蛋白質“酶解度”概念的探究

劉寶全，王劍鋒，李春斌，范圣第

(大連民族學院生物化學工程－國家民委－教育部重點實驗室，遼寧大連 116605)

蛋白質“酶解度”概念的探究

劉寶全，王劍鋒，李春斌，范圣第

(大連民族學院生物化學工程－國家民委－教育部重點實驗室，遼寧大連 116605)

分析了蛋白質水解度參數(shù)在監(jiān)測蛋白質酶解過程中的不足，并根據(jù)蛋白質酶解過程特點提出了酶解度的概念與測定方法。將酶解度定義為一個比值，用于描述蛋白質酶解體系中新增肽鏈數(shù)相對于原有肽鏈數(shù)的變化，可以有效反映酶對蛋白質的酶切過程。根據(jù)酶解度的定義，只要分別測定出酶解前的體系中肽鏈數(shù)目與酶解后體系中的肽鏈增量，通過計算兩者的比值就可以計算出該條件下的酶解度。體系中的肽鏈數(shù)目可以通過甲醛滴定法測定出體系中的游離氨基數(shù)與新增游離氨基數(shù)來計算。

酶解度(DEH);蛋白質;酶;水解

蛋白質可以在酸(或堿)的作用下水解形成氨基酸，用于氨基酸制備或蛋白質的組成氨基酸鑒定分析。在利用酸(或堿)水解蛋白質進行氨基酸工業(yè)生產(chǎn)的過程中，為監(jiān)測蛋白質的水解程度，提出了蛋白質水解度(Degree of hydrolysis，DH)的概念［1－2］。水解度通常用蛋白質全部肽鍵被水解的百分比表示，即已經(jīng)水解的肽鍵占蛋白質水解前肽鍵總數(shù)的百分比［1－2］。本文作者在從事蛋白質酶解過程研究中發(fā)現(xiàn)，在進行未知蛋白質(尤其是少數(shù)民族地區(qū)的特色資源中的蛋白質組分)的酶解實驗時，根本無法找到相關的數(shù)據(jù)用于計算體系中的蛋白質底物的肽鍵數(shù)目，利用蛋白質水解度不能很好地開展未知蛋白質的酶解進程，由此特別提出了蛋白質的酶解度概念，從而為蛋白質酶解過程分析提供一種新的更有效的方法打下基礎。

1 利用水解度監(jiān)測蛋白質酶解過程的不足

蛋白質的酸(或堿)水解與蛋白質酶解的最大區(qū)別在于，酸(或堿)水解對氨基酸序列沒有選擇性，而酶(特別是內(nèi)切酶)酶解對蛋白質的氨基酸序列有選擇性，只能在特定的位置上進行氨基酸鏈的切割。為了便于計算，以一個由1 001個氨基酸構成的蛋白質為例，在進行酸堿水解時，酸(或堿)可以在任一位置斷裂肽鍵，最后得到構成該蛋白的各種氨基酸;每水解一個肽鍵，其水解度就增加0.1%，最后達到100%。

蛋白質的酶解與酸(或堿)水解不同，酶對蛋白質底物有氨基酸排列順序的要求。構成蛋白質的氨基酸有20種，如果隨機排列，某一個特異的三氨基酸排列出現(xiàn)的機率只有1/8 000。假設上述由1 001個氨基酸組成的蛋白中有100個某個特異性內(nèi)切酶的識別位點(這在真實蛋白中是不可能的);用這種酶對該蛋白質進行水解時，最終的水解度最大值也僅有10%，還有90%的肽鍵未被水解。對底物序列有高度選擇性的Xa因子(識別與切割序列為:－Ile－Glu－Gly－Arg↓X)，在重組蛋白中只有一個人為添加的識別與切割位點，如果也是對一個由1 001個氨基酸組成的重組蛋白進行切割，水解度最高也只有0.1%;當研究酶解動力學時，各種因素對水解度的影響必定都在0.1%以內(nèi);如果底物蛋白質中肽鍵的一半都被酶解時，其水解度也僅為0.05%。

用水解度研究蛋白質的酶解過程，不僅因水解度非常低而造成表述問題，還有一個關鍵的制約因素，那就是:如果要計算蛋白質水解度，就一定要先測定出蛋白質中的肽鍵總數(shù)(即組成氨基酸數(shù)目)。這對于全部序列已知的重組蛋白來說較為容易，對于從生物體分離出來的非重組蛋白則較為困難，大多數(shù)天然蛋白質都不知道其準確的氨基酸組成，一般都要經(jīng)過復雜的蛋白質分子量分析與氨基酸組成分析，才能知道其準確的肽鍵數(shù)目。所以要測未知蛋白的酶解，一般只做分子量分析，再根據(jù)氨基酸的平均分子量，估算蛋白的氨基酸組成數(shù)目，進而計算蛋白質的水解度。此時計算出的水解度不能是一個精確的數(shù)據(jù)。

針對利用水解度研究蛋白質酶解過程中存在的數(shù)值低、計算肽鍵總數(shù)困難的兩點不足，我們提出了蛋白質的酶解度概念。

2 蛋白質酶解度的定義

蛋白質是由氨基酸通過肽鍵依次連接構成的線性結構，一端是游離的氨基，另一端為游離的羧基。當?shù)鞍踪|發(fā)生酶解時，蛋白質中的一個肽鍵被水解，就形成一個新的游離氨基與一個新的游離羧基;同時多肽鏈由一條變?yōu)閮蓷l，每一條新肽鏈都有一個原來的游離氨基(或羧基)和一個新形成的游離羧基(或氨基)。所以可以利用游離的氨基(或羧基)來監(jiān)測蛋白質的酶解進程，并依此定義蛋白質的酶解度(Degree of enzymatic hydrolysis，DEH)。蛋白質酶解度(DEH)是指酶解體系中新增肽鏈總數(shù)與酶解前肽鏈總數(shù)的比值。

式中，AN表示體系中的游離氨基總數(shù)，A取自英文單詞amount，N代表蛋白質氨基末端，下角標0表示反應起始階段，下角標1表示酶解反應進程中第一次取樣測定結果。同理，也可以用AC代表體系中的游離羧基總數(shù)，DEH的計算公式更替為

由于蛋白質酶解時，要向體系中添加蛋白酶;而蛋白酶本身也有游離氨基與游離羧基，在測定酶解進程時，要將體系中蛋白酶的游離氨基(或羧基)扣除，所以計算公式修正為

式中，ANE和ACE分別代表體系中添加的蛋白酶的游離氨基和游離羧基數(shù)目。

為簡化計算，僅以一條蛋白質多肽鏈進行酶解分析。當一條多肽鏈進行酶解時，發(fā)生一次酶解，其酶解度DEH通過式(3)或式(4)計算可知，DEH值為1;2次酶解時，DEH值為2;3次酶解時，DEH值為3。從以上結果可知，利用蛋白質酶解度能非常好地體現(xiàn)酶解進程。

在實際計算過程中，式(3)與式(4)可以變形為

在計算公式中，ANE、AN0、ACE、AC0均在反應前進行測定，在酶過程中是常數(shù)，反應進程監(jiān)測主要是測定AN1或AC1。當酶的濃度遠遠小于蛋白質底物濃度時，ANE/AN0和ACE/AC0可以忽略不計，蛋白質的酶解度計算公式簡化為

根據(jù)簡化式(7)和式(8)，只要測出酶解后體系中的多肽鏈數(shù)目與反應前的多肽鏈數(shù)目比，就可以非常簡便地算出酶解度。這在利用分光光度法測定中非常有用，只要在測定體系的線性范圍內(nèi)，可以直接利用光吸收值進行DEH值計算，使反應監(jiān)測更易于進行。

3 蛋白質酶解度的甲醛滴定法測定

進行蛋白質酶解度測定，不需要將樣品完全水解，只要能有效測定反應體系中的多肽鏈數(shù)目變化，就可以計算蛋白質的酶解度。確定反應體系中的多肽鏈數(shù)目，最重要的方法是測定體系中的游離氨基數(shù)目。在蛋白質水解度測定的相關方法［1］中，只要能有效測定反應體系中氨基或羧基數(shù)目，都可以用于蛋白質酶解度的測定。下面重點介紹簡便易行的甲醛滴定法。

甲醛滴定法［2－3］的基本原理是利用甲醛與多肽鏈中的游離氨基結合形成羥甲基衍生物，使原來與氨基結合的氫離子解離出來，再用標定的堿進行滴定，新消耗的標定堿的摩爾數(shù)就是體系中新增加游離氨基的摩爾數(shù)。一般選用酚酞做滴定指示劑，分別測定添加甲醛前后滴定到酚酞變色時的標定堿的用量，即可計算出體系中因加入甲醛而釋放的氫離子摩爾數(shù)，從而計算出體系中新增的游離氨基數(shù)目。具體的操作方法將在下期的“甲醛滴定法測定牛血清白蛋白的酶解度”論文中詳細論述。

雖然蛋白質側鏈中的游離氨基會造成測定的初始多肽鏈數(shù)目偏高，但是在根據(jù)式(3)計算新增加游離氨基數(shù)目時，蛋白質側鏈中的游離氨基對測量結果的干擾可以通過2次測定值相減(AN1－AN0－ANE)而有效消除。利用甲醛滴定法可以較為準確地計算出反應前后體系中的游離氨基的數(shù)目變化，進而通過計算酶解度來監(jiān)測蛋白質的酶解進程。

［1］徐英操，劉春紅.蛋白質水解度的測定方法綜述［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(7):173 －176.

［2］徐勤，葛向陽，劉建峰.甲醛法測大豆蛋白水解度的改進［J］.飼料工業(yè)，2008，29(5):46－47.

［3］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術［M］.北京:高等教育出版社，1997.

Exploration of Conception of Degree of Enzymatic Hydrolysis

LIU Bao－quan，WANG Jian－feng，LI Chun－bin，F(xiàn)AN Sheng－di
(Key Laboratory of Biochemistry Engineering of the State Ethnic Affairs Commission－Ministry of Education，
School of Life Science，Dalian Nationalities University，Dalian Liaoning 116605，China)

The major defects of DH(degree of hydrolysis)were discussed，and the conception and determination methods of DEH(degree of enzymatic hydrolysis)were developed in this article.The DEH was defined as a ratio between the addition of peptide chains and the amounts of origin peptide chains of the protein in enzymatic system to determine the degree of enzymatic hydrolysis of protein.When the amounts and addation of peptide chains were determined and calculated，the value of DEH would obtained according to the conception of DEH.The amounts of free amino groups，determined by formol titration，could be used to calculate the value of DEH.Key words:degree of enzymatic hydrolysis;protein;enzyme;hydrolysis

Q519

A

1009－315X(2012)01－0009－03

2011－10－27

教育部科學技術研究重點項目(2010－263);國家民委項目(09DL08);遼寧省教育廳資助項目(2009A154);大連民族學院引進人才啟動基金資助項目(20096102)。

劉寶全(1972－)，男，蒙古族，遼寧北票人，講師，博士，主要從事化學與生物學交叉學科研究。

(責任編輯 鄒永紅)