用大孔吸附樹脂分離純化香薷總黃酮

陳學(xué)澤，甘正偉

(中南林業(yè)科技大學(xué) 理學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

用大孔吸附樹脂分離純化香薷總黃酮

陳學(xué)澤，甘正偉

(中南林業(yè)科技大學(xué) 理學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

以湖南香薷為原料，選擇最佳大孔吸附樹脂對(duì)其總黃酮進(jìn)行分離純化。實(shí)驗(yàn)分別采用了靜態(tài)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)對(duì)總黃酮收率、純度等指標(biāo)進(jìn)行考察，綜合評(píng)定。結(jié)果表明，D301型大孔吸附樹脂為純化香薷總黃酮的最佳樹脂，靜態(tài)飽和吸附量為104.72 mg·g-1，洗脫液為乙醇濃度為70%，提取液的pH為4或5，洗脫溫度為30 ℃。靜態(tài)吸附在120 min時(shí)達(dá)到平衡。動(dòng)態(tài)吸附-洗脫實(shí)驗(yàn)表明，最佳工藝參數(shù)為：雜質(zhì)用水量為4 VB；洗脫劑為70%乙醇，其用量為4 VB?？傸S酮回收率和純度均在80%以上。

香薷；總黃酮；分離；純化

大孔吸附樹脂是近三十年來才發(fā)展起來的一類有機(jī)高聚物吸附劑[1-2]，它不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑。1970年代末開始將其應(yīng)用于中草藥成分的提取分離。該技術(shù)是繼離子交換樹脂后的分離新技術(shù)之一。

香薷為唇形科植物,根據(jù)理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)鑒定結(jié)構(gòu) ,主要有效成分為:黃芩素-7-甲醚(negletein，Ⅰ)、槲皮素( quercetin，Ⅲ)、金圣草黃素( chrysoeri2ol, Ⅳ)、木犀草素( luteolin，Ⅱ)和芹菜素(apigenin，Ⅴ)[3]。黃酮類物質(zhì)具有抗防衰老、抗菌、抗癌等功能，因而被廣泛研究[4-6]。筆者尚未見香薷總黃酮的分離純化報(bào)道。實(shí)驗(yàn)對(duì)D301等5種大孔吸附樹脂進(jìn)行篩選，并對(duì)香薷總黃酮分離純化進(jìn)行深入探索。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

香薷全草(產(chǎn)自湖南)，Na(NO2)(分析純)，NaOH(分析純)，Al(NO3)3(分析純)，大孔吸附樹脂 AB-8、D301、HFD-300、NKA-9和 S-8型， 無水乙醇等。

1.2 主要設(shè)備

紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)，電子天平(PB203-N)，恒溫水浴鍋，攪拌器，抽水泵，移液管，玻璃杯等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 香薷黃酮化合物的提取方法

香薷干燥全草粉碎過篩，用70%的乙醇在70℃恒溫水浴中攪拌回流1 h，后采用布氏漏斗抽濾，得到香薷乙醇的提取液，最后將提取液濃縮濃度至 5.25 mg·mL-1,以備使用。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，配制一系列不同濃度的溶液，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉比色法，測(cè)定OD510值，用最小二乘法作線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程式：c=1.036 0A-0.001 51，R=0.997 4。

1.3.3 大孔樹脂的篩選[7-8]

分別稱取一定量的AB-8型、D301型、HFD-300型、S-8型、NKA-9型樹脂，置入4～5 BV的95%乙醇中浸洗，24 h后加入適量的蒸餾水，如仍有白色渾濁現(xiàn)象，反復(fù)浸洗，至無白色渾濁現(xiàn)象后用蒸餾水反復(fù)洗滌，至上液體澄清無味。用4 BV的2 mol·L-1NaOH浸泡12 h，用蒸餾水洗至中性，再加入4 BV的3.3 mol·L-1HCL浸泡12 h，再用蒸餾水洗至中性。等自然干燥后，分別準(zhǔn)確稱取各型樹脂1 g，分別轉(zhuǎn)入50 mL三角燒瓶中，加入20 mL的香薷黃酮提取液, 在常溫下置于振蕩器上間隔振蕩2 h,后靜置20 h,使其達(dá)到飽和吸附。吸取上層清液測(cè)定OD510值，計(jì)算總黃酮濃度和飽和吸附量：

飽和吸附量=[(初始濃度-吸附后濃度)×吸附液體積]/樹脂量(mg·g-1干樹脂)。

1.3.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)洗脫率的影響

準(zhǔn)確稱取D301干樹脂7份(1 g)，分別轉(zhuǎn)入50 mL三角燒瓶，加入20 mL的黃酮提取液，在常溫下置于振蕩器上間隔振蕩2 h,靜置20 h, 使其達(dá)到飽和吸附，分離出飽和樹脂，再用吹風(fēng)機(jī)吹吸干其表面，分別轉(zhuǎn)入干凈的50 mL三角燒瓶，加入體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇20 m:，再置于電動(dòng)振動(dòng)器上間隔振蕩2 h，測(cè)定OD510值，計(jì)算洗脫液濃度和洗脫率：

洗脫率=[洗脫液濃度×洗脫液體積]/飽和吸

附量×100%)。

1.3.5 pH對(duì)D301型樹脂對(duì)香薷總黃酮靜態(tài)吸附的影響

準(zhǔn)確稱取D301干樹脂各8份(1 g)，分別轉(zhuǎn)入50 mL三角燒瓶，加入pH分別為3、4、5、6、7、8、9、10的提取液20 mL, 在常溫下置于振蕩器上間隔振蕩2 h,靜置20 h,使其吸附飽和，吸取上層清液，測(cè)定OD510值，計(jì)算溶液濃度和吸附量。

1.3.6 吸附溫度對(duì)D301樹脂吸附香薷總黃酮靜態(tài)吸附的影響

準(zhǔn)確稱取處理好的D301干樹脂各5份(1 g)，分別轉(zhuǎn)入50 m:三角燒瓶，加入20 mL的提取液,分別在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃溫度下間隔振蕩2 h,后靜置20 h,使其吸附飽和，再吸取上層清液，測(cè)定OD510值，計(jì)算溶液濃度和吸附量。

1.3.7 靜態(tài)吸附時(shí)間對(duì)D301樹脂吸附香薷總黃酮的影響

準(zhǔn)確稱取D301干樹脂9份(1 g)，分別轉(zhuǎn)入50 mL三角燒瓶，再加入20 mL的提取液, 在常溫下置于振蕩器上間隔振蕩，分別于20、40、60、80、100、120 min時(shí)吸取上層清液，測(cè)定OD510值，計(jì)算溶液濃度和吸附量。

1.3.8 動(dòng)態(tài)吸附-洗脫性能研究

分別稱取已處理好的D301型干樹脂100 g和20 g濕法裝入2.5 cm×30 cm色譜柱中，香薷提取液400 m:(5.25 mg·ml-1)以每小時(shí)2 BV的流速上柱，用蒸餾水以3～5 mL· min-1速度洗滌至無色，再以2 BV的70%乙醇以3 mL·min-1的洗脫速度洗脫，測(cè)定總黃酮濃度，再將其減壓濃縮，干燥，稱重。計(jì)算吸附-洗脫相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.3.9 沖洗雜質(zhì)用水量對(duì)D301樹脂動(dòng)態(tài)吸附香薷總黃酮的影響

準(zhǔn)確稱取已經(jīng)預(yù)先處理的D301干樹脂10 g,采用濕法裝入1.5 cm×20 cm的色譜柱中，以濃度為5.25 mg·mL-1的香薷提取液60 mL ,以大約2 BV·h-1的流速上柱 ,過完柱子后 ,分別以2、4、6 BV蒸餾水過柱沖洗，其流速在3～5 mL·min-1之間，之后用4 BV的70%乙醇以3 mL·min-1速度進(jìn)行洗脫，收集洗脫液,測(cè)其吸光度,計(jì)算出相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.3.10 洗脫劑用量對(duì)D301樹脂動(dòng)態(tài)吸附香薷總黃酮的影響。

準(zhǔn)確稱取已經(jīng)處理好的D301吸附樹脂10 g ,裝入1.5 cm×20 cm的層析柱中 ,濕法裝入香薷提取物水溶液 60 mL ,以大約2 BV·h-1流速上柱 ,以4 BV蒸餾水洗完全后 ,分別以2、4、6 BV的70%的乙醇洗脫，收集洗脫液,測(cè)其吸光度,計(jì)算出相關(guān)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂篩選結(jié)果

不同吸附樹脂對(duì)香薷總黃酮的靜態(tài)吸附量，結(jié)果如表所示：

表1 五種吸附樹脂靜態(tài)吸附量測(cè)定結(jié)果Table 1 The static adsorption capacity of five types of macroreticular adsorbents

從表可知，5種吸附樹脂對(duì)香薷總黃酮的靜態(tài)吸附量在100 mg左右，其中D301型最高，表現(xiàn)出最佳的綜合性能。

2.2 乙醇濃度對(duì)洗脫率的影響

表2表明,洗脫率隨乙醇濃度增大而增大，當(dāng)乙醇體積達(dá)到70%～90%時(shí)，洗脫率變化不明顯?？紤]到節(jié)約成本及生產(chǎn)安全上的方便,實(shí)驗(yàn)采用70%乙醇為洗脫劑最適宜。

表2 乙醇濃度對(duì)D301型樹脂的洗脫率的影響Table 2 Effects of ethanol concentrations on elution rate of D301 resin

2.3 pH對(duì)D301吸附量的影響

表3表明:上樣液的pH 4～5時(shí)吸附效果最好。這主要是因?yàn)辄S酮類化合物具有酚羥基，偏顯弱酸性，當(dāng)pH過大時(shí)，黃酮化合物具有離子化趨向，從而不易被吸附，因此上樣液pH選擇4～5最合適。

表3 pH對(duì)D301飽和吸附量的影響Table 3 Effects of pH on saturated adsorption capacity of D301 resin

2.4 溫度對(duì)D301飽和吸附量的影響

表4表明：吸附溫度對(duì)D301飽和吸附量的影響不大，對(duì)香薷總黃酮的吸附都在100 mg以上，考慮到能量損耗和實(shí)驗(yàn)方便，本實(shí)驗(yàn)選溫為30 ℃為宜。

表4 溫度對(duì)D301飽和吸附量的影響Table 4 Effects of temperature on saturated adsorption capacity of D301 resin

2.5 靜態(tài)吸附時(shí)間對(duì)D301樹脂對(duì)吸附量的影響

由圖1可知，D301型吸附樹脂對(duì)香薷總黃酮化合物的靜態(tài)吸附在120 min左右達(dá)到平衡。

圖1 吸附時(shí)間對(duì)D301樹脂吸附量的影響Fig. 1 Effect of adsorption time on amount of amount of D301 resin

2.6 動(dòng)態(tài)飽和吸附-洗脫性能的研究

D301型樹脂動(dòng)態(tài)飽和吸附-洗脫的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

2.7 沖洗雜質(zhì)用水量對(duì)D301樹脂動(dòng)態(tài)吸附-洗脫影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果

沖洗雜質(zhì)用水量對(duì)D301型樹脂對(duì)總黃酮收率的影響并不明顯(見表6),總黃酮純度變化不大。為了縮短洗脫時(shí)間,節(jié)約洗脫用水，選擇4 BV的蒸餾水洗脫用量最適宜。

表5 D301型樹脂動(dòng)態(tài)飽和吸附-洗脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Dynamic adsorption-elution capacity by D301 type macroreticular adsorbent

表6 沖洗雜質(zhì)用水量對(duì)D301樹脂動(dòng)態(tài)吸附香薷總黃酮的影響Table 6 Effects of water amount used in impurities washing on total flavone in Chinese Mosla Herb by D301 resin dynamic absorption

2.8 洗脫劑用量對(duì)D301樹脂動(dòng)態(tài)吸附-洗脫影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

洗脫劑用量對(duì)D301型樹脂對(duì)總黃酮收率和純度的影響均不明顯(見表7),考慮到洗脫劑用量過多增加了洗脫時(shí)間，會(huì)造成浪費(fèi),也延長(zhǎng)生產(chǎn)周期,故以4 BV 的70 %乙醇洗脫最合適。

表7 洗脫劑用量對(duì)D301樹脂動(dòng)態(tài)吸附香薷總黃酮的影響Table 7 Effects of amount of eluent on amount of total flavone in Chinese Mosla Herb by D301 resin dynamic absorption

3 結(jié)論與討論

(1)實(shí)驗(yàn)表明，D301型大孔吸附樹脂是分離純化香薷總黃酮的優(yōu)良樹脂，其靜態(tài)吸附量達(dá)到104.72 mg·g-1；該樹脂吸附性能良好，容易解吸附，有較好的綜合分離純化能力。

(2)靜態(tài)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)態(tài)實(shí)驗(yàn)中，D301型樹脂對(duì)香薷總黃酮收率、純度等指標(biāo)的考察表明：乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到70%時(shí)，洗脫率上升趨勢(shì)平緩。由于乙醇濃度高易揮發(fā)，選用70%的體積分?jǐn)?shù)即可。提取液的pH 4～5時(shí)，飽和吸附量最大，說明提取液的pH值平偏酸性有利于樹脂吸附。提取溫度對(duì)靜態(tài)吸附的影響不明顯，因此實(shí)驗(yàn)選溫在30 ℃為宜。D301型樹脂對(duì)總黃酮的靜態(tài)吸附在120 min左右已達(dá)到平衡。

(3) 通過動(dòng)態(tài)吸附-洗脫試驗(yàn)的研究，發(fā)現(xiàn)沖洗雜質(zhì)用水量對(duì)D301型樹脂對(duì)總黃酮收率和總黃酮純度影響不大，洗脫劑用量對(duì)D301型樹脂對(duì)總黃酮收率和純度的影響也不明顯,從節(jié)約用料用水和生產(chǎn)周期考慮, 以4 BV的蒸餾水洗脫，以4 BV的70%乙醇洗脫最合適。

[1] 馬振山.大孔吸附樹脂在藥學(xué)領(lǐng)域中的研究應(yīng)用[J].中成藥,1997,19(12):40-41.

[2] 朱 浩,侯世祥,孫毅毅,等.大孔吸附樹脂吸附純化不同中藥有效部位特性研究[J].中國(guó)中藥雜志,1998,23(10):607.

[3] 胡浩武,謝曉鳴.江香薷黃酮類化學(xué)成分研究[J].中藥材,2010,33(2):218-219.

[4] 倪 亮,石偉勇.海州香薷黃酮分布及其對(duì)植物病原真菌抑制效果的研究[J].科技通報(bào),2010,26(4):546-549.

[5] 朱 華,梁東艷,廖月葵.總黃酮化合物藥理作用研究進(jìn)展[J].廣西中醫(yī)藥,2003,26(3):3-5.

[6] 宣以巍,劉 英,江 萍,等.柑橘類黃酮的生理活性及其研究現(xiàn)狀[J].科技通報(bào), 2008,24(4):494-497.

[7] 元英進(jìn),劉明言,董岸杰.中藥現(xiàn)代化生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:93.

[8] 韓 麗,謝秀瓊,周淑芳,等.實(shí)用中藥制劑新技術(shù)[M ].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:167.

Separation and purification of total flavonoids by macroporous adsorption resin from Chinese Mosla Herb

CHEN Xue-ze, GAN Zheng-wei
(School of Sciences, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004,Hunan,China)

To establish a technical process for the separation and purification of total flavones from Chinese Mosla Herb, the total flavone in Chinese Mosla Herb were separated and purified by macroporous adsorption resin. The purity and yield of flavonoids were eхamined by static and dynamic eхperiments. The results show that D301type resin was the best resin for separating and purifying flavonoids from Chinese Mosla Herb. The static saturated adsorption capacity was 104.72 mg·g-1, the eluant was 70% alcohol, the pH value of the sample was 4～ 5， the temperature was 30 ℃ , Static adsorption reached a balance in about 120 minutes. The dynamic adsorption-dissolve eхperiments indicated the optimum conditions were as follows: the volume of the water was 4VB, the volume of 70% of ethanol was 4VB. The recovery and the purity of flavonoids were both more than 80%.

Chinese Mosla Herb(Elsholtzia haichowensis)；total flavonoids; separation；purification

S789.2

A

1673-923(2012)02-0105-04

2011-09-12

陳學(xué)澤(1954 —)，男，湖南永州人，教授，博士，主要從事天然有機(jī)物的分離和分析方法的研究；E-mail：chenхueze2003@163.com ；甘正偉(1985—)，男，碩士研究生；E-mail：zhenli1985@126.com

[本文編校：文鳳鳴]