產(chǎn)胞外多糖菌的鑒定及多糖性質(zhì)研究

田文祥蹇華麗楊幼慧廖美德

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；3.華南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，廣東 廣州 510642）

產(chǎn)胞外多糖菌的鑒定及多糖性質(zhì)研究

田文祥1，2蹇華麗1楊幼慧1廖美德3

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244；3.華南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，廣東 廣州 510642）

從華南農(nóng)業(yè)大學殺蟲植物園土壤中篩選出一株胞外多糖高產(chǎn)菌株P(guān)S04，根據(jù)形態(tài)學、生理生化特征以及16S r DNA核酸序列分析結(jié)果表明，該菌屬于多粘類芽孢桿菌。采用察氏培養(yǎng)基，pH6.0，于37℃搖瓶培養(yǎng)48 h，多糖產(chǎn)量為13.3 g／L。對其多糖性質(zhì)研究表明，該多糖的性質(zhì)與黃原膠類似，具有低濃度下高黏性、假塑性、耐鹽性，同時對熱及酸堿有較好的穩(wěn)定性。

多粘類芽孢桿菌；胞外多糖；16S rDNA；鑒定；黏度性質(zhì)

微生物胞外多糖是指微生物在生長代謝活動中分泌到細胞壁外的多糖或多糖混合物。與植物多糖相比，微生物多糖的化學結(jié)構(gòu)更加復雜，這也使其擁有更加特殊的性質(zhì)，因此微生物多糖被作為增稠劑［1］、穩(wěn)定劑［2，3］、乳化劑［4］或凝膠劑［5］廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。另外，在一些新的研究領(lǐng)域中微生物多糖也作為生物絮凝劑［6］、重金屬離子吸附劑［7］和生物活性物質(zhì)［8］被開發(fā)應(yīng)用。

本試驗從華南農(nóng)業(yè)大學殺蟲植物園土壤中分離篩選得到一株在其生長過程中可以分泌大量黏性多糖的菌株P(guān)S04，通過形態(tài)觀察、生理生化試驗和16S r DNA序列分析對其進行鑒定，并對其多糖黏度性質(zhì)進行初步研究，為一種新型多糖生產(chǎn)菌株的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株P(guān)S04：從華南農(nóng)業(yè)大學殺蟲植物園土壤中分離得到，接種于察氏斜面培養(yǎng)基，在30℃培養(yǎng)48 h后保存。

1.2 試劑與儀器

黃原膠：廣州天冠食品配料有限公司；

NaCl、KCl、CaCl2·2 H2O、MgSO4·7 H2O、ZnSO4·7 H2O、FeSO4·7H2O等：均為分析純試劑；

黏度計：LVDV－Ⅱ＋RPO，美國Brookfield公司。

1.3 菌種鑒定

1.3.1 形態(tài)學及生理生化特性 參考伯杰細菌鑒定手冊［9］、常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［10］與芽孢桿菌屬［11］，對菌株的菌體及菌落形態(tài)和生理生化特征進行鑒定。

1.3.2 16S r DNA基因序列測定 PCR擴增引物［12］，F(xiàn)：5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′； R：5′－AAGGAGGTGATCCAGCCGCA－3′。以PS04菌株總DNA為模板，擴增目的片段。擴增程序：94℃，5 min；94 ℃，30 s，55 ℃，40 s，72℃，100 s，30個循環(huán)；72℃，10 min。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，交由上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.3.3 序列分析 根據(jù)測序結(jié)果，在NCBI上通過BLAST比對，從GenBank中搜索相關(guān)種的公認16S rDNA標準序列數(shù)據(jù)，用Clustal X 1.8進行多序列比對分析，利用 MEGA 4.1的Neighbor－joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 液體發(fā)酵培養(yǎng)基及流程

1.4.1 培養(yǎng)基 斜面、種子、發(fā)酵培養(yǎng)基均采用察氏培養(yǎng)基 ，p H 6.0。

1.4.2 發(fā)酵流程

培養(yǎng)過程中每6 h采用干重法測定經(jīng)提取純化的多糖含量；培養(yǎng)48 h，將所有培養(yǎng)液中多糖提取純化［13］，冷凍干燥后進行黏度性質(zhì)測定。

1.4.3 干重法測定多糖含量 測定步驟：① 取錫箔紙，折成凹狀，編號，于105℃烘2 h至恒重，用鑷子夾取入干燥器，待冷卻后于分析天平上稱重 （W1），精確到小數(shù)后4位。② 取2 m L發(fā)酵液加入2倍體積的95%乙醇，入10 m L離心管，充分混勻4℃下靜置30 min。③4 000 r／min下離心15 min，去除上清。加入5 m L乙醇靜置10 min，同條件下離心，去上清。④將離心管中沉淀用鑷子輕輕夾起放入準備好的錫箔紙中，105℃下在烘箱中烘至恒重，放入干燥器冷卻，帶室溫，稱重（W2），精確到小數(shù)點后4位。W2與W1的差值即為多糖重量。

1.5 多糖的黏度性質(zhì)及影響因素

1.5.1 多糖溶液制備 精密稱取定量多糖粉末，溶于去離子水中，攪拌均勻，于4℃下溶脹過夜，恢復至室溫待測。

1.5.2 轉(zhuǎn)速回環(huán)試驗 按照方法1.5.1配制濃度為0.5%的多糖溶液。利用黏度計控制軟件RHEOCALC編輯程序，設(shè)制轉(zhuǎn)速從5 r／min連續(xù)增加到100 r／min，之后立即連續(xù)降低至5 r／min，用4號轉(zhuǎn)子于室溫下測定黏度的變化值。

1.5.3 多糖濃度與溶液黏度的關(guān)系 按照1.5.1配制不同濃度的多糖及黃原膠溶液。設(shè)定轉(zhuǎn)速為250 r／min，用4號轉(zhuǎn)子于室溫下測定溶液黏度。

1.5.4 溫度變化對多糖溶液黏度的影響 按照1.5.1配制濃度為0.5%與1.0%的多糖及黃原膠溶液。采用5號轉(zhuǎn)子，轉(zhuǎn)速250 r／min，測定不同溫度下多糖及黃原膠溶液的黏度。

1.5.5 p H值對多糖溶液黏度的影響 按照1.5.1配制濃度為0.5%的多糖及黃原膠溶液。用HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)p H值，設(shè)定轉(zhuǎn)速為250 r／min，用4號轉(zhuǎn)子于室溫下測定不同p H值時溶液的黏度值。

1.5.6 不同金屬離子對多糖溶液黏度的影響 按照1.5.1配制多糖溶液，精密稱取藥品，溶于去離子水，攪拌均勻，與多糖溶液混合（多糖溶液終濃度為0.3%，金屬離子濃度為0.1 mol／L），攪拌均勻并靜置4～6 h，使溶液充分平衡。設(shè)定轉(zhuǎn)速為250 r／min，用3號轉(zhuǎn)子于室溫下測定溶液的黏度。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株P(guān)S04菌落、菌體形態(tài)和生理生化鑒定

PS04菌株在培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，形成3 mm左右菌落，菌落呈圓形，隆起，表面光滑，邊緣整齊，濕潤，呈白色透明狀。經(jīng)光學顯微鏡觀察菌株細胞呈桿狀，寬度0.6～0.8μm，長度2～4μm。革蘭氏染色均勻，且為陽性，產(chǎn)生芽孢。其生理生化鑒定見表1，與多粘類芽孢桿菌（paenibacillus polymyxa）符合。

表1 PS04菌株部分生理生化特征Table 1 Partly biochemical and physiological characteristics of the strain PS04

2.2 菌株P(guān)S04的16S r DNA鑒定

菌株P(guān)S04的PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 菌株P(guān)S04的PCR產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Electrophoresis pattern PCR product of PS04

菌株P(guān)S04的16S r DNA基因核苷酸序列全長為1 463 bp，將該序列提交Gene Bank進行Blast同源性序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，親緣關(guān)系相近的序列為類芽孢桿菌屬，達到98%以上。利用MEGA 4.1的Neighbor－joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，經(jīng)過1 000次隨機抽樣計算Bootstrap值，得到系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2。結(jié)果表明該菌株與Paenibacillus polymyxaWY110達到98%以上的同源性。結(jié)合形態(tài)學與生理生化特征綜合比較，可以確定菌株P(guān)S04在分類學地位上是歸屬于多粘類芽孢桿菌（paenibacillus polymyxa）。

圖2 基于16S rDNA構(gòu)建的菌株P(guān)S04系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 2 Phylogenetic tree based on the polygenetic analysis of 16S rDNA sequences showing the position of strain PS04

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物

按1.4.2發(fā)酵流程得到發(fā)酵產(chǎn)物為PS04粗多糖（13.3 g／L），白色粉末狀物質(zhì)，溶水后形成黏性溶液。該溶液加熱并冷卻至室溫不形成凝膠。

2.4 多糖的黏度性質(zhì)及其影響因素

2.4.1 PS04多糖溶液的剪切稀釋性能 黃原膠溶液隨著剪切速率增加，黏度下降，該現(xiàn)象表明PS04多糖溶液為典型的假塑性流體［14］。PS04多糖溶液在一定的濃度及轉(zhuǎn)速下，黏度不隨時間變化而變化，因此PS04多糖溶液不屬于觸變性流體。通過試驗發(fā)現(xiàn)，PS04多糖溶液的黏度隨著轉(zhuǎn)速增加而降低，當轉(zhuǎn)速達到35r／min，黏度下降速度平緩，表明PS04多糖溶液具有剪切稀釋性能；當轉(zhuǎn)速達到100 r／min后，隨轉(zhuǎn)速降低，溶液黏度逐漸增大（見圖3）。該曲線以x＝100 r／min為對稱軸，兩邊對稱，這表明PS04多糖溶液黏度恢復無滯后性。

圖3 轉(zhuǎn)速對PS04多糖黏度的影響Figure 3 Effects of rotation speed on viscosity of PS04 polysaccharide solution

2.4.2 PS04多糖黏度與濃度的關(guān)系 由圖4可知，PS04多糖溶液的黏度隨濃度的增加而增大，當濃度較高時黏度增幅尤其顯著。當PS04多糖濃度大于0.8%時，其黏度比相同條件下黃原膠黏度高，低濃度時則略低于黃原膠。與黃原膠類似，PS04多糖具有低濃度高黏度的特征，因此也具有良好的增稠性能。

圖4 濃度對PS04多糖和黃原膠黏度的影響Figure 4 Effects of concentration on viscosity of PS04 polysaccharide and xanthan solution

2.4.3 溫度對PS04多糖溶液黏度的影響 PS04多糖及黃原膠溶液的黏度隨溫度變化的結(jié)果見圖5。由圖5可知，1.0% 的多糖溶液在溫度低于70℃的條件下，黏度變化不大；升溫到90℃，黏度略有降低，從而表明PS04多糖溶液具有良好的耐溫性。結(jié)果同時表明，在低濃度時，PS04多糖穩(wěn)定性略低于黃原膠，而較高濃度則與黃原膠相當甚至比黃原膠更加穩(wěn)定。

2.4.4 p H值對PS04多糖溶液黏度的影響 p H值的變化對PS04多糖溶液黏度的影響見圖6。

圖5 溫度對PS04多糖和黃原膠黏度的影響Figure 5 Effects of tempertrue on viscosity of PS04 polysaccharide and xanthan solution

圖6 p H對PS04多糖和黃原膠黏度的影響Figure 6 Effects of p H on viscosity of PS04 polysaccharide and xanthan solution

由圖6可知，從p H 3.0到高堿性條件下，溶液黏度逐漸增加，但增加幅度不大。雖然與黃原膠相比，p H 3.0以上的酸堿性對PS04多糖溶液黏度影響相對較大，但仍可以看出，這種多糖具有較好的耐酸堿性。

2.4.5 金屬離子對PS04多糖溶液黏度的影響 由圖7可知，在測試濃度下（0.3%），離子對PS04多糖溶液的黏度影響不明顯，表明該多糖具有良好的耐鹽性。

圖7 金屬離子對PS04多糖黏度的影響Figure 7 Effect of different ions on viscosity of PS04

3 結(jié)論

結(jié)合菌體菌落形態(tài)學特征、生理生化特征以及16S rDNA核酸序列分析，菌株P(guān)S04屬于多粘類芽孢桿菌。其發(fā)酵產(chǎn)生的PS04多糖具有黃原膠類似的性質(zhì)，屬于假塑性非牛頓型流體，具有低濃度高黏度的特征，因此具有良好的增稠性能。在不同的溫度、p H值條件下，PS04多糖溶液穩(wěn)定性好。添加不同種類金屬離子對PS04多糖溶液（0.3%）的黏度影響不大。

黃原膠是應(yīng)用最成功的微生物多糖之一，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、印染、化妝品、石油開采等多個領(lǐng)域。PS04多糖在黏度性質(zhì)方面與黃原膠較為相近，有些甚至優(yōu)于黃原膠，而且PS04菌株具有極強高產(chǎn)多糖的潛力，通過進一步的研究，如果能降低生產(chǎn)成本，PS04多糖完全有可能在部分領(lǐng)域成為黃原膠的替代品或在其他領(lǐng)域有新的應(yīng)用。

1 徐致遠，周凌華，王蔭榆.卡拉膠、瓜兒豆膠與果膠復配在酸奶中的應(yīng)用［J］.乳業(yè)科學與技術(shù)，2009，32（139）：259～262.

2 朱莉，王麗平，秦方.黃原膠對維生素C穩(wěn)定性影響的研究［J］.食品與機械，1996（6）：31～32.

3 劉梅森，何唯平，陳勝利.一種含活性乳酸菌的酸奶軟冰淇淋的研制［J］.食品與機械，2005，21（6）：73～75.

4 李龍偉，閆鎖.黃原膠與卡拉膠復配在果凍中的應(yīng)用研究［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（17）：342～343.

5 何建新.花生、大豆、蓮子復合蛋白飲料的加工工藝［J］.食品與機械，1999（3）：27～28.

6 林煒鐵，昝繼清.微生物絮凝劑 MBF－18的絮凝特性［J］.化工進展，2010，29（226）：1 186～1 190.

7 Slaveykova V I，Parthasarathy N，Dedieu K，et al.Role of extracellular compounds in Cd－sequestration relative to Cd uptake by bacteriumSinorhizobium meliloti［J］.Environmental Pollution，2010，158（8）：2 561～2 565.

8 Chang Z Q，Lee J S，Gebru E，et al.Mechanism of macrophage activation induced by beta－glucan produced fromPaenibacillus polymyxaJB115［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications，2010，391（3）：1 358～1 362.

9 布坎南R E，吉本斯N E.伯杰細菌鑒定手冊［M］.中國科學院微生物研究所，譯.第8版.北京：科學出版社，1984：740～741.

10 蔡妙英，東秀珠.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，2001：57～59.

11 戈登R E，海恩斯 W C，帕格C H.芽孢桿菌屬［M］.蔡妙英，譯.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1983：7～49.

12 潘康成，馮興，崔恒敏，等.利用16S r DNA序列對兩種芽孢桿菌的鑒定［J］.中國獸醫(yī)科學，2009，39（382）：550～554.

13 劉瑞君，李鳳珍.多粘芽孢桿菌204產(chǎn)生的高粘性多糖性質(zhì)的研究［J］.微生物學雜志，1990（4）：34～38.

14 Barbara Katzbauer.Properties and applications of xanthan gum［J］.Polymer Degradation and Stability，1998，59：81～84.

Identification of an exopolysaccharide－producing bacteria and study on properties of polysaccharide

TIAN Wen－Xiang1，2JIAN Hua－l11YANG You－Hui1LIAO Mei－de3

（1.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong510642，China；2.Guangdong Yifang Pharmaceutical Co LTD，F(xiàn)oshan，Guangdong528244，China；3.College of Natural Resources and Environment，South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong510642，China；）

Strain PS04 producing exopolysaccharide was isolated from the soil samples that were collected from the South China Agricultural U－niversity Botanic Insecticides Garden.It was identified as a Paenibacillus polymyxa by its morphological，the physiological and biochemical properties and 16S r DNA sequence analysis.Using Czapek’s medium，the exopolysaccharide production was up to 13.3 g／L by fermentation under the condition of temperature 37℃and p H 6.0.The properties of the polysaccharide were investigated.Like Xanthan Gum，this polysaccharide was distinguished by its high viscosity with low concentration，pseudoplasticity and salt－tolerance，at the same time，the polysaccharide was stable to heating，acid and alkali.

paenibacillus polymyxa；exopolysaccharide；16S r DNA；identification；viscosity property

田文祥（1986－），男，碩士。E－mail：zhongguotian1986＠163.com

楊幼慧

2011－11－01

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.01.043