自然發(fā)酵辣椒醬中乳酸菌的分離與鑒定

沙 漠 逄煥明 古麗娜孜 李 靜 殷 勇 楊海燕

（新疆農業(yè)大學食品科學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

自然發(fā)酵辣椒醬中乳酸菌的分離與鑒定

沙 漠 逄煥明 古麗娜孜 李 靜 殷 勇 楊海燕

（新疆農業(yè)大學食品科學學院，新疆 烏魯木齊 830052）

從自然發(fā)酵的辣椒醬中分離出產(chǎn)酸量高、生長良好的菌株，經(jīng)過形態(tài)學鑒定、生理生化特性及發(fā)酵性能試驗，最終選定Lact.1和Lact.2兩株適用于發(fā)酵辣椒試驗的乳酸菌。鑒定結果表明Lact.1為植物乳酸桿菌 （Lactobacillus planetarium），Lact.2 為 腸 膜 明 串 珠 菌 （Leuconostoc mesenteroides）。試驗結果表明兩株乳酸菌產(chǎn)酸速度快，最適生長溫度在30℃到40℃之間，最適生長p H 6.0，當食鹽濃度在7%以下能生長。

發(fā)酵辣椒；乳酸菌；分離鑒定

目前，市面銷售的辣椒制品主要有辣椒醬、辣椒粉及干辣椒等傳統(tǒng)粗加工制品方面，而發(fā)酵型辣椒醬在銷售中又占有相對較大的比重［1］。傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒醬生產(chǎn)，主要利用辣椒醬中存在的天然乳酸菌進行發(fā)酵，產(chǎn)生乳酸，再在辣椒醬中加入一定量的食鹽，食鹽的高滲透作用使得辣椒醬中大部分雜菌的生長受到抑制，從而發(fā)酵制成辣椒醬［2］。其獨特的風味深受人們的喜愛［3，4］。傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒醬普遍存在著一些問題：食鹽的含量過高（過多的食用食鹽會造成某些器官如腎脈、心血管系統(tǒng)的永久性損傷［5］），質量不穩(wěn)定，在保藏和使用的過程中質構易軟化、表面易“生花”等［6，7］。

乳酸菌發(fā)酵食品是一種國內外消費者所喜愛的營養(yǎng)保健食品［8，9］。發(fā)酵蔬菜用的生產(chǎn)菌株主要是乳酸菌，篩選出專用于發(fā)酵辣椒的乳酸菌種對于在發(fā)酵辣椒醬生產(chǎn)中縮短生產(chǎn)周期、提高食品安全性和穩(wěn)定產(chǎn)品質量起著關鍵性的作用［10，11］。為此，本試驗從自然發(fā)酵的辣椒醬中篩選出發(fā)酵辣椒專用乳酸菌株，并對菌株進行了生產(chǎn)性能的測試和鑒定，意在實現(xiàn)發(fā)酵辣椒的安全化、工業(yè)化生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 乳酸菌種分離源

辣椒：新疆輕工國際投資有限公司。

1.1.2 試劑

蛋白胨，牛肉膏，酵母提取物，乙酸鈉，葡萄糖，K2HPO4，瓊脂，檸檬酸二銨，吐溫80，硫酸鎂，碳酸鈣等：均為分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

乳酸菌富集培養(yǎng)基［9］：牛肉膏1%、蛋白胨1%、葡萄糖5%、酵母膏0.5%、溴甲基酚紫0.04%、K2HPO40.2%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸銨0.2%、硫酸鎂0.02%、吐溫80 0.1%，瓊脂1.5%、p H 6.6，121℃滅菌30 min。用作乳酸菌的初步富集。

乳酸菌分離培養(yǎng)基［9］：碳酸鈣單獨滅菌后，在葡萄糖2%的MRS的固體培養(yǎng)基滅菌后溫度降至45℃左右時，再加入碳酸鈣，并充分震蕩混勻。用作乳酸菌的分離使用。

乳酸菌斜面保存培養(yǎng)基［9］：葡萄糖2% 的 MRS固體培養(yǎng)基。

1.1.4 儀器與設備

精密p H計：PHS－3C型，上海精密科學儀器有限公司；電子顯微鏡：XS－18型，江南光學儀器廠；

生物安全柜：HR40－ⅡA2型，青島海爾特種電器有限公司；

滅菌鍋：LD2X－40BI型，上海申安醫(yī)療器械廠；

電子恒溫培養(yǎng)箱：DPH－9162型，上海一恒科技有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH－S型，金壇市醫(yī)療器械廠；

可見分光光度計：VIS－7220G型，上海軟茂儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種的分離

（1）乳酸菌的富集：在無菌條件下操作，吸取自然發(fā)酵辣椒醬汁5 m L接種于富集培養(yǎng)基中，置于35℃的恒溫培養(yǎng)箱，靜置培養(yǎng)48 h，用于乳酸菌的分離。

（2）乳酸菌的分離、純化：將富集培養(yǎng)樣品用無菌生理鹽水稀釋至合適的濃度，吸取0.1 m L涂布于分離培養(yǎng)基平板上，35℃恒溫培養(yǎng)48～72 h。挑取可產(chǎn)酸的菌落，進行反復的分離、純化。至純菌落為止。將所獲菌落菌株編號、保存?zhèn)溆茫?2，13］。

1.2.2 形態(tài)特征鑒定

（1）菌落形態(tài)觀察：仔細觀察平板培養(yǎng)基上菌落的形態(tài)特征，分離單菌落并記錄結果。

（2）菌株革蘭氏染色：將所分離的單菌落進行革蘭氏染色，于100倍的油鏡下觀察。

1.2.3 生化特性 純化后菌株進行產(chǎn) H2O2試驗、產(chǎn)H2S試驗、甲基紅試驗、明膠液化試驗、糖發(fā)酵試驗。

乳酸的定性分析：取上述發(fā)酵液約5 m L于試管中，加入10%H2SO41 m L，再加入2%KMnO4溶液1 m L，此時乳酸轉化為乙醛，把事先在含氨的Ag NO3溶液中浸泡的濾紙條搭在試管上，微火加熱至沸，濾紙變黑則說明其有乳酸存在［14－16］。

1.2.4 生理特性

（1）溫度對乳酸菌產(chǎn)酸能力的影響：所篩菌株接種MRS液體培養(yǎng)基中，分別于0，10，20，30，40，50，60 ℃培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液p H值并用分光光度計測 OD值［17，18］。

（2）乳酸菌產(chǎn)酸能力：將篩選的乳酸菌株分別接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)36 h，每隔4 h測定發(fā)酵液p H值并用可見分光光度計測OD 值［17，18］。

（3）耐酸性試驗：所篩菌株接種于不同p H值的MRS培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)48 h，分光光度計測OD值，確定各菌株的最適生長 p H 值［17，18］。

（4）食鹽濃度對乳酸菌生長的影響：在 MRS液體培養(yǎng)基 中分別 加 入 1%，3%，5%，7%，9%，11%，13% 的 食 鹽，所篩菌株分別接種于上述培養(yǎng)基，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中，靜置培養(yǎng)48 h，測定發(fā)酵液p H值可見分光光度計測OD值［17，18］。

2 結果與分析

2.1 菌株形態(tài)學特征

從新疆輕工國際投資有限公司提供的辣椒中共分離、純化得到17株疑似乳酸菌種，經(jīng)菌落形態(tài)特征觀察和菌株革蘭氏染色（表1）觀察發(fā)現(xiàn)，Lact.1（圖1）和Lact.2（圖2）菌株均為革蘭氏陽性，從形態(tài)學角度初步判定兩株菌均為乳酸菌。

表1 菌落形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of colony

圖1 Lact.1菌體特征（×1 000）Figure 1 Shape character of Lact.1（×1 000）

圖2 Lact.2菌體特征（×1 000）Figure 2 Shape character of Lact.2（×1 000）

2.2 菌株生化特性

對菌株進一步進行生化特性鑒定結果見表2、3。

由表2可知，菌株Lact.1和Lact.2符合乳酸菌不液化明膠，甲基紅試驗陽性，發(fā)酵不產(chǎn)H2S、H2O2、葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乳酸的要求。

綜合上述菌落形態(tài)學特征及生化特性并參考文獻［19］，可發(fā)現(xiàn)Lact.1與植物乳酸桿菌（L.p），Lact.2與腸膜明串珠菌（L.m）所具有的特性一致。

表2 菌落生化特性+Table 2 Biochemical properties of 2 screened strains

2.3 菌株生理特性

2.3.1 最適生長溫度 由圖3可知，兩菌株在40℃左右時的光密度值最大，此時的p H值也是最低，所以兩菌株的最佳生長溫度在30℃到40℃之間。在20℃以下，45℃以上都不生長。因此，35℃作為測定產(chǎn)酸能力、耐酸能力、耐鹽能力等試驗的培養(yǎng)溫度。

2.3.2 產(chǎn)酸能力 由圖4可知，這兩株乳酸菌的產(chǎn)酸速度較快，p H值在36 h后降到4.0左右。所接種乳酸菌產(chǎn)酸速度越快，p H值下降的速度也就越快，抑制雜菌的能力也就越強，這樣不但大大縮短了辣椒的發(fā)酵周期，而且降低了產(chǎn)品中的亞硝酸鹽的含量，提高了發(fā)酵辣椒的質量。從圖4還可看出，OD值在24 h之內就上升到0.5左右，說明所選育出的兩株乳酸菌繁殖和產(chǎn)酸的速度是非?？斓摹?/p>

表3 糖發(fā)酵試驗結果Table 3 Sugar fermentation of 2 screened strains

圖3 Lact.1、Lact.2生長溫度曲線Figure 3 Cave of growth temperature of Lact.1，Lact.2

圖4 Lact.1、Lact.2產(chǎn)酸速度曲線Figure 4 Cave of acid producing of Lact.1，Lact.2

圖5 p H對2菌株生長的影響Figure 5 Effect of p H value on the growth of two strains hour

圖6 食鹽濃度對乳酸菌生長的影響Figure 6 Effect of salt concentration on the growth of two strains

2.3.3 耐酸性 由圖5可知，Lact.1與 Lact.2兩株乳酸菌在p H值低于5.0和大于9.0時還能有微弱的生長，當p H值低于3.0或大于9.0時，生長基本停止。由此可知，兩株菌的最適生長p H值在6左右。

2.3.4 耐鹽性 由圖6可知，Lact.2對鹽濃度更敏感一些，而Lact.1相對耐鹽一些。各菌株在食鹽的濃度在7%左右都能生長，當食鹽的濃度達到9%以后，所有的菌株都受到抑制。

3 結論

（1）通過對分離菌株的形態(tài)及生化特性的研究，并參考文獻［19］最終選定Lact.1和Lact.2兩株適用于發(fā)酵辣椒試驗的優(yōu)勢乳酸菌株。鑒定結果表明Lact.1為植物乳酸桿菌（Lactobacillus planetarium），Lact.2 為 腸 膜 明 串 珠 菌（Leuconostoc mesenteroides）。

（2）兩菌株的生理特性試驗研究結果表明：Lact.1和Lact.2產(chǎn)酸速率大于其他分離菌株，鹽濃度在7%以下時都可生長，最適生長溫度在30℃到40℃之間，在p H值為6的環(huán)境中生長速度最快。

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Isolation and identification of lactic acid bacteria from natural fermentation peppers

SHA Mo PANG Huan－ming GU Linazi LI Jing YIN Yong YANG Hai－yan

（College of Food Science，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang830052，China）

Strains of lactic acid bacteria with producing high－yield lactic acid and well－growing were isolated from naturally fermented peppers.Systematic identification in morphology，physiology and biochemistry，fermentation performance choose that Lact.1 and Lact.2 for chili－jam fermentation.The results indicated that Lact.1 wasLactobacillus planetariumand Lact.2 wasLeuconostoc mesenteroides.Lact 1 and Lact 2 had good lactic acid productivity in the optimum temperature between 30℃to 40℃and the optimum p H 6.0 and could grow well in the salt concentration of 7%.

fermented pepper；lactic acid bacteria；separation and identification

10.3969／j.issn.1003－5788.2012.01.008

國家科技人員服務企業(yè)行動項目（編號：

SQ2009GJG40006）

沙漠（1986－），男，新疆農業(yè)大學在讀碩士研究生。E－mail：498398739＠qq.com

楊海燕

2011－10－11