熱帶爪蟾胚胎在水質(zhì)監(jiān)測中的應用

薛銀剛，蔡煥興，徐東炯，袁 靜，施華宏，唐松林

(1.常州市環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇省環(huán)境保護水環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室，江蘇 常州 213001;2.華東師范大學，上海 200062;3.江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南京 210036)

·監(jiān)測技術·

熱帶爪蟾胚胎在水質(zhì)監(jiān)測中的應用

薛銀剛1，蔡煥興1，徐東炯1，袁 靜2，施華宏2，唐松林3

(1.常州市環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇省環(huán)境保護水環(huán)境生物監(jiān)測重點實驗室，江蘇 常州 213001;2.華東師范大學，上海 200062;3.江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心，江蘇 南京 210036)

分析了熱帶爪蟾胚胎用于水質(zhì)監(jiān)測的理論基礎，綜述了其在環(huán)境科學中的應用前景，總結(jié)評價了熱帶爪蟾胚胎用于水質(zhì)監(jiān)測的方法及應用實例，并討論了其用于水質(zhì)評價目前存在的問題。熱帶爪蟾是一種良好的模式生物，需要對其加強實際應用研究。

熱帶爪蟾;胚胎;致畸;水質(zhì)監(jiān)測

0 引言

近年來，由于人類活動的影響，大量的各類污染物排放到水體中。這些排放到水環(huán)境中的污染物可能會在生物體內(nèi)富集、放大，從而導致對食物鏈高營養(yǎng)級野生動物的嚴重危害［1］;也可以通過暴露(大氣、水等)與食品的途徑進入人體，進而對水體環(huán)境、水生動物和人體健康造成極大威脅［2］。這些環(huán)境問題引起了研究者對水質(zhì)監(jiān)測的高度重視。然而，中國水質(zhì)監(jiān)測的標準方法主要偏向于常規(guī)的理化檢測，這已經(jīng)不足以說明和反映水環(huán)境的毒性效應。隨著生態(tài)學、生物學及生物技術等相關學科的發(fā)展，水質(zhì)的生物監(jiān)測技術也日益得到重視。生物監(jiān)測通過生物對環(huán)境的反應，顯示出環(huán)境污染對生物的影響，將污染物的濃度及其引起的生物效應聯(lián)系起來，能夠更真實、準確地反映污染物的作用機理及實際毒性效應，為環(huán)境監(jiān)測和管理提供更為有效的信息。

1 爪蟾胚胎致畸實驗簡介

自20世紀90年代初，國外就開始運用非洲爪蟾胚胎開展污染物的發(fā)育毒性檢測，其方法就是將發(fā)育期處于NF 8- 11階段的爪蟾胚胎置于受試液中暴露4 d，通過檢測胚胎死亡率、畸形率和致畸指數(shù)等指標來評價化學品的發(fā)育毒性，這一方法被稱為非洲爪蟾胚胎致畸實驗(FETAX)［3］。非洲爪蟾(Xenopus laevis)是進行FETAX的實驗動物，作為發(fā)育生物學中最重要的模式動物，近年來在生態(tài)毒理學中也被廣泛運用，主要用于早期胚胎發(fā)育和細胞生物學的研究。

近十年來各國多個實驗室的研究證實，F(xiàn)ETAX作為一個可供選擇的發(fā)育毒性篩選試驗非常具有前途，它比使用傳統(tǒng)的哺乳動物作為發(fā)育毒性研究的受試生物更能節(jié)約動物數(shù)量、時間和資金［4］。

2 熱帶爪蟾胚胎在環(huán)境科學中的應用前景

作為非洲爪蟾的近親，熱帶爪蟾(X.tropicalis)具有個體更小、生長周期更短(3～6個月)、產(chǎn)卵量更大(2 000～3 000個)和基因組結(jié)構(gòu)(2倍體)更簡單、胚胎發(fā)育更快等優(yōu)點。因此，熱帶爪蟾比非洲爪蟾更適合作為模式生物進行系列研究［5-7］。已有研究表明，不同的污染物導致熱帶爪蟾胚胎畸形現(xiàn)象也不一樣，而且某些污染物能夠?qū)е伦概咛ギa(chǎn)生獨特的畸形表型，如采用環(huán)境濃度三丁基錫(50～400 ng·L-1TBTCl)對熱帶爪蟾胚胎進行24，36和48 h暴露能夠?qū)е屡咛パ劬Ξ惓?、泄殖腔突出和鰭變窄等多種畸形現(xiàn)象［8］。這表明運用熱帶爪蟾胚胎進行特定污染物致畸機制的研究將具有較大的潛力。其中，胚胎畸形的表觀特征可以作為研究污染物致畸機制的標志物。

3 熱帶爪蟾胚胎用于水質(zhì)監(jiān)測的方法

3.1 樣品的采集與制備

對各采樣點進行樣品的采集，采集后用棕色瓶分裝并貼好標簽，4℃保存待用。在采樣過程中對采樣點的常規(guī)理化數(shù)據(jù)(溫度、pH、溶解氧、氨、采樣點經(jīng)緯度、電導率等)進行測量。

3.2 實驗設計

實驗的設計在FETAX實驗的基礎上進行改進。采用人工注射HCG的方法誘導產(chǎn)卵，從產(chǎn)卵較好的3對蛙的胚胎中，挑選出達到NF 10- 11階段且發(fā)育正常的胚胎進行實驗(表1)。

表1 熱帶爪蟾胚胎的水質(zhì)監(jiān)測方法

續(xù)表1

3.3 樣品的觀測與分析

將存活胚胎用100 mg/L MS- 222麻醉處理后固定于4%的甲醛溶液中，取出經(jīng)固定的胚胎，在Nikon解剖鏡下觀察胚胎的發(fā)育狀況，用 Nikon DS-SM型顯微照相系統(tǒng)進行拍照，并統(tǒng)計孵化率、存活率、體長和畸形率等指標。(1)孵化率:24 h后孵化胚胎個數(shù)所占最初放入胚胎個數(shù)百分比;(2)存活率:48 h后存活胚胎個數(shù)所占孵化出的個數(shù)百分比;(3)體長:胚胎頭部至尾尖的水平距離;(4)畸形率:48 h后胚胎畸形個數(shù)所占存活個數(shù)百分比。通過對這些指標的統(tǒng)計分析來綜合評價環(huán)境樣品對胚胎早期生長發(fā)育的影響，從而反映水質(zhì)的情況。

同時，通過對胚胎的暴露實驗觀測爪蟾胚胎的表觀畸形類型及表型特征變化，探討可能的致畸機制，從而推測可能的污染物類型。暴露48 h后與對照組相比，環(huán)境樣品能夠誘導熱帶爪蟾胚胎出現(xiàn)多種畸形現(xiàn)象，總體可以分為體形和體色兩大類。在體形變化中，根據(jù)出現(xiàn)畸形的部位可以分為5種類別，即顱面、眼睛、嘴巴、腸道、尾巴和體色。每個部位又有多種不同特征的畸形類型，其中主要表現(xiàn)為眼睛突出、泄殖腔膨大、尾巴下彎、鰭變窄和皮膚色素減少等(圖1)。

3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用SPSS 16.0進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。以每孔中的胚胎為一個平行樣，數(shù)據(jù)以平均值±標準差(S.D.)表示，n=4。用Tukey-test進行分析。

圖1 環(huán)境樣品引起的熱帶爪蟾胚胎畸形類型

4 熱帶爪蟾胚胎用于水質(zhì)監(jiān)測的應用實例

近年來，國內(nèi)外主要運用斑馬魚和非洲爪蟾進行水體中重金屬毒性、有機污染物毒性檢測和綜合毒性檢測等。Hoke等研究表明，F(xiàn)ETAX已經(jīng)成為水環(huán)境監(jiān)測的常規(guī)方法，可以增加其他淡水水生生物的檢測性。

Song和Fort等運用熱帶爪蟾胚胎和非洲爪蟾胚胎的實驗結(jié)果表明，兩個物種對化合物的致畸能力相當，而且畸形的綜合表征也類似，熱帶爪蟾可以代替非洲爪蟾進行FETAX實驗［9，10］。已有的研究表明，熱帶爪蟾胚胎可以不同程度地應用于重金屬、農(nóng)藥、藥物等有機污染物和綜合污染物的毒性檢測中，且主要用于污染物的室內(nèi)研究［11-13］。

目前，國內(nèi)外用于評價水質(zhì)的方法主要包括對水樣和底泥兩類環(huán)境樣品的各類指標進行檢測評估。實驗室運用熱帶爪蟾胚胎檢測了溫州黑臭河道的水樣和底泥樣的生態(tài)毒性。結(jié)果表明:不同采樣點的孵化率、存活率、體長和畸形率較對照組表現(xiàn)出了不同的差異性，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結(jié)果說明溫州市兩條典型的黑臭河道底泥對爪蟾胚胎的發(fā)育均有不同程度的影響，表現(xiàn)出一定的生態(tài)毒性，同時，運用爪蟾胚胎可以有效地檢測底泥的毒性效應，而且對不同河流和站點的毒性評價具有較好的區(qū)分度。實驗室對長江口南匯杭州灣的底泥也進行了毒性測試，結(jié)果表明，人為活動影響越大的區(qū)域，底泥樣對胚胎的發(fā)育毒性影響越嚴重，展現(xiàn)出了很好的區(qū)分度。

5 問題與展望

將熱帶爪蟾胚胎應用于水質(zhì)的生物監(jiān)測還處于起步階段，盡管其所需要的時間短、經(jīng)濟成本低，暴露48 h就能夠方便地獲得各種評價指標，實驗操作簡單易行，但在環(huán)境樣品的檢測中發(fā)現(xiàn)，需要將不同采樣點的水質(zhì)狀況更好地區(qū)分出來僅參照現(xiàn)有的指標尚有一定的局限性，因此，必須對實驗方案進一步優(yōu)化，如適當延長實驗時間和對畸形指標細化、量化。其中，在指標的量化中，可以考慮將各個類型的畸形程度劃分為正常、輕微、中等和嚴重4個等級。

綜上所述，熱帶爪蟾作為一種評價水質(zhì)的生物已得到越來越多的認可。雖然目前在理論和應用方面還存在一定的問題，但隨著熱帶爪蟾模式生物在各領域研究的發(fā)展，其在水質(zhì)監(jiān)測中的應用會更加深入廣泛。

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Application ofXenopus TropicalisEmbryo in Water Quality Monitoring

XUE Yin-gang1，CAI Huan-xing1，XU Dong-jiong1，YUAN Jing2，SHI Hua-hong2，TANG Song-lin3
(1.Key Laboratory of Environmental Protection of Water Environment Biological Monitoring of Jiangsu Province，Changzhou Environmental Monitoring Center，Changzhou，Jiangsu 213001，China;2.East China Normal University，Shanghai，200062，China;3.Jiangsu Province Environmental Monitoring center，Nanjing，Jiangsu 210036，China)

The theoretic foundation ofXenopus tropicalisapplied to water quality monitoring was discussed.Subsequently，the application prospect ofX.tropicalis in the field of environmental science was reviewed.We also summarized the method usingXenopus tropicalisembryo to monitor water quality and introduced some application examples.Finally，discussed some problems on the application ofX.tropicalisembryo in evaluating water quality.In all，X.tropicalisis a good model animal species for evaluating water quality.Therefore，studies on practical application ofX.tropicalisshould be enhanced in future.

Xenopus tropicalis;embryos;water quality monitoring

X835

A

1674- 6732(2012)04- 0020- 04

10.3969/j.issn.1674- 6732.2012.04.005

2011- 12- 20

江蘇省環(huán)境監(jiān)測科研基金項目(1106)。

薛銀剛(1981—)，男，工程師，博士，從事生物監(jiān)測與環(huán)境毒理學工作。