殼聚糖納米微粒制備條件的優(yōu)化及其應(yīng)用

王薇薇 ，何 鋼 ，b，王 瓊

(中南林業(yè)科技大學(xué) a.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；b.生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

殼聚糖納米微粒制備條件的優(yōu)化及其應(yīng)用

王薇薇a，何 鋼a，b，王 瓊a

(中南林業(yè)科技大學(xué) a.生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院；b.生物環(huán)境科學(xué)與技術(shù)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

采用離子凝膠法制備了殼聚糖納米微粒懸浮液。以微粒的平均粒徑，分散度，產(chǎn)量作為參考指標(biāo)，對(duì)影響殼聚糖納米微粒制備的主要因素進(jìn)行進(jìn)行了單因素和正交實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：其制備的最佳組合是殼聚糖(CTS)濃度：1.0 g/L、三聚磷酸鈉(TPP)：1.5%、攪拌速度為950 r/min; 最佳條件制備的CTS納米微粒的平均粒徑是300 nm，重復(fù)性好，符合本研究的條件要求。最后,對(duì)本工藝制備的殼聚糖懸浮液應(yīng)用于制備緩釋肥外包膜做了初步研究。

殼聚糖；納米微粒；緩釋肥；制備條件；優(yōu)化

殼聚糖是甲殼素脫乙酰得到的天然多糖中惟一的帶正電荷的堿性多糖，無(wú)毒、無(wú)刺激性、無(wú)致敏性、無(wú)致突變作用，具有良好的生物相容性和生物降解性[1]。不溶于普通有機(jī)溶劑，在堿液中穩(wěn)定，有很強(qiáng)的親水性。在稀酸性溶液中能夠膨脹并形成凝膠，可制成各種緩釋和控釋制劑[2]。殼聚糖是一種成膜性很好的天然高分子物質(zhì)，其分子之間的交聯(lián)形成了空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，易成膜，形成的膜拉伸強(qiáng)度大、韌性好、耐堿和耐有機(jī)溶劑，因此殼聚糖可作為一種優(yōu)良膜材料，可以制成各種各樣的膜，如可食用膜和生物可降解包裝膜、分離濾膜、醫(yī)療用膜等[3-4]。

緩釋肥料(又稱控制釋放肥料)，是指某種肥的表面包涂半透性或不透水性物質(zhì)或改變他們的化學(xué)成分而使其中有效養(yǎng)分緩慢釋放，分包膜肥料和合成緩釋肥料[5]。董炎明[7]采用物理和化學(xué)相結(jié)合的處理方法制備殼聚糖納米微粒，其粒徑在10 ～ 100 nm范圍內(nèi)，其制備過(guò)程中加入了有機(jī)溶劑異丙醇作為分散劑，沒(méi)有對(duì)制備的相關(guān)因素進(jìn)行分析研究。筆者綜合謝宇[1]和周少華[2]等人使用的方法，制備了殼聚糖納米微粒,對(duì)其反應(yīng)的影響因素CTS、TPP濃度、CTS/TPP質(zhì)量比做了更加深入詳細(xì)的研究，另外增加了攪拌速度，交聯(lián)時(shí)間等因素對(duì)其反應(yīng)結(jié)果的影響分析，從而為最佳制備條件提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。

殼聚糖可作為包膜型或包裹型的緩釋肥料。陳強(qiáng)等人[8]介紹了兩種甲殼素緩釋肥的的制備方法，林閩法[9]應(yīng)用兩種甲殼素緩釋肥料于茶樹(shù)，這些對(duì)提高肥料的利用率和改良土壤方面起到一定的效果，但是沒(méi)有對(duì)作為包膜劑的殼聚糖進(jìn)行優(yōu)化和研究。楊彪[10]提出了用甲殼素(CTS)鹽膠體溶液作為粘合劑、緩釋劑，制備顆粒復(fù)混肥，并測(cè)定了該產(chǎn)品的性能和其氮的釋放速率。該產(chǎn)品具有長(zhǎng)效性，適當(dāng)比例的速溶性。本文中，主要針對(duì)殼聚糖可作為優(yōu)良的膜材料和吸附性的特點(diǎn)，對(duì)殼聚糖進(jìn)行納米化處理并對(duì)其制備條件進(jìn)行優(yōu)化，增大了殼聚糖的比表面積，增強(qiáng)了其吸附性和成膜性，并對(duì)其進(jìn)行緩釋肥外包膜的初步研究，以期為緩釋肥的制備提供了一個(gè)新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試劑：殼聚糖(CTS)，脫乙酰度≥90%；三聚磷酸鈉(TPP)；冰醋酸(HAC)；水為蒸餾水，超純水。

儀器：AUY120 電子分析天平(shimadzu corporation Japan)；JB 90—S數(shù)字顯示轉(zhuǎn)速電動(dòng)攪拌機(jī)(上海標(biāo)本模型制造)；101—1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；YJ501超級(jí)恒溫水浴器；centrifuge 5804R臺(tái)式大容量高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf AG 22331 Hamburg)；FD—1C冰凍干燥機(jī)(北京德天佑科技發(fā)展有限公司)；DHL—A電腦橫流泵(上海青浦瀘西儀器廠)；ZEN 3600納米粒及Zeta電位分析儀(馬爾文儀器有限公司)；JEOLJSM-6380LV掃描電子顯微鏡(日本電子)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 殼聚糖納米微粒的制備[1,6]

稱取適量的CTS粉末，室溫下溶于0.1MHAC溶液，用NaOH調(diào)pH為5，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾；TPP溶于超純水，pH調(diào)為8，用0.45μm微孔濾膜過(guò)濾。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，量取一定量的CTS溶液加入到500ml的三口燒瓶中，放入攪拌器，置于數(shù)字顯示轉(zhuǎn)速電動(dòng)攪拌機(jī)上，使用電腦橫流泵控制不同濃度的TPP溶液的滴加速度，將其滴入到上述裝有CTS溶液的三口燒瓶中，滴加的速度為30d/min，通過(guò)超級(jí)恒溫水浴器控制整個(gè)反應(yīng)過(guò)程的溫度變化，溶液經(jīng)過(guò)陰陽(yáng)離子的靜電作用交聯(lián)成納米微粒。

1.2.1.1 CTS濃度對(duì)平均粒徑的影響 固定量：0.1 mol HAC，1.5%TPP，溫度25℃，攪拌速度為850 r/min，時(shí)間60 min，CTS∶TPP(質(zhì)量比)=6∶1;變量：CTS 濃度 (1、1.5、2、2.5、3 g/L)。

1.2.1.2 TPP濃度對(duì)平均粒徑的影響 固定量：0.1 mol HAC，CTS=2.5 g/L，溫度25℃，攪拌速度：850 r/min，時(shí)間：60 min，CTS∶TPP(質(zhì)量比)=6∶1。變量：TPP濃度(0.3、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0%)。

1.2.1.3 CTS和TPP的質(zhì)量比 固定量：0.1 mol HAC、CTS=2.5 g/L, TPP=1.5%, 溫度25℃，攪拌速 度：850 r/min，時(shí) 間：60 min。 變 量：3/1、5/1、6/1、7/1、9/1、11/1。

1.2.1.4 攪拌速度對(duì)平均粒徑的影響 固定量：0.1 mol HAC，CTS=2.5 g/L，TPP=1.5%，溫度25℃，時(shí)間：60min。變量：攪拌速度(550、650、750、850、950、1050 r/min)。

1.2.1.5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)平均粒徑的影響 固定量：0.1 mol HAC，CTS=2.5 g/L，TPP=1.5%，溫度25℃，攪拌速度：850 r/min。變量：時(shí)間(20、30、40、60、80、100 min)。

1.2.1.6 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在0.1 mol HAC，CTS∶TPP=6∶1的情況下，選取CTS濃度、TPP濃度、攪拌速度、交聯(lián)時(shí)間作為殼聚糖納米微粒制備的主要參考因素，以平均粒徑為考察指標(biāo)，采用四因素三水平正交試驗(yàn)優(yōu)選最佳制備微粒條件，試驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

表1 試驗(yàn)的因素和水平Table 1 Factors and levels of tests

1.1.2 殼聚糖納米微粒懸液平均粒徑及表面外觀的測(cè)定

平均粒徑的測(cè)定：將交聯(lián)一定時(shí)間的膠體溶液于4℃下高速離心(11 000 r/min)40 min，收集下層沉淀，用純水洗滌3次后，通過(guò)超聲波分散儀在25℃下分散60 min，冷卻后通過(guò)Zeta 電位分析儀測(cè)定其平均粒徑、分散度。另外殼聚糖納米微粒的表面外觀觀察：將其膠體溶液進(jìn)行冷凍干燥后，通過(guò)掃描電鏡來(lái)觀察其表面的分布情況。

1.2.3 殼聚糖納米微粒溶液用于緩釋肥外包膜的制備

把進(jìn)行條件優(yōu)化后制備殼聚糖納米微粒膠體懸浮液放到固定容器中，在緩釋肥制備的過(guò)程中，加入一定量的懸浮液作為緩釋肥的外包膜，干燥即可成品。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖納米微粒制備的單因素條件優(yōu)化

2.1.1 CTS濃度對(duì)平均粒徑的影響

不同濃度的CTS溶液和TPP反應(yīng)會(huì)呈現(xiàn)出3種結(jié)果：澄清溶液，反應(yīng)過(guò)程中始終保持澄清；乳光懸液，在CTS濃度為0.8g/L ～ 3.5 g/L的范圍內(nèi)得到的是乳白色懸浮液；沉淀，反應(yīng)初期即產(chǎn)生沉淀。

由圖1可知，隨著CTS濃度的增加，懸浮液中微粒的平均粒徑逐漸增大，這是由于隨著CTS濃度的增大，當(dāng)TPP溶液滴加到其中時(shí)，過(guò)量的CTS分子與少量TPP分子互相交聯(lián)，使得單個(gè)TPP分子交聯(lián)多個(gè)CTS分子，因此增大了粒徑。當(dāng)CTS濃度為3.0 g/L時(shí)，平均粒徑將接近500 nm以上。從平均粒徑、分散度等方面的考慮，本實(shí)驗(yàn)確定的CTS濃度在1.0 ～ 2.5 g/L范圍內(nèi)。

圖1 CTS濃度對(duì)平均粒徑的影響Fig. 1 Effect of CTS concentration on average particle size

2.1.2 TPP濃度對(duì)平均粒徑的影響

由圖2可得知，當(dāng)TPP濃度較低時(shí)，根據(jù)CTS與TPP的質(zhì)量比，所應(yīng)加入TPP的量就會(huì)增加，因此造成TPP的局部濃度過(guò)高，其乳光懸液則有所加重，故所形成的納米微粒的平均粒徑就會(huì)增大。當(dāng)TPP濃度為1.5%時(shí)，所形成的納米微粒的平均粒徑最小，因?yàn)閮烧叩臐舛缺壤钆渚鶆蜻m中，不會(huì)造成TPP的局部濃度過(guò)高。當(dāng)TPP濃度大于1.5%時(shí)，所形成的納米微粒的粒徑是逐漸增大的，這可能由于過(guò)量的TPP分子與少量的CTS分子相互交聯(lián)，使得兩者的比例不均，增大了其粒徑。

圖2 TPP濃度對(duì)平均粒徑的影響Fig. 2 Effect of TPP concentration on average particle size

2.1.3 CTS和TPP的質(zhì)量比

由圖3可得知，在CTS與TPP質(zhì)量比在3/1—11/1范圍內(nèi)可得到乳光懸液。當(dāng)質(zhì)量比低于3/1時(shí)乳光懸液會(huì)出現(xiàn)微粒狀懸浮物，考慮為殼聚糖納米微粒濃度過(guò)高而發(fā)生的凝聚。當(dāng)質(zhì)量比在5/1—7/1范圍內(nèi)，其乳光懸液的均勻度為較好，平均粒徑適中。當(dāng)質(zhì)量比大于9/1時(shí)，其懸浮液的狀態(tài)越趨于澄清狀態(tài)，所結(jié)合的納米微粒較少，不適合本實(shí)驗(yàn)的研究，本實(shí)驗(yàn)確定質(zhì)量比在5/1—7/1范圍內(nèi)作為最佳制備條件。

圖3 CTS/TPP質(zhì)量比對(duì)平均粒徑的影響Fig. 3 Effect of CTS/TPP mass ratio on average particle size

2.1.4 攪拌速度對(duì)平均粒徑的影響

由圖4可得知，當(dāng)攪拌速度很低時(shí)，可能由于TPP滴加到CTS溶液中后，轉(zhuǎn)速不能使其分散充分，造成TPP局部濃度過(guò)高，形成的微粒粒徑增大。隨著攪拌速度的增加，其粒徑相應(yīng)降低，說(shuō)明適宜的速度可使滴加到CTS中的TPP溶液分散均勻，使兩者的基團(tuán)交聯(lián)更加充分，不會(huì)引起過(guò)多的凝聚現(xiàn)象，降低了粒徑的范圍。當(dāng)攪拌速度為850r/min時(shí)，粒徑達(dá)到一個(gè)最小值，說(shuō)明對(duì)CTS納米微粒的制備所需的攪拌轉(zhuǎn)速達(dá)到一個(gè)最優(yōu)值。當(dāng)轉(zhuǎn)速大于850 r/min時(shí)，粒徑逐漸增大，這可能是高轉(zhuǎn)速所形成的高剪切力把一部分的CTS、TPP分子的結(jié)構(gòu)破壞，使得部分分子不能進(jìn)行正常的交聯(lián)，造成各自分子之間的凝聚而增大了微粒的粒徑。

圖4 攪拌速度對(duì)平均粒徑的影響Fig. 4 Effect of stirring speed on average particle size

2.1.5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)平均粒徑的影響

由圖5可得知，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間較短時(shí)，可能由于所添加的TPP分子沒(méi)有充分分散，凝聚成團(tuán)，粒徑增大。當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為80 min時(shí)，其粒徑最小，說(shuō)其交聯(lián)狀態(tài)達(dá)到一個(gè)最佳時(shí)間狀態(tài)。當(dāng)時(shí)間大于80 min時(shí)，其粒徑大幅度的增大，這可能由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，CTS溶液的粘度降低，在攪拌狀態(tài)下，降解速度也會(huì)加快，故不能與TPP正常的交聯(lián)，導(dǎo)致TPP部分的凝聚，形成粒徑增大。

圖5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)平均粒徑的影響Fig. 5 Effect of cross-linking time on average particle size

2.1.6 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

由表2所示三種因素的關(guān)系。根據(jù)極差R值的大小，極差大的因素，對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響大，作為主要因素；極差小的因素，對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響小，是次要因素。由極差R值分析可知，影響殼聚糖納米微粒平均粒徑的主次因素為A＞B＞C。即殼聚糖濃度是三個(gè)因素中的主要因素，其余依次是三聚磷酸鈉的濃度，攪拌速度。

綜合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和極差分析，制備殼聚糖納米微粒的最宜條件組合為A1B2C3，即殼聚糖濃度為1.0 g/L，三聚磷酸鈉濃度為1.5%，攪拌轉(zhuǎn)速為950 r/min。在最佳組合的條件制備的納米微粒達(dá)到300 nm范圍內(nèi)，重復(fù)性好，是符合本實(shí)驗(yàn)的條件要求的。

表2 正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal optimization results

2.2 殼聚糖納米微粒的表征

主要觀察指標(biāo)：最佳條件下制備的納米微粒的平均粒徑、分散度以及微粒的表面外觀狀態(tài)。

圖6所示為最佳條件下制備的納米微粒的粒徑分布，其平均粒徑為287，PDI為0.276，小于0.5，說(shuō)明分散度是在合適的范圍內(nèi)，分散程度均勻。其圖形的峰度較窄，沒(méi)有拖尾現(xiàn)象，說(shuō)明了通過(guò)最佳條件制備的納米微粒的平均粒徑是在300 nm范圍內(nèi)，其粒徑較為均一，效果是比較好的，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性稍好，形成微粒的量也適宜，適合本實(shí)驗(yàn)的研究應(yīng)用。

圖6 殼聚糖納米微粒的粒徑分布Fig. 6 Distribution curve of chitosan nanometer particle size

圖7所示為殼聚糖冷凍干燥后的掃描電鏡圖。殼聚糖納米微粒經(jīng)掃描電鏡表征表明：以最佳條件制備的CTS納米微粒的平均粒徑范圍是在300 nm范圍內(nèi)，與通過(guò)Zeta電位測(cè)定儀測(cè)定出來(lái)的結(jié)果是相符的。冷凍干燥后，殼聚糖納米微粒是成片狀結(jié)構(gòu)，其成膜性符合本實(shí)驗(yàn)的研究應(yīng)用。

2.3 殼聚糖納米微粒用于緩釋肥膜的應(yīng)用

圖8中所示為利用殼聚糖納米微粒懸液作為外包膜材料制備的緩釋肥，通過(guò)初步鑒定其產(chǎn)品是具有成粒性和一定的抗壓性，緩釋性，另外產(chǎn)品的詳細(xì)性能指標(biāo)需要進(jìn)行下一步的研究。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用離子凝膠法成功制備了殼聚糖納米微粒，該方法反應(yīng)條件溫和，無(wú)需使用有機(jī)溶劑，得到的顆粒堅(jiān)固、穩(wěn)定性好、粒徑均勻。制備過(guò)程中影響因素有很多，本研究以微粒的平均粒徑、分散度、產(chǎn)量為參考指標(biāo)，通過(guò)對(duì)影響殼聚糖納米微粒制備的主要因素進(jìn)行條件優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)，得出結(jié)論：在殼聚糖濃度為0.8 g/L～3.5 g/L的范圍內(nèi)得到的都是乳光懸液，是符合實(shí)驗(yàn)要求的。其制備的最佳組合是0.1 mol HAC、CTS/TPP(質(zhì)量比=6/1、CTS=1.0 g/L、TPP=1.5%、交聯(lián)時(shí)間80 min、攪拌速度為950 r/min、溫度為25℃。另外其懸浮液是可以用于制備緩釋肥的外包膜的。

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Optimization of preparation conditions of chitosan nanometer particles and their application

WANG Wei-weia, HE Ganga,b, WANG Qionga
(a. School of Life Sci-Tech, b. Institute of Biological Environmental Science & Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China;

The chitosan nanometer particles suspension was prepared by using ionic gelation method. With the average particle size,dispersion, yield as reference indeхes，the single factor and orthogonal eхperiment were conducted，taking into account the main factors that affect the preparation of chitosan nanometer particles. The results indicate that the best preparation combination was: CTS 1.0g / L, TPP 1.5%, stirring speed 950 r/min；the mean particle size values of CTS nanometer particles prepared with the best conditions was about 300 nm. The repeatability of the preparation technology was very good, and the process could meet the design requirements of the studying project. Finally, the preparation method of outer envelope of slow-release fertilizer with chitosan suspension made by the process was studied.

chitosan；nanometer particles；slow-release fertilizer；preparation condition；optimization

S714.8；Q599

A

1673-923X(2012)02-0095-05

2011-05-25

國(guó)家級(jí)基金項(xiàng)目：“948”引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)林業(yè)科學(xué)技術(shù)(新型氧肥制造與施用技術(shù)引進(jìn))(項(xiàng)目編號(hào)：2011-4-65)

王薇薇(1986—)，女，廣東信宜人，碩士研究生，從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究；E-mail: maywei1986may@163.com

何 鋼(1965—)，男，湖南湘潭人，碩士，教授，研究生導(dǎo)師，主要從事生物技術(shù)教學(xué)與科研工作；E-mail: hegang262@163.com

[本文編校：邱德勇]