云實葉片體細胞胚發(fā)生及植株再生

曾艷玲 ，張 琳 ，譚運德 ，王 聰 ，羅 俊 ，王方艷

（1.中南林業(yè)科技大學 林學院，經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，湖南 長沙 410004；2. 河南省林業(yè)科學研究院，河南 鄭州 450008）

云實葉片體細胞胚發(fā)生及植株再生

曾艷玲1，張 琳1，譚運德2，王 聰1，羅 俊1，王方艷1

（1.中南林業(yè)科技大學 林學院，經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室，湖南 長沙 410004；2. 河南省林業(yè)科學研究院，河南 鄭州 450008）

以云實當年生嫩葉為試材，設計正交試驗優(yōu)化脫分化和再分化培養(yǎng)基配方，獲得體細胞胚并誘導不定芽；篩選最佳生根培養(yǎng)基，獲得完整無菌植株并移栽成活。試驗結果表明，最佳誘導愈傷組織培養(yǎng)基為：1/2MS+TDZ 0.5 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1，且該培養(yǎng)基也適合云實葉片愈傷組織再分化出芽；添加0.1%活性碳能抑制褐化，同時促進體細胞胚發(fā)生和不定芽產(chǎn)生；1/2MS+NAA 0.1 mg·L-1最適宜云實無菌苗生根，其根系數(shù)量質(zhì)量均優(yōu)于其他生根培養(yǎng)基組合；移栽采用蛭石∶珍珠巖∶草炭灰（1∶1∶1）基質(zhì)，成活率達85%。

云實；體細胞胚發(fā)生；不定芽誘導；生根；移栽

云實Caesalpinia decapetala (Roth) Alston系豆科Fabaceae云實屬Caesalpinia Linn植物, 異名“馬豆”（《本草經(jīng)圖注》），又稱藥王子、牛王刺，為攀緣灌木, 分布于長江以南各省區(qū)。果、莖皮含單寧, 種子可榨油, 根莖及果實供藥用[1]。云實種核所含化學成分有明顯抗瘧原蟲活性，可用作抗瘧劑和驅蟲劑，是東南亞常用的傳統(tǒng)藥用植物[2]。有報道[3]指出云實葉片也富含二萜類化合物，是很多中西藥材的有效成分。云實葉色青翠碧綠，葉形美觀，花瓣顏色鮮黃顯目，是植物造景的好材料，不少地方已人工種植或從天然生長處移植造景[4]。而且，經(jīng)測試分析，云實具有較強的DPPH自由基清除能力，能使園林景區(qū)空氣更清新，并可為開發(fā)天然自由基清除劑或天然抗氧化劑產(chǎn)品提供植物材料[3]。此外，云實因含有多種單寧物質(zhì)及色素，在民間應用廣泛，有些種類還是制藥工業(yè)和化工行業(yè)的重要原料[5]。

但是目前僅見國外引種的刺云實速生豐產(chǎn)造林的相關報道[6-8]，中國云實基本處于野生散生狀態(tài)。隨著云實在不同領域的應用價值發(fā)掘和開發(fā)利用，自然生長和人工栽培的植物材料逐漸供不應求。植物組織培養(yǎng)技術為短時高效獲得植物材料提供了一條有效途徑。通過組織培養(yǎng)獲得愈傷組織，再從愈傷組織中快速大量提取獲得植物次生代謝產(chǎn)物[9-11]是目前許多工廠化生產(chǎn)天然活性物所采用的方法。云實含有多種實用的次生代謝產(chǎn)物，也可探索植物組織培養(yǎng)的方法從中高效獲取天然活性物。目前，尚未見相關云實葉片組織培養(yǎng)的報道。本研究篩選出最佳云實葉片誘導培養(yǎng)基配方和生根培養(yǎng)基配方，高效率誘導出體細胞胚，獲得完整的無菌苗，并移栽成活。為云實工廠化組織培養(yǎng)、遺傳轉化體系的建立和植物次生代謝產(chǎn)物快速獲取奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

選取優(yōu)良單株無病蟲害的當年生云實Caesalpinia decapetala (Roth) Alston嫩葉為試材（見圖1，A）。

1.2 材料處理及培養(yǎng)觀察

取帶嫩葉的當年生枝條，先用洗衣粉洗滌，清洗干凈后盛于塑料桶中用自來水流水沖洗4h。剪取試材嫩葉，接種前先用75% 酒精浸泡30 s，再用0.1% 升汞溶液浸8～10 min，最后用無菌水沖洗5～6次。接種時垂直葉脈橫向輕輕劃1～2刀，平鋪接種到正交設計的9 種固體培養(yǎng)基上。每一處理接種10～20個外植體進行培養(yǎng)。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計數(shù)據(jù)并進行均一化培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度25℃，每天照射12 h，光照強度850～1 200 lх，均一化培養(yǎng)之前隔10 d繼代一次，均一化培養(yǎng)之后隔28 d繼代一次，定時觀察外植體培養(yǎng)過程中的變化情況。采用石蠟切片的方法進行解剖觀察。不定芽長至1.5～2.0 cm高時進行生根培養(yǎng)，根長3.5～4.0 cm時移栽。

1.3 脫分化和再分化

為篩選出云實葉片脫分化和再分化最佳培養(yǎng)基及激素配比，培養(yǎng)基選用B5、NN69、1/2MS三種基本培養(yǎng)基, 附加不同質(zhì)量分數(shù)的TDZ、IBA和 6-BA , 蔗糖 30 g·L-1，瓊脂 6. 5 g·L-1, pH 5. 6. 按L9(34) 正交試驗設計, 共9 個處理（見表1）。

均一化繼代時采用正交試驗分析為最佳的培養(yǎng)基配方，部分培養(yǎng)基添加0.1%的活性碳進行對照試驗（見表3）。

1.4 苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性檢測

參照 Koukol等（Koukol et al.，1961）的測定方法。①粗酶液的提取。取不同處理樣品各0.1 g，放入冰凍好的干燥研缽中。加入相當于樣品50倍的預先配制好的緩沖液(含0.2 mol·L-1硼砂，含0.005 mol·L-1的巰基乙醇，0.001 mol·L-1的 EDTA，pH8.0)，加入相當于樣品1 /10 重量的聚乙烯吡咯烷酮( PVP) 。于冰浴中將樣品研磨勻漿，將勻漿好的樣品轉入1.5 mL的EP管中，用3 管進行分裝。于4℃下, 10 000 r·min-1，離心15 min，將相同樣品不同管的上清液轉入同一大型EP管中充分混勻，然后放入4℃冰箱中待用。②酶活性的測定。取底物溶液( 為L-苯丙氨酸0.02 mol·L-1，配制時用硼砂緩沖液進行溶解) 1 mL，緩沖液2 mL，0.8 mL粗提酶液，混合后放入大型離心管中，于37℃水浴鍋反應1 h。分別取各種反應液1 mL， 在290 nm波長下測定吸光度值。對照用緩沖液代替底物( L-苯丙氨酸) 溶液。每個樣品設3 次重復。

1.5 根與移栽

生根培養(yǎng)基以1/2MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的NAA或IBA，蔗糖30 g·L-1，瓊脂6. 5 g·L-1,pH 5. 6（見表4）。將待移栽的無菌苗置于自然光下進行光照適應性鍛煉，閉瓶煉苗4～5 d后，再開瓶煉苗1～2 d，取出無菌苗，洗去根部的培養(yǎng)基，移栽至裝有高壓滅菌過的蛭石∶珍珠巖∶草炭灰（1∶1∶1）基質(zhì)的容器中育苗。移栽1個月之后根據(jù)新生葉統(tǒng)計成活率。

2 結果與分析

2.1 誘導培養(yǎng)基的篩選和脫分化

采用正交設計的9個處理中，在葉片接種4 d后，處理7的部分葉片首先出現(xiàn)傷口變黃且凹凸不平，中部隆起的現(xiàn)象。接種10～15 d 后，葉片傷口、葉柄端出現(xiàn)少量白色愈傷組織，部分葉塊邊緣或葉脈切口為淺綠色或黃綠色愈傷組織。同時，部分葉片褐化，培養(yǎng)基開始變色，該現(xiàn)象以處理2尤為嚴重。因此，此時按正交設計配方繼代一次。

接種24 d 后，各處理葉片愈傷組織均明顯增多（見圖1，B），取樣進行石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，此時愈傷組織結構較為明顯，處于分裂期的愈傷組織形成一個小芯，缺少有組織的結構，逐漸恢復到分生組織狀態(tài)（見圖1，C）。接種30 d之后，經(jīng)過數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，得出最優(yōu)誘導培養(yǎng)基組合（見表1）。

表1 不同培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑對葉片誘導愈傷組織的影響?Table 1 The influences of different medium and plant growth regulator on leaves inducing callus

從表1可以看出，正交試驗中處理2的愈傷率和褐化率均為100%，說明外植體雖然出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，但是只要有細胞存活就能產(chǎn)生愈傷組織。通過極差分析（結果見表1），由2個不同指標所計算出的各影響因素主次順序以及最佳配方有差異。由愈傷率RI的大小得出影響因素主次順序為：B（TDZ）＞C（IBA）＞D（6-BA）＞A（基本培養(yǎng)基），最佳配方為A3B1C2D1；由褐化率RII的大小得出影響因素主次順序為：B（TDZ）＞C（IBA）＞ A（基本培養(yǎng)基）＞D（6-BA），最佳配方為A3B3C1D2。通過方差分析，以褐化率（因變量II）為指標得出Pr＞F值均大于0.7，數(shù)據(jù)置信度較低，而愈傷率（因變量I）為指標得出的數(shù)據(jù)置信度較高，而且方差結果與極差結果相吻合，因此認為最佳培養(yǎng)基組合為A3B1C2D1，即1/2MS+0.5 mg·L-1TDZ+0.3 mg·L-1IBA。

2.2 體細胞胚發(fā)生及再分化

經(jīng)過正交試驗獲得最佳誘導培養(yǎng)基配方后，將葉片愈傷組織均一化繼代到最優(yōu)誘導培養(yǎng)基上。由于云實代謝過程中能產(chǎn)生單寧物質(zhì)，影響植株生長，所以在均一化繼代時部分培養(yǎng)基添加了0.1%的活性碳進行對比試驗，均一化繼代45 d后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析（見表2）。

表2 活性碳對愈傷組織出芽的影響Table 2 The influence of activated carbon on inducing adventitious buds

均一化繼代5 d后，顯微觀察發(fā)現(xiàn)，此時愈傷組織處于分化期，并且可以判斷該愈傷組織屬于胚性愈傷組織，具有體積小、核大、細胞質(zhì)濃厚、染色深、細胞排列緊密、與周邊愈傷組織維管系統(tǒng)沒有連接等特點，同時可以看出芽原基的雛形（見圖1，D）。均一化繼代10 d后，出現(xiàn)明顯不同的深綠色芽點，米胚大小，有的芽點已經(jīng)開始出芽（見圖1，E）。均一化繼代15 d后出芽明顯，且增值率較高（見圖1，F(xiàn)），均一化繼代30 d后，長成可供壯苗或生根的無菌苗（圖1，G）。

據(jù)表2分析，無論是通過出芽率、出芽指數(shù)還是褐化率評價，在添加0.1%的活性碳的培養(yǎng)基上云實愈傷組織生長狀況都優(yōu)良些。出芽率和出芽指數(shù)差異不是很大，主要是褐化率得到的較大的改善，由3.46%的褐化率降低到了1.54%。但是根據(jù)觀察發(fā)現(xiàn)，雖然有褐化現(xiàn)象產(chǎn)生，但是在褐化初期進行轉接之后，褐化的愈傷組織仍能夠分化出芽。說明生長旺盛的植物細胞在一定程度上可以抵御代謝產(chǎn)物的毒害。同時根據(jù)顯微和表型對照統(tǒng)計，在添加0.1%活性碳的培養(yǎng)基上愈傷組織均生長為胚性愈傷組織，外觀表型較非胚性愈傷組織更脆綠，而且愈傷顆粒更圓滑，易剝落些。

2.3 苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性檢測

苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性對木質(zhì)素的合成起決定作用[12]， 而木質(zhì)素的沉積是導管分子次生壁的形成的先決條件。根據(jù)苯丙氨酸裂解酶（PAL）活性檢測原理，其反應液在290 nm波長下吸光值越高，說明PAL酶活越高，反之，越低。從圖2可以看出，是否添加活性碳對PAL酶活變化影響不大，而外植體出芽的狀態(tài)與PAL酶活變化有著較大的關聯(lián)。無芽點的愈傷組織PAL酶活明顯比有芽點的愈傷組織低，同時離體材料的PAL酶活明顯比自然材料的低。這說明出芽愈傷組織的PAL酶活性的確比未出芽的高，此時導管分化，逐步進入器官分化階段。同時說明雖然添加適當?shù)幕钚蕴伎梢源龠M外植體材料的生長，但是對PAL酶的活性并沒有增強或減弱作用。

圖1 云實組織培養(yǎng)及細胞學觀察Fig.1 Tissue culture of Caesalpinia and cytological observations

圖2 不同生長狀態(tài)材料苯丙氨酸裂解酶（PAL）的活性檢測Fig.2 The phenylalanine lyase activity detection of different growth state materials

2.4 生根和移栽

均一化繼代30 d后，將高約2 cm的健康無菌苗轉至不同生根培養(yǎng)基上進行生根試驗，生根培養(yǎng)基配方見表3。生根培養(yǎng)10 d左右，組合2中首先有無菌苗產(chǎn)生白色米胚狀根原基，同時部分無菌苗切面有褐色物質(zhì)產(chǎn)生。生根30 d后進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析(見表3)。

表3 不同生根培養(yǎng)基對云實試管苗生根的影響Table 3 Effects of different rooting medium on rooting of Caesalpinia decapetala plantlets

生根培養(yǎng)30 d后，大部分無菌苗長出根尖乳白健康的根系。在添加激素NAA的生根培養(yǎng)基上，無菌苗生根率隨著NAA濃度的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而且生根狀況也有明顯的差異。當生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1 mg·L-1NAA時，生根率最高，達到85.7%，而且根系粗壯，數(shù)量也較其他組合多（見圖1，H）。在添加激素IBA的生根培養(yǎng)基上，無菌苗生根率隨著IBA濃度的增加而降低。說明兩種情況，一是NAA較IBA適合云實無菌苗生根，或是因為無菌苗繼代至生根培養(yǎng)基之前植物體內(nèi)已吸收較多的IBA，所以生根培養(yǎng)基中再添加IBA導致濃度過高，影響無菌苗生根。

當無菌苗高3～4 cm，根長2～3 cm時，移栽至裝有高壓滅菌過的蛭石∶珍珠巖∶草炭灰（1∶1∶1）基質(zhì)的容器中。移栽10 d無菌苗開始長出新生葉，移栽30 d成活率達到85%（見圖1，I）。

3 討論與結論

褐化現(xiàn)象通常又被稱之為酚污染，當外植體組織被切割和接種時，損傷切面細胞中酚類物質(zhì)被氧化成醌，切面迅速變成棕褐色活暗褐色，這些褐色物會逐漸擴撒到培養(yǎng)基中，抑制其他酶的活性，毒害整個外植體組織[13]。云實富含單寧物質(zhì)[1]，接種時切面很快就會有褐化現(xiàn)象產(chǎn)生，影響外植體的生長。實驗證明接種初期可采用連續(xù)轉移外植體的方法緩解褐化，繼代時間縮短為一周或10 d繼代一次，待切口愈合，外滲停止之后可按常規(guī)的30 d繼代。本實驗在切割愈傷組織均一化繼代之后，發(fā)現(xiàn)添加活性碳和不添加活性碳的培養(yǎng)基上均有部分褐化現(xiàn)象產(chǎn)生，說明云實愈傷組織細胞中也富含單寧物質(zhì)，因此，說明通過云實細胞培養(yǎng)大量生產(chǎn)植物單寧或其他代謝活性物是可以嘗試的一種途徑。

TDZ中文簡稱為噻重氮苯基脲，是Schering公司1976 年合成的新型植物生長調(diào)節(jié)劑。TDZ類似細胞分裂素的活性取決于其特殊結構，但TDZ與嘌呤型細胞分裂素的結構有差異，所以TDZ能誘導體細胞胚發(fā)生的某種形態(tài)建成，而其他嘌呤型細胞分裂素卻不能。同時，TDZ刺激生長素的從頭合成，從而調(diào)節(jié)植物內(nèi)源激素水平[14]。本實驗發(fā)現(xiàn)TDZ在云實葉片組織培養(yǎng)過程中的確起到主導作用。相比6-BA而言，TDZ能更好地促進愈傷組織的產(chǎn)生，并能為后期體細胞胚胎發(fā)生奠定基礎。同時，IBA在云實誘導愈傷組織過程中，0.1～0.3 mg·L-1的濃度均適用，說明生長素此時主要是起到一個協(xié)同輔助作用。

體細胞胚胎發(fā)生是細胞工程中植株再生的重要途徑之一，可作為基因工程的受體系統(tǒng)，同時也是研究細胞全能性、細胞分化及其形態(tài)建成的理想試驗體系[15]?；钚蕴寄軌蛭酵庵搀w分泌釋放到培養(yǎng)基里的分泌物，同時也能促進體細胞胚的發(fā)生[16]。本實驗結果證實了這一點，通過調(diào)節(jié)植物生長調(diào)節(jié)劑，在培養(yǎng)基中添加0.1%的活性碳，能有效控制褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生，同時促進胚性愈傷組織的生長。云實葉片在脫分化再分化過程中，PAL酶活性也呈現(xiàn)拋物線變化趨勢，先由自然生長高活性低至脫分化時的低活性，再隨再分化逐漸升高，而該變化與是否添加活性碳關系不大，這說明云實葉片體細胞胚胎發(fā)生主要影響因素還在于TDZ的添加。

本實驗均一化繼代采用的是正交設計優(yōu)化的脫分化培養(yǎng)基配方 1/2MS+0.5 mg·L-1TDZ+0.3 mg·L-1IBA，結果顯示在繼代45 d時出芽率能達到95%以上，而且出芽指數(shù)在2.0以上，說明此培養(yǎng)基配方也適用于云實葉片再分化。因此可以確定云實葉片組織培養(yǎng)可采用二步成苗法，即脫分化和再分化可以采用同一培養(yǎng)基配方，生根另采用生根培養(yǎng)基配方，最終形成完整的試管苗。實驗發(fā)現(xiàn)由于均一化繼代配方中含有IBA，外植體在脫分化和再分化過程中吸收了較多IBA，在生根培養(yǎng)基中再添加IBA，則濃度偏高，反而不利于生根。生根培養(yǎng)基中添加適量的NAA則可與吸收的IBA互補促進生根，達到較好的生根效果。

云實組培苗移栽要求不高。只要形成健康完整的無菌苗，在由蛭石∶珍珠巖∶草炭灰（1∶1∶1）混合的基質(zhì)中，移栽成活率能達到85%以上。但是瓶內(nèi)相對于瓶外生根成本較高，且有研究發(fā)現(xiàn)試管外生根的苗木較試管內(nèi)生根苗木更適宜生根后移栽[17]，如需離體快繁工廠化生產(chǎn)則可考慮瓶外生根，探索生根粉浸泡促生根的方法。

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Somatic embryogenesis of Caesalpinia decapetala leaves and regeneration

ZENG Yan-ling1, ZHANG Lin1, TAN Yun-de2, WANG Chong1, LUO Jun1, WANG Fang-yan1
(1. Key Lab. of Non-wood Forest Products of Forestry Ministry, School of Forestry, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Henan Research Institute of Forestry Science, Zhengzhou 450008, Henan, China)

By taking one-year young leaves of Caesalpinia decapetala as testing materials, an orthogonal test was designed to optimize dedifferentiation and re-differentiation medium formula, obtain somatic embryos and induce adventitious buds. The best rooting medium was screened out and the sterile plants were transplanted. The results show that the best induction medium was 1/2 MS + TDZ 0.5 mg·L-1+IBA0.3 mg·L-1, the medium was also suitable for differentiating Caesalpinia callus. Adding 0.1% activated carbon not only inhibited browning but also promoted somatic embryos and adventitious bud growing. The root quantity and quality as criterion, 1/2MS+NAA 0.1 mg·L-1was better than other root culture medium. Using vermiculite∶ perlite∶ grass charcoal (1∶ 1∶ 1) matriх, the survival rate of transplanting Caesalpinia plantlets was 85%.

Caesalpinia decapetala (Roth) Alston; somatic embryogenesis; inducing adventitious buds; rooting; transplanting

S727.34

A

1673-923X(2012)02-0089-06

2011-05-12

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（200904024）；中南林業(yè)科技大學大學生創(chuàng)新性實踐教學項目

曾艷玲（1985—），女，湖南常德人，講師，博士研究生，主要從事林業(yè)生物技術研究；E-mail：zengyanling110@126.com

[本文編校：羅 列]