超高壓促進β-環(huán)糊精向大米顆粒內(nèi)部的有效滲入*

劉莉，趙建偉，焦愛權(quán)，田耀旗，周星，徐學(xué)明，金征宇

1(江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫，214122)

2(江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇無錫，214122)

隨著經(jīng)濟的發(fā)展、生活節(jié)奏的加快，方便食品越來越受到人們的青睞［1］。方便米飯是一種新興食品，不僅滿足即食方便的要求，而且作為一種主食產(chǎn)品，彌補其他方便食品營養(yǎng)單一的不足。方便米飯營養(yǎng)豐富符合現(xiàn)代人的消費理念，具有廣闊的發(fā)展前景，但其在存儲過程中硬度增加，黏度降低，從而使口感變差和消化性降低。因此抑制回生是改善方便米飯品質(zhì)，延長貨架期的首要因素。

回生問題可通過采取各種有效措施來延緩，但不能完全抑制。相關(guān)文獻報道［2-6］多集中于物理抗性修飾，即添加抗淀粉回生的食品添加劑，如低聚糖、親水性膠體和乳化劑等。低聚糖β-環(huán)糊精(β-CD)分子尺寸小，易溶于水，在淀粉糊化過程中，可隨著水分滲透進入淀粉顆粒的內(nèi)部，與淀粉分子相互作用。在淀粉短期回生過程中，β-CD外壁親水性羥基與直鏈淀粉α-單螺旋外層羥基以氫鍵作用力結(jié)合形成絡(luò)合物，抑制游離的直鏈淀粉快速滲透于支鏈淀粉結(jié)晶區(qū)而有序重排，起到回生延緩作用［3］。在通常蒸煮條件下，抑制回生的添加劑難以滲透到大米顆粒內(nèi)部，滲透效果程度較低，抗回生效果并不理想。

熒光示蹤法是添加便于追蹤的色素或熒光物質(zhì)來觀察、研究和闡明某物質(zhì)在指定過程中的行為或性質(zhì)的一種標(biāo)記方法。熒光示蹤技術(shù)的關(guān)鍵是制備熒光標(biāo)記聚合物。通過采用電腦多媒體技術(shù)配合熒光顯微鏡，建立了熒光示蹤系統(tǒng)，對樣本進行連續(xù)逐層掃描，得到細胞或組織內(nèi)部細微結(jié)構(gòu)的熒光圖像［7-8］。

本文采用在大米浸泡液中添加β-CD，并用超高壓處理以期減少米飯回生程度。本文用高效液相色譜法(HPLC)定量檢測大米浸泡液中β-CD的殘留量和用示蹤法來跟蹤β-CD滲入溫水浸泡米粒中的分布情況。

1 材料與方法

1.1 原料、試劑與儀器

粳米(福臨門響水香米)，市購，水分含量為15.31%(w.b.)，購回后儲藏在4℃的冰箱中。

β-CD，上海西寶生物科技有限公司;β-CD標(biāo)樣，Sigma-Aldrich公司;葡萄糖淀粉酶，無錫杰能科生物有效公司;豬胰 α-淀粉酶，sigma公司;1，8-二羥基蒽醌，上海晶純試劑有限公司;OCT(opti-mum cutting temperature)包埋劑，上海西塘生物公司;其他所有試劑均為分析純。

蒸汽蒸煮器，由小型滅菌鍋改造;立式蒸煮袋，市購;超高壓設(shè)備(HP800Mpa/3L)，包頭科發(fā)高壓科技有限公司;高效液相色譜儀(Water 600)，美國water公司;NH2柱，美國Thermo公司;紅外光譜儀(NICOLET NEXUS 470)，美國Thermo公司;激光共聚焦顯微鏡(LSM 710)，德國Lavision Biotec;柜式冰凍切片機(Micron HM560)，上海倍曼生物有限公司。

1.2 方法

本研究在米粒浸泡液中添加β-CD/包合物，并用不同壓強處理浸泡液。一方面因大米顆粒成分復(fù)雜，直接測定滲入的β-CD不易，故采用間接的方法用HPLC測定米粒浸泡液中β-CD含量;另一方面選擇適宜的熒光分子與 β-CD包埋來示蹤 β-CD在500MPa下向大米顆粒內(nèi)部的滲入分布情況。本實驗方法流程圖如圖1:

圖1 實驗方法流程圖

1.2.1 制備殘留β-CD的大米浸泡液

實驗?zāi)康氖侵苽湓诔汉统邏簤簭娤绿砑?%的β-CD的大米懸浮液中含殘留β-CD的浸泡液。將1 g β-CD溶于75 mL超純水，加大米50 g，到立式鋁箔食品袋后真空封裝。然后在常壓60℃的浸泡30 min，然后四組樣品分別在0，100，300和500 MPa(溫度為40℃)下浸泡20 min，收集各組的浸泡液。

將4組的浸泡液分別倒入標(biāo)有記號的錐形瓶中，然后4次用50 mL的超純水沖洗米粒表面上殘留的浸泡液一并收集到對應(yīng)的錐形瓶中。在浸泡液中加入1 000 u/mL的葡萄糖淀粉化酶3 μL，在37℃的恒溫振蕩水槽中振蕩3 h。隨后，各組浸泡液定容到350 mL，在100℃下電磁攪拌10 min，5 000 r/min離心15min，收集各組浸泡液的上清液，進行高效液相色譜(HPLC)定量檢測樣品中β-CD的含量。

1.2.2 高效液相色譜法(HPLC)測定β-CD的含量

液相是Waters 600，使用氨基柱，示差折光檢測器，流動相是 V(乙腈)∶V(水)=70∶30，柱溫 30℃，流速 1 mL/min，進樣量 10 μL。

取大米浸泡的上清液10 mL樣品經(jīng)微孔過濾器過濾(孔徑0.45 μm)，進 HPLC分離，得到流出峰。依據(jù)標(biāo)樣的峰面積計算大米浸泡液中β-CD含量。

β-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)樣品配制:精密稱量β-環(huán)糊精標(biāo)樣10.00 mg，置10.0 mL量瓶中，加水適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成1 mg/mL濃度的溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)液。

1.2.3 固體包合物的制備和表征

將充分干燥的約4 g的β-CD溶于約70～80℃的500 mL熱水中，待β-CD全部溶解后加入約0.8 g的1，8-二羥基蒽醌，于50℃下攪拌12 h，逐步降溫，待析出黃色晶體后減壓過濾，用溫水洗滌干燥，所得產(chǎn)物為 β-CD 與 1，8-二羥基蒽醌的包合物［7-8］。在相同條件下分別做1，8-二羥基蒽醌、β-CD、β-CD 與1，8-二羥基蒽醌混合物、β-CD 與 1，8-二羥基蒽醌包合物的紅外光譜。制樣方法:KBr壓片法;掃描次數(shù)32次分辨率4 cm-1。同時做2% β-CD與1，8-二羥基蒽醌包合物溶液的差示掃描量熱譜，溫度掃描20-100℃，升溫速率5℃/min。

1.2.4 激光共聚焦顯微鏡掃描觀察

將5 g大米于立式鋁箔小蒸煮袋中，在7.5 mL大米浸泡液中添加2%的包合物，在60℃的溫水中浸泡30 min。超高壓樣品在500 MPa，40℃的超高壓條件下浸泡20 min。因米粒冰凍切片易破碎保持不完整性，所以將米飯繼續(xù)進行蒸煮軟化。米粒放在立式蒸熟袋中封裝，在沸水浴中蒸煮7 min，燜飯10 min，冷卻至室溫。將常壓處理和超高壓處理的米飯進行OCT包埋后放置在-18℃冷凍約3 h。在-30℃下冰凍切片，切片厚度為30 μm。各組樣品在相同的條件下用激光共聚焦掃描觀察。

激光共聚焦掃描條件為掃描模式:平行;物鏡:Zeiss EC Plan Neofluar 20X/0.50 M27;分光鏡:MBS488/543(MBS_InVis:plate FW1:NonelLSW);激光:543 nm;像素停留時間:2.33 μs;濾光器:554～697;X 軸縮放:1.661 μm;Y 軸縮放:1.661 μm。對切片小區(qū)域逐一掃描，然后自動拼成米飯切片完整的熒光圖像。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相法(HPLC)測定米粒浸泡液中的β-CD含量

在設(shè)定的分析條件下，對1 mg/mL的β-CD的標(biāo)樣和分別在0、100、300和500 MPa(溫度40℃，時間20 min)的米粒浸泡液進行分離定量測定。試驗結(jié)果如圖2所示，β-CD在保留時間11.00 min處開始出峰，β-CD的含量在常壓對照組中最高，不同壓強條件下β-CD的含量存在顯著性差異?？梢钥吹?，隨著處理壓強的增大，浸泡液中殘留的β-CD含量減少，則進入米粒中的β-CD逐漸增多。在所有樣品的浸泡液中都添加了2%的β-CD即1.0 g，常壓對照組浸泡液在常壓下殘留量為0.86 g，說明用4次超純水沖洗浸泡米粒后，米粒表面吸附有少量的β-CD或進入米粒顆粒。在500 MPa處理下，浸泡液中的β-CD含量顯著減少，僅為0.424 g。較之常壓對照組，在500 MPa下浸泡處理的米粒多滲入了約0.436g β-CD。滲入米粒的β-CD的含量隨超高壓壓強增加而增多。通過HPLC法定量測定不同壓強下浸泡液中的β-CD的分析結(jié)果可看出，β-CD在超高壓條件下可以滲入60℃溫水預(yù)浸泡的米粒內(nèi)部。

圖2 β-環(huán)糊精標(biāo)準(zhǔn)品和不同壓強下處理大米浸泡液的高效液相色譜圖

表1 常壓下和不同壓強下浸泡液中殘留的β-環(huán)糊精含量

2.2 包合物鑒定和表征

圖3 β-CD和1，8-二羥基蒽醌的紅外吸收光譜圖

比較圖3中各紅外吸收圖譜發(fā)現(xiàn)，β-CD和1，8-二羥基蒽醌的的紅外吸收圖譜有明顯差別。在1 600 cm-1附近的苯環(huán)骨架振動和1670 cm-1附近的C=O伸縮振動可以明顯地看到1，8-二羥基蒽醌的特征峰。對照于β-CD，包合物圖譜中臨近C=O的CH3在1 370 cm-1有中等強度的吸收峰(對稱彎曲振動)，說明有新物質(zhì)的介入使其出現(xiàn)新峰。包合物較之于物理混合物，1，8-二羥基蒽醌的許多吸收峰被掩蓋，并且在1 670 cm-1附近的C=O伸縮振動的吸收峰有所增強，說明有新物質(zhì)產(chǎn)生，可能是因為β-CD包合1，8-二羥基蒽醌，使1，8-二羥基蒽醌的構(gòu)象發(fā)生變化。

2.3 包合物溶液熱學(xué)性質(zhì)

從圖4可看出β-CD-1，8-二羥基蒽醌包合物曲線出現(xiàn)一個吸熱峰，在66.87℃ -80℃處為包合物的分解吸熱帶。在水分子競爭作用下，隨著溫度的增大，β-CD與1，8-二羥基蒽醌間的氫鍵作用力越來越弱，而與水分子間的作用力越來越強。包合物從66.87℃開始慢慢解體，最后在80℃處分解大致完成。1，8-二羥基蒽醌不溶于水，包合物易溶于水，且熒光強度增加［8］。包合物添加到浸泡液中，在低于66.87℃下，溫水浸泡和超高壓浸泡處理中包合物都不容易發(fā)生分解。在蒸汽蒸煮過程中，即使包合物發(fā)生可逆反應(yīng)釋放1，8-二羥基蒽醌，由于不溶于水不易進入米粒而對實驗造成干擾。米飯內(nèi)部已進入的包合物部分發(fā)生分解釋放出1，8-二羥基蒽醌，同樣也具有熒光性，對米飯切片顯微鏡觀察亦不造成影響。所以從DSC圖，可以看β-CD-1，8-二羥基蒽醌包合物可以作為超高壓處理過程中β-CD滲入的示蹤劑，用來示蹤β-CD在超高壓處理中的滲入分布情況。

圖4 2%β-CD與1，8-二羥基蒽醌的包合物溶液的差示掃描量熱圖

2.4 激光共聚焦顯微鏡觀察

圖5 為在常壓和超高壓不同浸泡條件下的米飯橫截面切片掃描圖。

圖5 A，B為常壓處理的米飯切片C，D和E為超高壓500 MPa浸泡處理的米飯切片(白色箭頭所示為米飯內(nèi)部的縫隙)

從圖5中可以看出，米飯切片的內(nèi)部有若干條黑色的細長條，推測為米飯顆粒內(nèi)的縫隙。在切片過程中冰凍刀片切割力的作用使得米粒內(nèi)縫隙有進一步增大的可能。米飯切片的邊緣若干處有強熒光性，說明米飯在熒光包合物溶液中浸泡殘留了一些熒光物質(zhì)在米飯表面。從圖5觀察到，從米飯切片的外圍部分到中心處，熒光強度并非由強依次減弱。這說明包合物在超高壓處理下進入到米粒內(nèi)部的滲透不局限于通過擴散運動而停滯在米粒表面外部。為了進一步探討米粒間的縫隙是否存在，即考察包合物進入米飯的途徑，用豬胰α-淀粉酶溶液來水解米飯。實驗發(fā)現(xiàn)淀粉酶并不是一圈一圈地水解米飯，米飯表層各部分水解程度不一樣，凹凸不平，甚至有些米飯被水解地支離破碎(圖6)。說明米粒內(nèi)的縫隙是存在的，縫隙是從米粒表面通向米粒內(nèi)部，淀粉酶正是通過這些裂縫滲透，不斷地水解大米淀粉分子。

谷物中淀粉顆粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)、谷物顆粒間的裂紋分布和硬度分布決定了水滲透的路徑和速度。Horigane［9］等通過三維加權(quán)梯度回波磁共振成像技術(shù)監(jiān)測米粒浸泡過程中水分的滲透路徑。研究日本普遍食用的Koshihikari米粒浸泡時，水分子首先穿透米粒的腹側(cè)表面和胚芽附著位點，然后沿著胚乳中央線和橫向裂紋遷移，最終擴散到胚乳的其它部分。帶白點的Yamadanishiki大米在浸泡時，除了在最開始時水分快速滲透進裂縫處或背腹邊的白堊部分，水滲透的位點和水分擴散模型跟前者是相似的。因此無論是普通米粒還是帶白點有胚芽的米粒，米粒內(nèi)部的裂縫處和中央部分存在一個非常松散的結(jié)構(gòu)、空腔或裂紋，可以允許更多的水滲透保留。水分滲透主要是通過米粒表面到內(nèi)部的縫隙、胚乳部分的中央線和橫向裂紋擴散到米粒胚乳其他部分。

圖6 淀粉酶水解米飯前后對照圖

超高壓處理的米飯切片中間部分的熒光強度明顯高于常壓處理米飯，且熒光物質(zhì)多集中于米粒切片內(nèi)部縫隙的淀粉大顆粒附近。實驗表明超高壓處理大大加強了包合物向米粒內(nèi)部的滲透作用。Ahrmrit等［10］通過大量實驗統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)超高壓處理可促進浸泡大米的水分滲透，并且水分滲入量與超高壓壓強、溫度和時間條件成正相關(guān)。同時超高壓進一步破壞米粒的硬質(zhì)纖維［11］，有利于包合物充分進入米粒內(nèi)部。β-CD包合物分子尺寸小，易溶于水，在超高壓外力強制滲透浸泡及淀粉糊化過程中，可隨著水分滲透沿著米粒表面處的裂紋、胚乳中央線和橫向裂紋遷移，最終擴散到胚乳的所有部分。隨著淀粉糊化進行，淀粉顆粒內(nèi)結(jié)晶區(qū)域則由原來排列緊密有序的狀態(tài)變?yōu)槭杷呻s亂狀態(tài)，包合物與淀粉分子相互作用。從以上的分析可知，β-CD可通過超高壓處理充分滲透到米粒內(nèi)部，從而使得有效抑制大米淀粉的回生成為可能。

3 結(jié)論

(1)通過HPLC液相法定量檢測常壓和不同超高壓壓強處理下米粒浸泡液中殘留β-CD含量，實驗結(jié)果表明隨著壓強的增大，浸泡液中β-CD的殘留量減少，從而說明β-CD超高壓浸泡處理能有效促進β-CD到米粒內(nèi)部。

(2)β-CD來包埋1，8-二羥基蒽醌制備成的包合物具有強熒光性，可示蹤β-CD在超高壓條件下的滲入情況，對照常壓浸泡的米飯切片可看出，超高壓浸泡米飯切片內(nèi)部熒光強度強于未處理米粒，說明超高壓處理確實能有效滲透β-CD米飯內(nèi)部。

(3)超高壓浸泡米飯切片的熒光物質(zhì)主要集中在米飯中間部分的縫隙處，在米飯內(nèi)部分布較為均勻，具有強熒光性。

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