姜蓉中分離棲冷克呂沃爾菌生理生化特性及還原硝酸鹽的研究

陳血建，蘭全學(xué)，嚴(yán)瓊英，楊俊，陳晶，葉秀玲，楊國武

(深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測研究院，廣東深圳，518131)

蔬菜是人們?nèi)粘ｏ嬍持斜夭豢缮俚?，它為人體提供必需的多種維生素、礦物質(zhì)和纖維素，同時(shí)，蔬菜也容易富集硝酸鹽。據(jù)報(bào)道，人體攝入的硝酸鹽有81.2%來自蔬菜［1］，蔬菜經(jīng)不正確的放置和處理后，其中的硝酸鹽會(huì)在微生物的作用下被還原成亞硝酸鹽［2］，亞硝酸鹽通過與血紅蛋白反應(yīng)導(dǎo)致人體缺氧、與次級(jí)胺結(jié)合則可誘發(fā)癌癥。據(jù)報(bào)道，自然界能還原硝酸鹽的細(xì)菌有百余種［3］，了解這些細(xì)菌的特性，對(duì)于我們正確存放和處理蔬菜，減少亞硝酸鹽的攝入具有指導(dǎo)意義。

筆者在對(duì)餐飲企業(yè)食品的亞硝酸鹽項(xiàng)目監(jiān)測中，分離得到1株棲冷克呂沃爾菌，本文對(duì)該菌的生理生化特性以及該菌在還原硝酸鹽及在姜蓉亞硝酸鹽產(chǎn)生中發(fā)揮的作用進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

棲冷克呂沃爾菌，從深圳市某餐飲企業(yè)提供的一份沙拉原料即用嫩姜姜蓉(亞硝酸鹽含量160 mg/kg，以N計(jì))中分離得到。

血瓊脂平板，鄭州安圖綠科生物工程有限公司;營養(yǎng)肉湯、平板計(jì)數(shù)瓊脂(PCA)，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;硝酸鹽和亞硝酸鹽快速測定試劑條(反應(yīng)墊上為固體格利斯試劑對(duì)氨基苯磺酰胺和N-1萘基乙二胺)，美國Industrial Test Systems公司;Vitek2 GN鑒定卡，法國生物梅里埃公司。

VITEK2 Compact全自動(dòng)微生物鑒定儀，法國生物梅里埃公司;SHP-250生化培養(yǎng)箱，中國上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 棲冷克呂沃爾菌的來源

以1份亞硝酸鹽含量為160 mg/kg(以N計(jì))的仔姜姜蓉為材料，涂布血瓊脂平板和PCA平板，在37℃下分別置于需氧、微需氧、厭氧條件培養(yǎng)3～6 d，從兩種平板中挑取菌落形態(tài)占優(yōu)勢的菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)和生化鑒定，獲得棲冷克呂沃爾菌。

1.2.2 棲冷克呂沃爾菌的生理生化特性分析

對(duì)棲冷克呂沃爾菌革蘭氏染色，并用全自動(dòng)微生物鑒定儀VITEK 2 Compact進(jìn)行生化鑒定。同時(shí)，將該菌株接種于硝酸鹽肉湯生化管中，37℃培養(yǎng)24 h，加入硝酸鹽還原甲、乙液，觀察顏色變化，檢測該菌能否還原硝酸鹽。

1.2.3 棲冷克呂沃爾菌在不同冷藏溫度的生長特性

將濃度分別為102、104、106CFU/mL的棲冷克呂沃爾菌營養(yǎng)肉湯(pH 7.0、NaCl濃度為0.5%)分別置于1℃、4℃、8℃條件下培養(yǎng)，每日采用傾注平板法測定菌懸液細(xì)菌濃度。

1.2.4 棲冷克呂沃爾菌在不同鹽濃度的生長特性

配制NaCl濃度為0.5%、1%、2%、5%的營養(yǎng)肉湯(pH 7.0)，分別加入棲冷克呂沃爾菌，使菌懸液濃度為102CFU/mL，置于8℃培養(yǎng)，每日采用傾注平板法測定菌懸液細(xì)菌濃度。

1.2.5 棲冷克呂沃爾菌在不同pH值的生長特性

配制 pH 4.0、5.0、6.0、7.0 的營養(yǎng)肉湯(NaCl濃度為0.5%)，分別加入棲冷克呂沃爾菌，使菌懸液濃度為102CFU/mL，置于8℃培養(yǎng)，每日采用傾注平板法測定菌懸液細(xì)菌濃度。

1.2.6 棲冷克呂沃爾菌模擬污染試驗(yàn)

將8個(gè)不同產(chǎn)地的仔姜品種機(jī)械粉碎制成姜蓉，100℃蒸汽處理30 min，污染棲冷克呂沃爾菌，使姜蓉的細(xì)菌濃度數(shù)量級(jí)為105CFU/g，置于8℃培養(yǎng)，每日監(jiān)測姜蓉中亞硝酸鹽含量和細(xì)菌濃度。各品種均設(shè)置不加細(xì)菌的空白對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 棲冷克呂沃爾菌的生理生化特性

棲冷克呂沃爾菌在血瓊脂平板和PCA平板上均形成圓形、光滑、濕潤的白色菌落，菌落直徑約1～2 mm，無溶血現(xiàn)象。革蘭氏染色呈陰性桿菌，多單個(gè)散在，無芽孢，菌體大小為(0.5～0.7)μm×(2～3)μm。全自動(dòng)微生物鑒定儀VITEK 2 Compact生化鑒定結(jié)果見表1。該菌為兼性厭氧菌，可使硝酸鹽肉湯顏色變?yōu)榧t色，能還原硝酸鹽。

表1 棲冷克呂沃爾菌生化鑒定結(jié)果

2.2 棲冷克呂沃爾菌在不同冷藏溫度的生長特性

由圖1～圖 3可見，初始濃度為 102、104、106CFU/mL的棲冷克呂沃爾菌營養(yǎng)肉湯，在1℃培養(yǎng)時(shí)，未見明顯生長，12d內(nèi)細(xì)菌濃度變化甚小;在4℃培養(yǎng)時(shí)，102、104CFU/mL濃度的棲冷克呂沃爾菌開始出現(xiàn)緩慢生長現(xiàn)象，達(dá)到107CFU/mL濃度所需要的時(shí)間分別為22d、11d;106CFU/mL濃度的棲冷克呂沃爾菌生長迅速，達(dá)到107CFU/mL濃度所需要的時(shí)間為2d;在8℃培養(yǎng)時(shí)，3種初始濃度的棲冷克呂沃爾菌達(dá)到108CFU/mL濃度僅需要7 d、4 d、2 d。

2.3 棲冷克呂沃爾菌在不同鹽濃度的生長特性

圖1 棲冷克呂沃爾菌生長試驗(yàn)結(jié)果(1℃)

由圖4可見，當(dāng)NaCl濃度為0.5%、1%、2%時(shí)，棲冷克呂沃爾菌緩慢生長，在培養(yǎng)7～9d后濃度可升高至107CFU/mL，最高可達(dá)到108CFU/mL;當(dāng)NaCl濃度為5%時(shí)，該菌會(huì)逐漸死亡，在培養(yǎng)4d后全部死亡。

圖2 棲冷克呂沃爾菌生長試驗(yàn)結(jié)果(4℃)

圖3 棲冷克呂沃爾菌生長試驗(yàn)結(jié)果(8℃)

圖4 棲冷克呂沃爾菌在不同鹽濃度的生長試驗(yàn)結(jié)果(8℃)

2.4 棲冷克呂沃爾菌在不同pH值的生長特性

由圖5可見，在pH4.0條件下，棲冷克呂沃爾菌呈逐漸死亡趨勢，在培養(yǎng)13d后全部死亡;在pH5.0、6.0、7.0條件下，菌株緩慢生長，在培養(yǎng)的第5～6d菌液濃度可達(dá)到107CFU/mL。

圖5 棲冷克呂沃爾菌在不同pH環(huán)境下的生長試驗(yàn)結(jié)果(8℃)

2.5 棲冷克呂沃爾菌模擬污染試驗(yàn)

由表2、表3可見，8個(gè)品種姜蓉在污染棲冷克呂沃爾菌后，3個(gè)品種姜蓉在第4天開始檢出亞硝酸鹽，4個(gè)品種姜蓉在第5天開始檢出亞硝酸鹽，廣東大姜檢出亞硝酸鹽的時(shí)間相對(duì)較遲，在第8天才檢出;其中紅芽姜的亞硝酸鹽含量在第7天高達(dá)160 mg/kg(以N計(jì))。各品種姜蓉所達(dá)到的亞硝酸鹽峰值與其本身的硝酸鹽含量不成正相關(guān)。

測定亞硝酸鹽含量的同時(shí)監(jiān)測8個(gè)品種姜蓉中棲冷克呂沃爾菌的菌落數(shù)量變化。由表2、表4可見，多數(shù)姜蓉在細(xì)菌濃度達(dá)到107CFU/g時(shí)開始檢出亞硝酸鹽，在細(xì)菌濃度達(dá)到108CFU/g時(shí)，亞硝酸鹽含量達(dá)到峰值。8個(gè)未加細(xì)菌的對(duì)照姜蓉在12 d內(nèi)均未檢出亞硝酸鹽。

表2 不同姜蓉的亞硝酸鹽濃度隨時(shí)間變化結(jié)果(8℃)

表3 不同姜蓉初始硝酸鹽含量和亞硝鹽峰值

3 結(jié)論與討論

本文分析了從1份亞硝酸鹽含量較高的姜蓉中分離的1株棲冷克呂沃爾菌?？藚挝譅柧?981年獨(dú)立成屬的腸桿菌科細(xì)菌，存在于食物、土壤和污水中［4-5］。目前，國內(nèi)外只有極少量的關(guān)于克呂沃爾菌引起臨床感染病例的報(bào)道，未見到棲冷克呂沃爾菌引起蔬菜中亞硝酸鹽大量積聚的報(bào)道［4-8］。本文研究表明，該菌能還原硝酸鹽，在4～8℃可大量生長繁殖，適宜生長的 NaCl濃度為0.5% ～2%，pH值為5.0～7.0，模擬污染試驗(yàn)證實(shí)，該菌可以把姜蓉中的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。污染了棲冷克呂沃爾菌的各品種姜蓉，最初亞硝酸鹽含量極低，經(jīng)過一段時(shí)間后緩慢上升，隨菌株的大量繁殖而迅速達(dá)到峰值，然后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，這一現(xiàn)象與其他文獻(xiàn)報(bào)道相似［1，8-11］。

我國食品衛(wèi)生法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)GB2762規(guī)定，蔬菜中亞硝酸鹽限量指標(biāo)為≤4 mg/kg［13］。本文研究結(jié)果提示，通過控制冷藏溫度、食鹽濃度及pH值可有效防止棲冷克呂沃爾菌在蔬菜中生長繁殖，避免由該菌大量繁殖引起亞硝酸鹽大量積累。

有文獻(xiàn)指出，姜中含有線性和環(huán)狀的二苯基庚烷類化合物，該類化合物具有抗氧化性，能抑制氧分子自由基的生成，從而對(duì)亞硝酸鹽的產(chǎn)生有一定程度的阻斷作用［13-14］。本研究中，污染棲冷克呂沃爾菌的各品種姜蓉所達(dá)到的亞硝酸鹽峰值，與其初始硝酸鹽含量不成正相關(guān)，結(jié)果提示姜蓉在模擬污染試驗(yàn)中產(chǎn)生的亞硝酸鹽主要與棲冷克呂沃爾菌的大量繁殖有關(guān)，還可能與姜蓉中二苯基庚烷類化合物等其他因素有關(guān)。

表4 不同姜蓉中細(xì)菌濃度隨時(shí)間變化結(jié)果(8℃)

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