由L-精氨酸發(fā)酵液制備結(jié)晶型精酮合劑

李琪倩，李恒，陸震鳴，許泓瑜，方佳茂，許正宏，孫志浩，史勁松

1(江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，江蘇無(wú)錫，214122)2(廣東環(huán)西生物科技股份有限公司，廣東普寧，515300)

L-精氨酸-α-酮戊二酸鹽(L-arginine-α-ketoglutarate，AAKG)，簡(jiǎn)稱精酮合劑，是由 L-精氨酸(L-Arg)與α-酮戊二酸(α-KG)絡(luò)合形成的氨基酸鹽，可以從溶液中以鹽的形式結(jié)晶析出。在不同的結(jié)晶條件下，AAKG可以形成單精氨酸酮戊二酸鹽(MAAKG)和雙精氨酸酮戊二酸鹽(DAAKG)兩種形式，目前研究和應(yīng)用較多的主要是MAAKG，其晶型為無(wú)色棱柱狀，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮、乙醚等，在水溶液中能夠完全解離為L(zhǎng)-精氨酸和α-酮戊二酸。本文研究的AAKG均指MAAKG，其結(jié)構(gòu)式如下:

AAKG不僅兼具L-精氨酸和α-酮戊二酸的生理功能，而且可以作為功能性營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和護(hù)肝藥物應(yīng)用于臨床，主要用于增強(qiáng)體格、促進(jìn)肌肉的快速增長(zhǎng)和創(chuàng)傷恢復(fù)［1－3］，促進(jìn)肝細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)和能量的代謝，增強(qiáng)力量和精力，其生理機(jī)制在于AAKG能夠在短期內(nèi)提高體內(nèi)NO的水平，增強(qiáng)蛋白質(zhì)同化作用。目前，AAKG作為功能食品在國(guó)際市場(chǎng)上銷量日益增加，并與鳥(niǎo)苷酸酮戊二酸鹽(OKG)一起，在醫(yī)學(xué)、營(yíng)養(yǎng)、運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域備受重視。

AAKG的制備工藝主要有3種方式:1是直接混合法，是將等摩爾的L-精氨酸、α-酮戊二酸粉末進(jìn)行簡(jiǎn)單的混合而成，其制備方法簡(jiǎn)單，成本較低，是商品化生產(chǎn)最為通用的方法。但該法生產(chǎn)的AAKG不是結(jié)晶型產(chǎn)品，二者之間沒(méi)有鹽鍵結(jié)合，產(chǎn)品質(zhì)量受到原料的品質(zhì)、混合的均勻度影響;2是凍干法，先將L-精氨酸、α-酮戊二酸粉末進(jìn)行等摩爾混合并溶解，再將溶液冷凍干燥成為凍干粉，該工藝能夠得到相對(duì)穩(wěn)定的結(jié)晶型AAKG，但存在晶型不可控、凍干過(guò)程能耗大等問(wèn)題，一般僅適合 AAKG 注射劑生產(chǎn)［1－2，4］;3是結(jié)晶法，一般是將L-精氨酸、α-酮戊二酸按比例混溶后，通過(guò)溶液濃縮，加入有機(jī)溶劑、降低溫度等方法，使AAKG以晶體形式析出，其產(chǎn)品純度高，質(zhì)量可控。相比而言，混合法和凍干法，在制備過(guò)程中不能夠去除原料帶入的雜質(zhì)，對(duì)原料品質(zhì)有著較高的要求，而結(jié)晶工藝是一個(gè)能有效去除雜質(zhì)的精制過(guò)程，因而能夠使用純度相對(duì)較低的原料，甚至是低濃度的發(fā)酵液。本文在研究結(jié)晶法制備AAKG工藝基礎(chǔ)上，直接利用 L-Arg發(fā)酵液為原料，進(jìn)行結(jié)晶型AAKG的制備。由于制備路線可以繞開(kāi)L-精氨酸提取環(huán)節(jié)的離子吸附、洗脫、濃縮和結(jié)晶操作，因而具有工藝流程簡(jiǎn)捷、綜合成本低等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

L-精氨酸(L-Arg，醫(yī)藥級(jí))，購(gòu)自上海斐雅科技發(fā)展有限公司;α-酮戊二酸(α-KG，醫(yī)藥級(jí))，購(gòu)自武漢銀河化工有限公司。檢測(cè)使用的標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 主要儀器

電熱恒溫水槽(DK-80)，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(RE-52A)，上海亞榮生化儀器廠;型真空干燥箱(DZF-6050)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;液相色譜儀(Dionex UltiMate 3000)，美國(guó)戴安公司;5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐(Biotech-2001)，上海保興生物設(shè)備工程有限公司。

1.3 AAKG結(jié)晶工藝研究

1.3.1 基本步驟

在50 mL，0.5～1.0 mol/L的L-Arg溶液中，緩慢加入一定量的α-KG粉末，攪拌使其完全溶解，減壓濃縮至濃度為1.5～3.0 mol/L。濃縮液以一定速率緩慢降溫，置于5～15℃下恒溫結(jié)晶24～48 h。待結(jié)晶完全后，分離晶體，并用少量冷乙醇淋洗晶體2～3次，置于40℃下真空干燥得到結(jié)晶型AAKG。

1.3.2 L-Arg和α-KG的混溶比例對(duì)AAKG晶體組成影響

研究上述制備工藝中α-KG與L-Arg的混溶比例，分別考察 α-KG:L-Arg 為 0.8、1.0、1.2、1.4、1.6時(shí)，結(jié)晶形成的AAKG晶體中L-Arg和α-KG的摩爾比影響。

1.3.3 起晶濃度對(duì)AAKG晶體收率和晶體純度的影響

減壓濃縮L-Arg與α-KG混合溶液，控制不同的濃縮比例，分別考察 1.25、1.5、2.0、2.5、3.0(mol/L)溶液濃度對(duì)AAKG的結(jié)晶產(chǎn)率、晶體純度及晶體組成的影響。

1.3.4 降溫速率和結(jié)晶溫度對(duì)AAKG晶體收率和晶體純度的影響

分別考察5、10和15℃下AAKG的結(jié)晶收率和晶體純度情況，并比較快速降溫結(jié)晶(10℃/h)和緩慢降溫速率(2℃/h)對(duì)晶體結(jié)構(gòu)和晶體純度的影響。

1.4 L-Arg發(fā)酵液制備AAKG的工藝研究

以實(shí)驗(yàn)室篩選獲得的精氨酸高產(chǎn)突變株C.crenatum SYPH5－8為菌種進(jìn)行L-Arg發(fā)酵，采用5L自動(dòng)控制發(fā)酵罐。發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下:

葡萄糖150，玉米漿 40，(NH4)2SO420，KH2PO41.5，MgSO4·7H2O 0.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02，MnSO4·H2O 0.02，121℃滅菌20 min，流加氨水控制 pH 7.0～7.2。

發(fā)酵液預(yù)處理［5］:先加入過(guò)量草酸沉淀Ca2+，在60℃下加熱10 min沉淀蛋白質(zhì)后，在pH 10.0，30℃下用聚丙烯酰胺(400 mg/L)對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行絮凝，離心去除菌體等固形物后，再加入活性炭(10 g/L)，調(diào)節(jié)pH5.0，加熱至80℃進(jìn)行脫色處理30 min，最后經(jīng)過(guò)濾或離心得L-Arg清液。

結(jié)晶操作:將預(yù)處理后的L-Arg發(fā)酵液減壓濃縮至1 mol/L，加入α-KG固體粉末，反應(yīng)充分后，進(jìn)一步濃縮至1.5～3.0 mol/L，調(diào)節(jié)溶液pH 3.0～4.0，然后將濃縮液進(jìn)行緩慢降溫結(jié)晶?？疾旖Y(jié)晶的AAKG的產(chǎn)率，純度及晶體組成比。

1.5 AAKG晶體純度及組成比分析

AAKG在水溶液中解離為L(zhǎng)-Arg及α-KG，采用HPLC同時(shí)測(cè)定溶液中 L-Arg和 α-KG的含量。HPLC為Dionex UltiMate 3000液相色譜儀，色譜柱Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm)，流動(dòng)相采用甲醇/水/H3PO4(5/95/0.05)，進(jìn)樣體積 10 μL，流速 0.8 mL/min，柱溫30℃。采用紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

測(cè)試樣品AAKG晶體先在60～80℃下真空干燥8 h，稱取并配置成4 g/L溶液。樣品的HPLC色譜峰保留時(shí)間應(yīng)與L-Arg、α-KG標(biāo)準(zhǔn)品一致。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度和峰面積分別計(jì)算AAKG中L-Arg、α-KG的含量。AAKG晶體純度為晶體中L-Arg、α-KG的總含量與晶體質(zhì)量的百分比，晶體組成比為L(zhǎng)-Arg與α-KG的摩爾比。結(jié)晶操作中的AAKG晶體收率是指制備出的AAKG質(zhì)量與反應(yīng)液中L-Arg、α-KG的總含量的百分比。

1.6 AAKG的質(zhì)量指標(biāo)研究

AAKG純度、晶體組成比按上述方法進(jìn)行測(cè)定。水分按《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——食品中水分的測(cè)定》(GB5009.3－2010)中直接干燥法進(jìn)行測(cè)定;灰分按《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)——食品中灰分的測(cè)定》(GB5009.4－2010)一般食品的測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定;pH測(cè)定為0.1g樣品溶解在20 mL蒸餾水中的溶液pH，用pH計(jì)測(cè)量;比旋光度按《化學(xué)試劑-比旋光本領(lǐng)(比旋光度)測(cè)定》(GBT 613－2007)中通用方法測(cè)定，測(cè)定儀器選用WZZ-2B自動(dòng)旋光儀，樣品濃度為0.16g/mL(H2O)，旋光管長(zhǎng)度10 cm，溫度20℃，鈉光譜D線589.44波長(zhǎng)。

菌落總數(shù)按《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》(GB 4789.2－2010)進(jìn)行檢驗(yàn);大腸桿菌數(shù)按《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸桿菌計(jì)數(shù)》(GB/T 4789.38－2008)中“大腸桿菌MPN計(jì)數(shù)”進(jìn)行試驗(yàn);采用石墨爐原子吸收法及原子熒光光譜法對(duì)AAKG樣品中鉛，砷，汞重金屬含量進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 AAKG結(jié)晶工藝研究

L-Arg和α-KG均可溶于水中，但體系的不同pH值影響到二者的解離。L-Arg分子中基團(tuán)α-COOH的 pK1為2.17，α-NH+3的pK2為9.04，側(cè)鏈胍基上H的pK3為12.84。其PI主要決定于pK2和pK3，PI=(pK2+pK3)=10.94。因此，在小于pI的pH體系下，L-Arg主要是以α-NH+3形式存在。同樣，α-KG是有機(jī)二元酸，也存在二級(jí)解離情況。實(shí)驗(yàn)通過(guò)滴定法測(cè)定其pK1=1.88，pK2=2.35，顯然這2個(gè)解離常數(shù)相差較小，羧酸結(jié)合陽(yáng)離子能力較強(qiáng)，因此在與LArg成鹽時(shí)，單精氨酸鹽與雙精氨酸鹽均容易形成，但是否能夠從溶液中析出特定的晶體，還需要取決于他們的溶解度。

圖1 L-精氨酸的解離情況

pH是影響溶解度的主要因素之一，而溶液體系的pH與L-Arg和α-KG的含量和組成比例直接有關(guān)。在自然pH體系下，隨著二者摩爾分率的改變，體系pH也不斷變化，圖2顯示的是在1 mol/L L-Arg溶液中，不斷加入α-KG后，體系pH從10逐漸降低到2.3左右。初步結(jié)晶實(shí)驗(yàn)也表明，當(dāng)體系pH為3～4時(shí)，L-Arg與 α-KG較易形成 MAAKG晶體，而DAAKG晶體形成區(qū)域主要在pH 2.5～3.5，在上述范圍之外，很難通過(guò)結(jié)晶獲得AAKG晶體。要獲得特定組成的AAKG晶體，可以通過(guò)控制溶液體系中溶質(zhì)的摩爾分率達(dá)到調(diào)控體系pH的目的。實(shí)驗(yàn)以制備MAAKG為目的，具體考察了混溶比例，溶液濃度，結(jié)晶溫度及降溫速率對(duì)晶體收率和晶體純度的影響。

圖2 不同比例L-Arg與α-KG反應(yīng)，溶液pH變化情況

2.1.1 L-Arg和α-KG的混溶比例對(duì)晶體組成比影響

參照1.3.1的基本步驟，在50 mL的溶液中，考察α-KG∶L-Arg的摩爾比在0.8～1.6范圍內(nèi)AAKG晶體形成情況，表1數(shù)據(jù)顯示，從不同比例L-Arg和α-KG反應(yīng)，結(jié)晶制備出的AAKG的產(chǎn)率、純度及晶體組成比有較大的差異。當(dāng)反應(yīng)物中L-Arg和α-KG為1∶1定量添加的時(shí)候，制備出的AAKG產(chǎn)率和純度均較高，產(chǎn)率達(dá)到71.5%，純度達(dá)到92.7%，且晶體中L-Arg和α-KG的摩爾比與其他組比最接近1∶1，這是制備AAKG的優(yōu)化條件。

表1 L-Arg與α-KG反應(yīng)比例對(duì)AAKG結(jié)晶產(chǎn)率和純度的影響

2.1.2 溶液濃度對(duì)AAKG制備的影響

溶液的起晶濃度影響晶體的收率，也將對(duì)生產(chǎn)的能耗產(chǎn)生較大影響。實(shí)驗(yàn)通過(guò)控制不同的濃縮比，考察不同的起晶濃度對(duì)晶體產(chǎn)率、純度及晶體組成摩爾比的影響(表2)。隨著起晶濃度的提高，AAKG的產(chǎn)率也不斷提高，但當(dāng)溶液濃度超過(guò)2.50 mol/L時(shí)，進(jìn)一步濃縮將變得十分困難，而且將使雜質(zhì)濃度提高，降低晶體的純度。由于溶液濃縮是一個(gè)十分耗能的過(guò)程，在保證一定收率的基礎(chǔ)上，盡量降低蒸發(fā)量可以大幅度節(jié)能，因而從工業(yè)經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，適宜的起晶濃度為1.5 mol/L。更為優(yōu)化的方案應(yīng)該結(jié)合溶液的雜質(zhì)含量、產(chǎn)品純度要求以及后續(xù)的冷卻過(guò)程等多方面因素得出。

表2 不同起晶濃度對(duì)AAKG結(jié)晶產(chǎn)率和純度的影響

2.1.3 結(jié)晶溫度和降溫速率對(duì)AAKG制備的影響

冷卻結(jié)晶是通過(guò)降溫使溶液成為過(guò)飽和溶液而析出結(jié)晶，這是常用的結(jié)晶方法之一，尤其適合溶解度隨溫度降低而顯著下降的物質(zhì)。由于缺少AAKG的溶解度等相關(guān)數(shù)據(jù)，不能通過(guò)理論的推導(dǎo)確定冷卻結(jié)晶的控制參數(shù)。故實(shí)驗(yàn)研究了5℃、10℃、15℃下的AAKG結(jié)晶情況，并分別比較了快速降溫(10℃/h)和緩慢降溫(2℃/h)兩種方式對(duì)晶體收率、純度和晶體組成比的影響(表3)。

表3 結(jié)晶溫度和降溫速率對(duì)AAKG結(jié)晶產(chǎn)率和純度的影響

數(shù)據(jù)表明，低溫下的緩慢均勻的降溫結(jié)晶，可以獲得純度較高的AAKG晶體，而晶體產(chǎn)率、組成摩爾比沒(méi)有較大差異。在緩慢降溫結(jié)晶中，可以獲得顆粒較大的晶體顆粒，晶體的比表面積小，晶體表面對(duì)母液和雜質(zhì)的吸附也減少，因而可以增加產(chǎn)品純度。相比而言，快速降溫所形成的晶形較小，而且快速結(jié)晶過(guò)程中，容易形成母液的晶間包藏，使晶體純度下降。同樣，溶液的冷卻，尤其是10℃以下的冷卻也是一個(gè)耗能過(guò)程，在滿足工藝目標(biāo)的前提下，為降低能耗應(yīng)優(yōu)先選擇較高的結(jié)晶溫度，顯然在10℃進(jìn)行控溫結(jié)晶既具有良好的過(guò)程經(jīng)濟(jì)性，也可以獲得較為理想的收率和晶體純度。

2.2 L-Arg發(fā)酵液結(jié)晶制備AAKG的工藝研究

發(fā)酵法制備L-精氨酸是發(fā)展趨勢(shì)，與水解法相比其產(chǎn)品具有良好的安全性，但目前L-精氨酸發(fā)酵仍存在產(chǎn)酸率低、發(fā)酵周期長(zhǎng)等問(wèn)題。谷氨酸棒桿菌(C.crenatum)SYPH5－8是1株高產(chǎn)精氨酸的突變株，產(chǎn)酸水平在40 g/L左右，其發(fā)酵液中除了L-精氨酸外，還含有較多的Ca2+，殘余培養(yǎng)基成分及大量菌體，此外，還含有少量的谷氨酸、賴氨酸等副產(chǎn)物，在進(jìn)行結(jié)晶操作前，需要通過(guò)相對(duì)簡(jiǎn)捷的預(yù)處理工藝盡可能去除這些雜質(zhì)。實(shí)驗(yàn)采用草酸沉淀Ca2+及60℃下加熱10 min沉淀蛋白質(zhì)，用聚丙烯酰胺促進(jìn)菌體等固型物絮凝，用活性炭吸附發(fā)酵液中色素及少量雜氨酸。

由于發(fā)酵液的L-Arg含量較低，需要進(jìn)行濃縮。3.0 L發(fā)酵液濃縮至600 mL，離心去除溶液中少量的沉淀，測(cè)定濃縮液中L-Arg濃度為1.1 mol/L。參照AAKG的結(jié)晶工藝條件，按照等摩爾比例加入α-KG，待充分溶解后，進(jìn)一步濃縮至體積400 mL左右，達(dá)到起晶濃度，其L-Arg濃度約為1.68 mol/L。采用緩慢降溫方式使溶液冷卻至室溫，再置入8～10℃恒溫箱中育晶24 h。回收晶體，并采用乙醇進(jìn)行晶體洗滌，干燥后進(jìn)行含量及組成測(cè)定(結(jié)果見(jiàn)表4)。再取制備出的AAKG粗晶體50 g溶解在100 mL去離子水中，加熱充分?jǐn)嚢韬筮^(guò)濾。將濾液以上述同樣的條件進(jìn)行重結(jié)晶和乙醇洗滌，干燥后進(jìn)行含量及組成測(cè)定(結(jié)果見(jiàn)表4)。

表4 L-Arg發(fā)酵液制備的AAKG的產(chǎn)率，純度及L-Arg∶α-KG 的測(cè)定

由于母液中含有較多的雜質(zhì)，AAKG晶體純度較低，需要采用重結(jié)晶方式提高晶體純度。但重結(jié)晶操作影響AAKG收率，母液中含有較多的產(chǎn)品成分，在工業(yè)大生產(chǎn)中需要考慮回收與利用。綜合上述研究?jī)?nèi)容，本文初步提出由L-精氨酸發(fā)酵液制備AAKG晶體的工藝流程(圖3)。圖中所示的預(yù)處理包含上文提到的絮凝、活性炭吸附以及菌體分離等過(guò)程;濃縮操作可以采用減壓濃縮，也可以選擇反滲透等膜法濃縮，母液可以采用離子交換樹(shù)脂選擇性吸附，冷卻結(jié)晶可以選擇真空連續(xù)蒸發(fā)結(jié)晶器來(lái)提高結(jié)晶效率和晶體收率。

圖3 L-Arg發(fā)酵液進(jìn)行AAKG結(jié)晶流程示意圖

2.3 AAKG質(zhì)量指標(biāo)研究

對(duì)L-Arg發(fā)酵液制備出的4個(gè)批次的結(jié)晶型AAKG進(jìn)行理化指標(biāo)、衛(wèi)生指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。相關(guān)指標(biāo)符合我國(guó)食品衛(wèi)生質(zhì)量要求，而且指標(biāo)具有良好的穩(wěn)定性，因此，采用結(jié)晶法進(jìn)行AAKG制備，其質(zhì)量可控性較高。需要采用絮凝、吸附等方法進(jìn)行預(yù)處理，2是采用乙醇對(duì)晶體進(jìn)行洗滌，3是利用重結(jié)晶方法可以有效提高產(chǎn)品純度。

表5 AAKG的質(zhì)量指標(biāo)測(cè)定

本文提出從L-Arg發(fā)酵液直接制備AAKG，旨在繞開(kāi)L-精氨酸的提取過(guò)程，而該過(guò)程不僅使用大量的酸堿化學(xué)品，而且涉及大規(guī)模的樹(shù)脂吸附、洗脫和L-精氨酸的結(jié)晶、干燥，能耗物耗高，流程長(zhǎng)并與AAKG制備過(guò)程部分重復(fù)，因此將L-Arg發(fā)酵生產(chǎn)與AAKG的制備進(jìn)行耦聯(lián)，能夠有效縮短流程，減少排放，節(jié)省制備成本。更為重要的是，該生產(chǎn)路線能夠保證產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量穩(wěn)定性。但必須指出的是，對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行濃縮，也是一個(gè)高能耗的過(guò)程，為進(jìn)一步降低能耗，可以采用反滲透或納濾方法進(jìn)行膜法濃縮，也可以通過(guò)超濾等方式脫除溶液體系的大分子雜質(zhì)，這對(duì)提高過(guò)程效率和產(chǎn)品收率有顯著意義，將是下一步放大試驗(yàn)的重要研發(fā)內(nèi)容之一。

3 結(jié)果與討論

本文對(duì)影響AAKG結(jié)晶工藝的溶液pH、L-Arg與α-KG的投料比、起晶濃度以及冷卻方式進(jìn)行了初步探索，在此基礎(chǔ)上開(kāi)展了L-Arg發(fā)酵液直接進(jìn)行AAKG的結(jié)晶實(shí)驗(yàn)，獲得了純度高、品質(zhì)穩(wěn)定的結(jié)晶。研究認(rèn)為，AAKG結(jié)晶操作的關(guān)鍵控制參數(shù)是溶液的pH，在pH 3～4較易形成MAAKG晶體，而L-Arg與α-KG適宜的投料比是1∶1;本研究還從減少能耗和提高工業(yè)經(jīng)濟(jì)性角度，提出適宜的起晶濃度為1.5 mol/L，適宜的結(jié)晶溫度是10℃左右，而緩慢的降溫操作有利于提高晶體純度。以L-Arg發(fā)酵液為原料進(jìn)行AAKG結(jié)晶，為提高晶體純度和結(jié)晶效率，1是

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