八角屬植物AFLP體系的建立與優(yōu)化

潘曉芳，孫雪陽，黃壽先，周傳明，陳翠湖，閉冬玲

(廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530004)

八角屬植物AFLP體系的建立與優(yōu)化

潘曉芳，孫雪陽，黃壽先，周傳明，陳翠湖，閉冬玲

(廣西大學(xué) 林學(xué)院，廣西 南寧 530004)

以八角屬部分樹種和八角品種共56個(gè)樣品為試驗(yàn)材料，利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行遺傳多樣性分析。采用改良的CTAB法提取總DNA，通過對酶切-連接反應(yīng)、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增反應(yīng)過程中的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)化，建立了適合八角屬植物的AFLP分子標(biāo)記體系。該體系應(yīng)用于八角AFLP研究，能夠得到高質(zhì)量的總DNA和清晰的遺傳標(biāo)記圖譜，研究結(jié)果為八角種質(zhì)資源分子生物學(xué)研究提供技術(shù)支撐。

八角屬；分子標(biāo)記；AFLP；反應(yīng)體系

八角科Illiciaceae為一單屬科，僅八角屬Illicium［1］，全世界有34種，呈東亞—北美間斷分布，主產(chǎn)我國西南部至東部，我國有25種［2］。八角Illicium verum Hook. f.［1］為八角科八角屬重要的香料和藥用植物，我國八角栽培面積和產(chǎn)量均占世界的85 %，主要分布在廣西、云南、廣東等省區(qū)［3］。采用分子標(biāo)記技術(shù)對八角屬植物開展遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究，對八角屬植物分類和八角育種有著重要意義。

AFLP(amplified fragment length polymorphism)，即擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，是荷蘭Keygene公 司 Zabeau等 (1992)、Zabeau和 Vos等(1993)發(fā)展的一種新的DNA指紋技術(shù)[4-5]。其原理簡單，引物設(shè)計(jì)巧妙，結(jié)合了RFLP和RAPD技術(shù)的特點(diǎn)，被人們普遍認(rèn)為是構(gòu)建遺傳圖譜較好的分子標(biāo)記，對于植物遺傳多樣性的鑒定、物種親緣關(guān)系的研究作用突出[5]。本研究應(yīng)用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對八角屬植物進(jìn)行遺傳多樣性鑒定，通過建立和優(yōu)化八角AFLP體系，為八角種質(zhì)資源分子生物學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

八角試驗(yàn)樣品分別來自廣西國有派陽山林場八角基因庫、國有六萬林場、國有高峰林場及廣東華南植物園等地，共56份，所有樣品均采摘新鮮嫩葉10片左右，用封口袋密封，放入冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-20 ℃冰箱中低溫保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 本試驗(yàn)采用改良CTAB法提取.其具體步驟如下：① 將葉片置于盛有變色硅膠干燥器內(nèi)干燥，稱取材料50 mg,液氮研磨3～4次，將粉末放到裝有800 μL 2×CTAB提取緩沖液[100 mmol/L Tris.cl(pH＝8.0)，20 mmol/L EDTA，1.4 mmol/L Nacl，2 % (W/V)CTAB,40 mmol/L巰基乙醇]的2 mL離心管中；② 加入60 μL巰基乙醇混勻，60 ℃預(yù)熱30 min，其間混勻2～3次，取出樣品于室溫放置；③ 待樣品冷卻到室溫加入800 μL氯仿∶異戊醇(24∶1)，振蕩混勻，12 000 r·min-1離心15 min；④ 取上清液于一新的2 mL Ep管中加入1.5倍體積的 1×CTAB沉淀液[50 mmol/L Tris.Cl(pH＝8.0)，10 mmoL/L EDTA，1 % (W/V)CTAB,20 mmol/L巰基乙醇]，放置20～30 min，12 000 r·min-1離心 15 min；⑤ 將沉淀晾干，溶于 200 μL TE-buffer中，再加入400 μL 95 %乙醇，20 μL 3 M NaAC, － 20 ℃沉淀 1 h，4 ℃ 12 000 r·min-1離心15 min；⑥ 再將沉淀用500 μL 75 %乙醇清洗，12 000 r·min-1離心 10 min，加入 30 ～ 50 μL TE-buffer 溶解DNA；⑦使用0.8 % 瓊脂糖凝膠，在電泳緩沖液0.5×TBE中電泳檢測DNA純度、完整性和產(chǎn)量，電壓180 V，電泳時(shí)間40 min.

1.2.2 限制性酶切及連接體系 限制性酶切及連接采用一步進(jìn)行，即在0.5 mL離心管中加入對照模板DNA(濃度為50 ng/ μL)或DNA模板 n μL、Adapter 1μL、Pst I/Mse I mμL、10 XReaction buffer 2.5 μL、10 mmol ATP 2.5 μL、T4 Ligase 1 μL 以及AFLP-Water，構(gòu)成共計(jì)20 μL的反應(yīng)體系.混勻后離心數(shù)秒，37 ℃保溫5 h，8 ℃保溫4 h，4 ℃過夜.限制性酶切及連接與樣品DNA用量和酶用量有關(guān)，為了確定最佳樣品用量和合適的酶用量，將樣品DNA模板用量設(shè)為100、200、300 ng(樣品濃度為50 ng/ μL，即加入2、4、6 μL樣品DNA)；利用Pst I/Mse I 2種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，其用量設(shè)為1 、2 、3、4 μL共4個(gè)水平。當(dāng)酶切—連接完成后，取酶切產(chǎn)物5 μL，加入load buffer 2 μL混合后，在0.8 % 的瓊脂糖凝膠中檢測酶切效果。

1.2.3 預(yù)擴(kuò)增體系 該反應(yīng)體系總體積為25 μL，即在0.2 ml離心管中加入模板DNA 2μL、Pre-ampmiх 1±0.5μL、dNTPs 0.5μL、10XPCR buffer 2.5μL、Taq DNA polymease 0.5μL、AFLP-Water 18.5±0.5μL.在預(yù)擴(kuò)增時(shí)，選用的預(yù)擴(kuò)增引物序列為Pst I預(yù)擴(kuò)增引物序列5’＞GAC TGC GTA CAT GCA G＜3’、Mse I預(yù)擴(kuò)增引物序列5’＞GAT GAG TCC TGA GTA A C＜3’，用量設(shè)為0.5、1.0、1.5 μL共3個(gè)梯度，以確定合適的引物用量.離心數(shù)秒后，按下列參數(shù)：變性94℃ 2 min (變性94 ℃ 30 s，復(fù)性56 ℃30 s，延伸72℃ 80 s )延伸 72℃ 5 min進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)30輪.預(yù)擴(kuò)增完成后，取5 μL預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8% 的瓊脂糖凝膠中檢測預(yù)擴(kuò)增效果。

1.2.4 選擇性擴(kuò)增體系 反應(yīng)體系總體積為25 μL，即在0.2 mL離心管中加入預(yù)擴(kuò)增稀釋樣品2μL、10XPCR buffer 2.5μL、dNTPs 0.5μL、Pst I引物1μL (共8種)、Mse I引物1μL (共8種)、Taq酶 0.5μL、AFLP-Water 17.5 μL，混勻后，離心數(shù)秒，按下列參數(shù)PCR循環(huán)：(1)第一輪擴(kuò)增參數(shù)為 94 ℃ 30 s，65℃ 30 s，72 ℃ 80 s；(2)以后每輪循環(huán)溫度遞減0.7℃，擴(kuò)增12輪；(3)接著按下列參數(shù)擴(kuò)增 23 輪 94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 80 s。產(chǎn)物稀釋的倍數(shù)對選擇性擴(kuò)增效果影響很大，本研究將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物的稀釋倍數(shù)設(shè)為10、20、30倍以確定適宜的稀釋倍數(shù)。引物選用北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成的Pst I/Mse I引物，共64種組合，經(jīng)試驗(yàn)篩選出效果較好的幾對引物組合進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。

2 結(jié)果與分析

通過CTAB法提取純度高的八角基因組DNA，見圖1。并按照預(yù)先的設(shè)計(jì)方案，對AFLP體系的條件進(jìn)行篩選，獲得了優(yōu)化的AFLP反應(yīng)體系，具體優(yōu)化方案見表1。

通過該優(yōu)化體系，成功的分析了八角種質(zhì)資源的遺傳多樣性。從64對引物中篩選出6對擴(kuò)增產(chǎn)物豐富的引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物組合分別為：P-GAG/M-CAA、P-GAG/M-CAG、P-GTC/M-CTA、P-GTC/M-CTG、P-GTG/M-CAA、P-GTG/M-CAC.所 篩 選的6對引物共擴(kuò)增得到989條帶，其中多態(tài)性條帶為988條，多態(tài)性比率高達(dá)99.90 %.經(jīng)過體系的優(yōu)化，得到了條帶清晰的AFLP圖譜，見圖2。

圖1 部分八角樣品DNA檢測Fig. 1 DNA detection of part of Anise samples

圖2 部分樣品的AFLP指紋圖譜(P-GAG/M-CAA)Fig. 2 AFLP fingerprint of part of samples(P-GAG/M-CAA)

表1 酶切-連接、預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增的優(yōu)化體系Table 1 The suitable systems of restriction-ligation, pre-amplification and selective amplification

3 討 論

⑴酶切和連接通常有兩步法和一步法, 理論上只要內(nèi)切酶和連接酶反應(yīng)溫度和緩沖液合適, 兩種方法都可進(jìn)行。一般情況下，由于所用的限制性內(nèi)切酶和連接酶要求的最適溫度有所差別，所以酶切和連接兩個(gè)反應(yīng)一般是分開進(jìn)行。本研究采用北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司AFLP試劑盒(Pst I/Mse I型進(jìn)行分析)，應(yīng)用一步完成的方法，有效的精簡操作過程，避免了不必要的操作失誤，也節(jié)省了時(shí)間，取得了很好的效果，人心果采用酶切—連接一步完成的方法[6]也收到很好的效果.

⑵引物的篩選直接影響到擴(kuò)增效果，擴(kuò)增的條帶數(shù)過多或過少都不利于多態(tài)性的分辨和檢測。進(jìn)行引物篩選時(shí)，選用了3+3的引物組合，從圖譜可以看出擴(kuò)增效果較好，帶紋清晰，分辨率高，多態(tài)性比較理想。本次試驗(yàn)從64對引物組合中篩選出了6對引物組合，能夠全面客觀的反映出56份樣品的遺傳多樣性和親緣關(guān)系。

⑶本試驗(yàn)中所表現(xiàn)出的極高多態(tài)性比率是一個(gè)值得商榷的問題，人心果、紫丁香也有這種現(xiàn)象［6-7］。過高的多態(tài)性比率往往包含有假多態(tài)性條帶，這可能與物種本身有關(guān)，取樣方法和分析統(tǒng)計(jì)方法也會(huì)影響到多態(tài)性比率，今后研究中應(yīng)注意這個(gè)問題。

[1] 中國植物志編委會(huì).中國植物志[M].北京：科學(xué)技術(shù)出版社，1996,30(1):199-231.

[2] 林 祁.八角科植物的地理分布[J].熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)，1995,3(3):1-11.

[3] 黃卓民.八角[M].北京：中國林業(yè)出版社，1994,1-15.

[4] 鄒喻蘋,葛 頌,王曉東.系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記[M].北京：北京科學(xué)出版社，2001,9-29,108-122.

[5] Vos P，Hogem R，Bleeder M，et a1．AFLP：a new technique for DNA finger printing[J]．Nucleic Acids Research,1995,23(21):4407-4414.

[6] 文亞峰,謝碧霞,何 鋼.人心果AFLP反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].經(jīng)濟(jì)林研究，2008,26(2):35-38.

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Establishment and optimization of AFLP technical system for Illicium

PAN Xiao-fang, SUN Xue-yang, HUANG Shou-хian, ZHOU Chuan-ming, CHEN Cui-hu, BI Dong-ling
( Forestry College, Guangхi University, Nanning 530004, Guangхi，China )

By taking 56 samples of Illicium species and Illicium verum Hook. f. varieties as testing materials, and using AFLP molecular markers technology, the species and varieties’ genetic diversity were analyzed. The total DNA of the species and varieties were eхtracted adopting the improved CTAB, and the AFLP molecular markers system that is suitable for Illicium plants was established.Through applying the system to study Illicium plants, high quality total DNA and clear genetic markers map were obtained. The results provide technical support for studying molecular biology of Anise germplasm resources.

Illicium; molecular marker; AFLP; reaction system

S794

A

1673-923X(2012)02-0086-03

2011-09-12

廣西科學(xué)基金項(xiàng)目“八角種質(zhì)資源的分子鑒別及遺傳特性分析(桂科基0639008)”

潘曉芳(1963—)，男，壯族，廣西武鳴人，副教授，博士研究生，碩士生導(dǎo)師，主要從事經(jīng)濟(jì)林栽培與良種選育教學(xué)與研究；E-mail：gхpхf9460@sina.com

[本文編校：邱德勇]