顯著高于運動對照組 （p＜0.01）；運動對照組大鼠血清中ALT水平顯著高于安靜對照組 （p＜0.01），實驗組大鼠血清中ALT水平顯著低于運動對照組 （p＜0.01）。

表1 白藜蘆醇對力竭游泳后大鼠肝臟組織的影響

3 分析與討論

3.1 運動對肝臟組織抗氧化能力及自由基代謝的影響

肝臟是機體內重要的代謝器官，運動能力與肝臟的代謝機能關系密切。在正常生理條件下，肝臟內自由基保持低濃度平衡狀態(tài)。力竭運動作為一種生理應激，使機體肝臟產生的自由基增多［9－11］，而自由基又與一系列病理損傷有關［12］，會直接導致肝臟組織的損傷［13－14］。

3.2 白藜蘆醇對MDA含量的影響

劇烈運動產生的自由基攻擊生物膜，引起脂質過氧化作用，進而生成脂質過氧化物，如醛基 （丙二醛 MDA）、羰基、酮基、羥基等。其中，丙二醛 （MDA）是衡量機體自由基代謝的敏感指標，其含量能客觀地反映機體產生自由基的水平［15］。

本實驗結果顯示，運動對照組大鼠肝臟組織中MDA含量顯著高于安靜對照組，實驗組MDA含量低于運動對照組。其機制可能是力竭運動使機體產生大量自由基，機體內氧化系統(tǒng)與抗氧化防御系統(tǒng)失衡，導致體內自由基的生成大于消除，運動源性自由基堆積，最終導致MDA含量升高。補充白藜蘆醇增強了機體抗氧化能力，促進了運動源性自由基的消除，從而減輕了自由基對細胞脂質成分的氧化損傷作用，保護脂質膜，維持肝細胞的完整性和正常的生理功能。其機制可能是白藜蘆醇能有效地清除超氧陰離子自由基，從而抑制其他多種由它衍生的活性氧產生，同時，白藜蘆醇又可直接清除活性氧自由基，最終導致肝臟組織中MDA含量降低［16］。

3.3 白藜蘆醇對SOD活性的影響

SOD是細胞防御氧自由基的第一道屏障［17］，其主要作用是催化超氧陰離子生成H2O2，阻斷毒性更強的羥氧自由基產生，它在機體的氧化與抗氧化損傷平衡中起著至關重要的作用。關于運動后SOD活性的變化，目前國內外研究報道各異，升高、不變、降低都有，可能與運動強度、運動形式、機體的健康基礎、營養(yǎng)狀態(tài)等多種因素有關。

本實驗結果顯示，運動對照組大鼠肝臟組織SOD活性顯著低于安靜對照組，實驗組大鼠肝臟組織中SOD活性顯著高于運動對照組。這可能是因為力竭性運動后，機體產生的自由基攻擊各種組織細胞，造成細胞結構破壞和 （或）功能下降，抗氧化系統(tǒng)本身也受到了損害，表現(xiàn)為抗氧化酶活性下降［18］；白藜蘆醇可以提高肝臟組織中抗氧化酶活性，減輕自由基對肝臟組織造成的脂質過氧化損傷，保護肝細胞膜的完整性，使肝臟的生理機能正常運行，從而提高運動能力，延緩疲勞的發(fā)生。

3.4 白藜蘆醇對T－AOC水平的影響

機體總抗氧化能力 （Total Antioxide Capacity，TAOC）是反映機體總抗氧化、清除自由基的能力，由酶促和非酶促抗氧化防御體系共同組成。人體內抗氧化酶合成減少或利用非酶性抗氧化物質能力減弱和 （或）由于活性氧（ROS）生成過多超過了氧化／抗氧化平衡狀態(tài)，T－AOC水平均顯示降低。

本實驗結果顯示，大鼠力竭運動后肝臟組織中T－AOC水平顯著升高，補充白藜蘆醇能使肝臟組織T－AOC水平進一步升高。其機制可能是力竭運動導致自由基增加，機體啟動自由基清除機制，提高抗氧化酶的活性以抵抗自由基的作用；白藜蘆醇具有很強的抗肝組織自由基代謝的作用，它可以進一步提高肝臟組織總的抗氧化能力。

3.5 白藜蘆醇對ALT水平的影響

谷丙轉氨酶 （ALT），催化L－丙氨酸與α－酮戊二酸之間轉氨基，產生丙酮酸及L－Glu，其分子量約為101 000，主要存在肝組織中，血清中含量最低。血清中ALT活性升高是肝細胞受損的敏感指標。力竭運動產生的大量自由基破壞了肝細胞膜的完整性，使細胞膜通透性增大，從而使ALT穿過肝細胞膜進入血液，最終引起血清ALT大量增加。

本實驗結果顯示，運動對照組大鼠血清ALT水平顯著高于安靜對照組，服用白藜蘆醇組，血清ALT水平低于運動對照組。說明在力竭運動中，大量自由基導致肝細胞膜破壞，而白藜蘆醇具有保護肝組織細胞膜的作用。其機制可能與白藜蘆醇能夠抗脂質過氧化，使肝細胞膜受自由基損傷減輕，維持膜系統(tǒng)完整性有關。3.6 白藜蘆醇對運動后肝臟保護作用的機制探討

肝臟是機體內以代謝為主的器官，具有抗氧化、儲存肝糖等功能，在機體中發(fā)揮著重要作用。力竭運動易導致肝臟組織損傷，其機制可能是劇烈運動引起自由基大量增加，抗氧化酶系統(tǒng)不足以清除自由基，從而造成自由基堆積，過多的自由基引起超氧化反應，破壞肝細胞膜的脂質雙結構，使膜的孔隙擴大，通透性增大，內質網膜、線粒體膜等膜系統(tǒng)結構和功能受損，導致細胞廣泛性損害，使細胞結構受損、功能下降。

本實驗證明，力竭運動使肝臟組織內自由基生成增多，MDA含量升高，導致肝細胞膜損傷或破裂，細胞膜通透性增加，使得細胞內ALT外泄，引起血清中ALT水平升高。本實驗亦證明，白藜蘆醇可降低運動后肝臟組織中MDA含量，與其直接清除氧自由基和活性氧有關；同時增強肝臟組織SOD和T－AOC水平，提高肝臟組織清除自由基的能力；減少自由基對肝臟組織的攻擊，保護細胞膜結構的完整性，使細胞內ALT不易外泄，從而降低血清中ALT水平。

綜上所述，白藜蘆醇對力竭運動所致大鼠肝損傷具有較好的保護作用，其機制與抗脂質過氧化損傷密切相關。

4 總結與展望

白藜蘆醇及其制品在醫(yī)藥、美容、保健、食品等諸多領域的研究與應用已取得豐碩的成果。2000年10月在美國拉斯維加斯舉行的國際健康食物增補劑會議上，白藜蘆醇被列為健康食物增補劑。白藜蘆醇有強大的抗氧化作用、免疫調節(jié)作用和神經保護作用?！禖ell》雜志上一項新的研究顯示，白藜蘆醇還能夠改善小鼠肌肉的耐力。基于白藜蘆醇上述多種生物學作用，加之白藜蘆醇資源豐富，提取與加工技術日益成熟，將其開發(fā)為運動營養(yǎng)補劑具有非常廣闊的前景。

本研究顯示，力竭運動后，機體內源性自由基水平迅速升高，造成肝臟組織損傷。補充白藜蘆醇能增強肝臟組織抗氧化能力，起到保護肝臟的作用。這一結果為白藜蘆醇應用于運動領域提供了一定的實驗依據和參考，但是還有許多問題需要進一步的探討和實驗研究，例如：不同的用藥時間、給藥方式和運動方式對白藜蘆醇的作用效果是否有差異，白藜蘆醇的其他生理功用應用于運動領域是否也有顯著的效果，男女運動員的有效劑量是否一致，白藜蘆醇的人體實驗還有待開展等。相信不久的將來，白藜蘆醇將會作為一種有效的營養(yǎng)補劑應用于運動領域，為提高運動成績、預防運動損傷等發(fā)揮獨特的作用。

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Research on the Resveratrol’s Proctection Function on the Rats’Liver After the Exhaustive Swimming

HOU Yuan－yuan1，LIU Li－ping1，WANG Jian－bin2，LI Jing－chun3，SUN Zhi－jia1

（1.Hebei Institute of Physical Education，Shijiazhuang 050041，China；2.Xingtai Medical College，Xingtai 054000，China；3.Hebei Research Institute of Sports Science，Shijiazhuang 050000，China）

Purpose：This paper discussed the protective function of resveratrol on liver tissue，and thus provided the experimental basis for resveratrol used in the sports field.Method：The study selected 30 male SD rats and randomly divided them into 3 groups.Each group had 10 rats and they were quiet control group，exercise control group and experimental group（motion＋100 mg／kg Res）.After daily weighing of the rats，the experimental group was intragastric administration 100 mg／kg Res one time each day，and the two other groups were filled the same volume of enzyme respectively for 2 consecutive weeks.On the 15th day，we conducted exhaustive swimming in the exercise control group and experimental group，and instantly measured ALT activity in serum and SOD activity，T－AOC and MDA content in the liver tissue.Results：The MDA content of the rats’liver tissue in the exercise control group is significantly higher than the quiet control group（p＜0.01），while the MDA content of the experimental group is significantly lower than the control group（p＜0.01）.The SOD activity of the rats’liver tissue in the control group is significantly lower than the quiet control group（p＜0.01），while in the experimental group the SOD activity of the liver tissue is substantially higher than the exercise control group（p＜0.01）.In the exercise control group the T－AOC level of the rats’liver tissue is significantly higher than the quiet control group（p＜0.05），while in the experimental goup the T－AOC level of the liver is substantially higher than the exercise control group（p＜0.01）.In the exercise control group the ALT level in the rats’serum is substantially higher than the quiet control group（p＜0.01），while in the experimental group the ALT level is significantly lower than the exercise control group（p＜0.01）.Conclusion：After the exhaustive exercise，the endogenous free radical level of the body rises rapidly，causing liver injury.The supplement of resveratrol can enhance liver tissue antioxidant capacity and protect the liver.

resveratrol；exhaustive swimming；liver；protection function

G807.4

A

1008－3596（2012）05－0072－05

2012－04－20

項目項目：2011年河北省高校自然科學指導項目 （Z2011213）

侯媛媛 （1981－），女，河北成安人，講師，碩士，研究方向為運動醫(yī)學。