中東部湖區(qū)營養(yǎng)物基準(zhǔn)推薦值的生態(tài)毒理學(xué)評價(jià)

郭佳林，胡翔*，歐陽洋，霍守亮

1.北京化工大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，北京 100029

2.中國環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012

隨著我國經(jīng)濟(jì)持續(xù)快速的發(fā)展，以及工業(yè)化、城市化、農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化不斷地加快，大量氮磷等營養(yǎng)物進(jìn)入湖泊江河流域，導(dǎo)致湖泊水體環(huán)境不斷惡化、水華頻繁發(fā)生、生物多樣性下降，湖泊水生態(tài)安全受到嚴(yán)重威脅。為保障湖泊水生態(tài)系統(tǒng)健康，防止發(fā)生藍(lán)藻暴發(fā)等不良水體生態(tài)效應(yīng)，湖泊水體富營養(yǎng)化預(yù)防與控制逐漸成為我國重點(diǎn)研究和亟須解決的重大環(huán)境問題［1］。國家環(huán)境管理的創(chuàng)新跨越和環(huán)境戰(zhàn)略目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)，亟需適合中國區(qū)域特點(diǎn)的水環(huán)境基準(zhǔn)作為科學(xué)依據(jù)，而湖泊水環(huán)境基準(zhǔn)方面的系統(tǒng)研究剛開始起步。我國中東部湖區(qū)屬于湖泊營養(yǎng)物一級生態(tài)分區(qū)，研究中東部湖區(qū)營養(yǎng)物基準(zhǔn)體系十分必要。

營養(yǎng)物是湖泊水生生物和健康生態(tài)系統(tǒng)所必需的，但是營養(yǎng)物過量會(huì)導(dǎo)致湖泊富營養(yǎng)化［2］。營養(yǎng)物基準(zhǔn)是指“以保護(hù)人類健康和生態(tài)平衡為目的，用可信的科學(xué)數(shù)據(jù)表示水中營養(yǎng)物質(zhì)的允許濃度或能間接表示水中營養(yǎng)物濃度的相關(guān)理化和生物指標(biāo)的數(shù)值”［3］。在制定營養(yǎng)物基準(zhǔn)方面，美國的水質(zhì)基準(zhǔn)被認(rèn)為是目前最為完善和最具有科學(xué)性的［4］，其初步形成了分區(qū)分級的營養(yǎng)物基準(zhǔn)體系，其一級分區(qū)營養(yǎng)物基準(zhǔn)采取了四個(gè)指標(biāo):總磷(TP)濃度、總氮(TN)濃度、葉綠素 a(Chl-a)濃度和透明度(SD)［5-6］。

美國國家環(huán)境保護(hù)局(US EPA)主要利用參照狀態(tài)法確定湖泊營養(yǎng)物基準(zhǔn)值［5］，Kenney 等［7］在參照狀態(tài)法基礎(chǔ)上提出通過建立結(jié)構(gòu)方程模型和專家判斷確定華盛頓湖等湖泊營養(yǎng)物基準(zhǔn)值。國內(nèi)一些學(xué)者通過借鑒參考美國的方法，確定出我國中東部湖區(qū)的營養(yǎng)物參照狀態(tài)值［8］，在其基礎(chǔ)上通過結(jié)構(gòu)方程模型(SEM)得出營養(yǎng)物候選基準(zhǔn)值;霍守亮等［9］研究分析了我國湖泊營養(yǎng)物基準(zhǔn)指標(biāo)候選變量，并歸納了選擇營養(yǎng)物基準(zhǔn)指標(biāo)時(shí)應(yīng)遵循的一些原則。筆者在其基礎(chǔ)上分析中東部湖區(qū)湖泊特點(diǎn)，根據(jù)結(jié)構(gòu)方程模型(SEM)得出的營養(yǎng)物候選基準(zhǔn)值，選取TP濃度、TN濃度、Chl-a濃度和SD作為中東部湖區(qū)營養(yǎng)物基準(zhǔn)值的候選指標(biāo)，由于SD指標(biāo)的模擬較為困難，因此在實(shí)驗(yàn)室中只選取TP濃度、TN濃度和Chl-a濃度來模擬我國中東部湖區(qū)的水質(zhì)狀況。

枝角類是水體浮游動(dòng)物的重要類群，能攝食微囊藻，研究其與微囊藻的生態(tài)關(guān)系非常必要，對枝角類毒性方面的研究工作已有較多報(bào)道［10］，其中大型溞是國際通用的毒理學(xué)試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)模式動(dòng)物，其生長繁殖速度快且易于培養(yǎng)，對環(huán)境條件變化敏感性高。在水生生物生態(tài)毒理試驗(yàn)研究方面，國內(nèi)外不少學(xué)者應(yīng)用大型溞進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)［11-13］。因此，筆者以大型溞(Daphnia magna)為試驗(yàn)對象，通過觀察其生長、繁殖情況對我國中東部平原湖區(qū)進(jìn)行生態(tài)毒理學(xué)評價(jià)。

1 材料和方法

1.1 材料

有毒銅綠微囊藻和斜生柵藻由中國環(huán)境科學(xué)研究院提供，均為單細(xì)胞培養(yǎng)物。用M11培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，溫度為27℃，表面光照強(qiáng)度為2000 lx，光暗比為16∶8。大型溞由中國環(huán)境科學(xué)研究院提供，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行純化培養(yǎng)，溫度為23℃，表面光照強(qiáng)度為2000 lx，光暗比為16∶8，試驗(yàn)所用的大型溞為第三代成熟期大型溞。

1.2 方法

1.2.1 單因素試驗(yàn)

TP濃度、TN濃度、Chl-a濃度、SD和pH是湖泊營養(yǎng)物基準(zhǔn)體系的重要指標(biāo)，由于實(shí)驗(yàn)室中SD指標(biāo)的模擬較困難，因此，選取 TP濃度、TN濃度、Chl-a濃度和pH四項(xiàng)指標(biāo)研究各變量對大型溞存活繁殖狀況的影響，并確定各變量指標(biāo)的最優(yōu)值。

1.2.2 模擬中東部湖區(qū)試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，共設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對照組，3個(gè)試驗(yàn)組的水質(zhì)條件分別對應(yīng)所選3個(gè)基準(zhǔn)候選值(E1、E2和E3)，其水質(zhì)條件如表1所示。在3個(gè)試驗(yàn)組中加入有毒銅綠微囊藻;對照組中加入斜生柵藻(無毒)取代有毒的銅綠微囊藻，對照組水質(zhì)條件與試驗(yàn)組1相同。將配好的溶液分別裝入4個(gè)1 L的燒杯中。隨機(jī)選取30只已培養(yǎng)的第三代成熟期大型溞分別放入上述4個(gè)燒杯中。試驗(yàn)開始時(shí)，每天早晚給各組加入20 mL密度為4×106個(gè)/mL的斜生柵藻，以補(bǔ)充充足的餌料，統(tǒng)計(jì)大型溞的個(gè)數(shù)和新生幼溞個(gè)數(shù)，并及時(shí)將各燒杯中新生的幼溞移出。每組試驗(yàn)設(shè)5個(gè)重復(fù)，每組結(jié)果取5個(gè)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果的平均值。

表1 試驗(yàn)水質(zhì)Table 1 The water quality of the experiments

2 結(jié)果

2.1 TP濃度的影響

保持TN濃度(0.72 mg/L)和Chl-a濃度(3.6 mg/m3)不變，TP濃度分別為0.030，0.036和0.042 mg/L，試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。TP濃度為0.036 mg/L的大型溞存活率〔圖1(a)〕明顯高于其他2個(gè)濃度＞u0.05)，TP濃度為0.030和0.042 mg/L的大型溞間沒有明顯的差異性(＜u0.05)。同樣，TP濃度為0.036 mg/L的大型溞出生率〔圖1(b)〕明顯高于其他2個(gè)濃度(＞u0.05)，而TP濃度為0.030和0.042 mg/L的大型溞出生率間差異性不明顯(＜u0.05)。從圖1(a)可以看出，雖然這3個(gè)濃度的大型溞存活率都是從第3天開始出現(xiàn)較大幅度的降低，但從最終結(jié)果來看，與其他2個(gè)濃度的大型溞相比，TP濃度為0.036 mg/L的大型溞存活率相對較高，為40%。從圖1(b)可以看出，TP濃度為0.036 mg/L的大型溞第一次繁殖的時(shí)間為第8天，出生率為50%;而 TP濃度為0.030和0.042 mg/L的大型溞第一次繁殖時(shí)間分別為第10天和第11天，大型溞出生率也明顯低于TP濃度為0.036 mg/L。由此可見，TP濃度的最優(yōu)值為0.036 mg/L。

圖1 TP濃度對大型溞存活率和出生率的影響Fig.1 The effect on the survival proportion and natality of Daphnia magna by total phosphorous

2.2 TN濃度的影響

控制TP濃度(0.036 mg/L)和Chl-a濃度(3.6 mg/m3)不變，TN濃度分別為0.60，0.72和 0.84 mg/L，試驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

3個(gè)濃度的大型溞存活率〔圖2(a)〕從一開始就沒有明顯的差異性(＜u0.05)，但從大型溞出生率〔圖2(b)〕看，TN濃度為0.72 mg/L與其他2個(gè)濃度有明顯的差異性(＞u0.05)，而其他2個(gè)濃度間沒有明顯的差異性(＜u0.05)。從圖2(a)可以看出，TN濃度為0.72 mg/L的大型溞存活率從第3天開始高于其他2個(gè)濃度，最后趨于穩(wěn)定，為40%。從圖2(b)可以看出，TN濃度為0.72 mg/L的大型溞第一次繁殖時(shí)間為第8天，早于其他2個(gè)濃度;而出生率也明顯高于其他2個(gè)濃度，為40%。由此可以得出，TN濃度最優(yōu)值為0.72 mg/L。

2.3 Chl-a濃度的影響

圖2 TN濃度對大型溞存活率和出生率的影響Fig.2 The effect on the survival proportion and natality of Daphnia magna by total nitrogen

保持TP濃度(0.036 mg/L)和TN濃度(0.72 mg/L)不變，Chl-a濃度分別為 3.0，3.6和 4.2 mg/m3，試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。從大型溞的存活率〔圖3(a)〕來看，3個(gè)濃度間沒有顯著差異性(＜u0.05)，但從大型溞的出生率〔圖3(b)〕可以看出，Chl-a濃度為3.6 mg/m3與其他2個(gè)濃度間有明顯的差異性(u0.05)，同時(shí)Chl-a濃度為3.0和4.2 mg/m3間也有明顯的差異性(＞u0.05)。從圖3可以看出，雖然3個(gè)濃度的大型溞存活率差別不大，但Chl-a濃度為3.6 mg/m3的大型溞出生率要明顯好于其他2個(gè)濃度，由此得出，Chl-a濃度的最優(yōu)值為3.6 mg/m3。

圖3 Chl-a濃度對大型溞存活率和出生率的影響Fig.3 The effect on the survival proportion and natality of Daphnia magna by chlorophyll-a

2.4 pH的影響

控制 TP濃度(0.036 mg/L)、TN濃度(0.72 mg/L)和Chl-a濃度(3.6 mg/m3)不變，以中東部平原湖區(qū)實(shí)際pH偏堿性為依據(jù)，選取pH分別為7.0，7.5和8.0，試驗(yàn)結(jié)果如圖4所示。

圖4 pH對大型溞存活率和出生率的影響Fig.4 The effect on the survival proportion and natality of Daphnia magna by pH

2.5 大型溞的存活繁殖情況

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過模擬中東部湖區(qū)試驗(yàn)，得出大型溞的存活率和出生率如圖5所示。在不同的基準(zhǔn)候選值水質(zhì)條件下喂養(yǎng)大型溞，對比試驗(yàn)組和對照組發(fā)現(xiàn)，各試驗(yàn)組與對照組間的存活率差異性顯著(u0.05)，E2組的存活率與E1和E3組的差異性明顯(u0.05)，但是E1和E3組間的差異性不明顯(＜u0.05)。同樣，大型溞出生率的差異顯著性與存活率一致。從圖5(a)可以看出，在14 d內(nèi)對照組中大型溞的存活率明顯趨于穩(wěn)定，大型溞沒有大幅死亡現(xiàn)象;而試驗(yàn)組有所不同，E1、E2和E3組大型溞在第4天后其存活率開始急劇降低，其中E3組的存活率降低最為明顯。在經(jīng)過9 d后，由于大型溞對毒性環(huán)境的適應(yīng)，其存活率基本趨于穩(wěn)定，最終E2組大型溞的存活率相對較高，約為26%。通過對比對照組和試驗(yàn)組的大型溞繁殖狀況〔圖5(b)〕可以看出，對照組的繁殖能力明顯優(yōu)于試驗(yàn)組，對照組的出生率達(dá)到了70%，并且第一次繁殖時(shí)間僅為3 d。而試驗(yàn)組第一次繁殖時(shí)間在8 d后才開始，并且出生率也非常低，最高的是E2組，為33%，最低的是E3組，僅為10%。

圖5 大型溞的存活率和出生率Fig.5 Survival proportion and natality of Daphnia magna

3 討論

在模擬中東部湖區(qū)試驗(yàn)中，通過對比可以看出，大型溞在對照組中基本保持較高的存活率，而在其他3個(gè)試驗(yàn)組中的存活率明顯較低，這主要是由于有毒銅綠微囊藻的抑制作用，這種抑制可能是銅綠微囊藻產(chǎn)生的藻毒素對大型溞生理代謝活動(dòng)產(chǎn)生的負(fù)面作用引起的。一般認(rèn)為，藻毒素對真核生物的毒性機(jī)制在于藻毒素可特異性地抑制絲氨酸和蘇氨酸蛋白磷脂酸合成酶1和2A(PP1和 PP2A)［14］。而PP1和PP2A參與許多重要的胞內(nèi)過程，如細(xì)胞生長、分化、蛋白質(zhì)合成、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［15］，并且由于對PP1和PP2A活性的抑制，相應(yīng)地增加了蛋白激活酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)的過磷酸化，造成細(xì)胞骨架系統(tǒng)架構(gòu)破壞，致使細(xì)胞畸形［16］。此外Lürling等［17］認(rèn)為，在非常低濃度的范圍內(nèi)藻毒素對大型溞產(chǎn)生的影響不是隨著濃度的升高而增大，同時(shí)銅綠微囊藻不但能夠產(chǎn)生藻毒素，而且還會(huì)分泌出其他生物活性物，這樣在較低的濃度下，該生物活性物可能會(huì)對大型溞產(chǎn)生較為有利的影響。除此之外，由于低濃度磷氮的存在，也會(huì)對大型溞產(chǎn)生影響。比較3個(gè)試驗(yàn)組的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E2組大型溞的存活率和出生率是最好的(圖5)。另外試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在有毒銅綠微囊中大型溞產(chǎn)第一胎時(shí)間比對照組晚很多，這也是由于試驗(yàn)組中銅綠微囊藻的毒性作用所致。Guo等［18］在試驗(yàn)研究中也認(rèn)為，微囊藻毒素的濃度越高對大型溞的出生繁殖影響也就越大。

由于營養(yǎng)物基準(zhǔn)值是在非常低的濃度范圍內(nèi)，大型溞在該范圍內(nèi)所受到的不利影響與濃度的高低不成正相關(guān)，此外還受到銅綠微囊藻分泌物的影響，從單因素變量影響的試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，其TP濃度、TN濃度、Chl-a濃度和pH的最佳指標(biāo)值分別為0.036 mg/L，0.72 mg/L，3.6 mg/m3和 7.5。與此同時(shí)，在模擬中東部湖區(qū)營養(yǎng)物基準(zhǔn)值的試驗(yàn)中，E2組大型溞的存活和繁殖狀況在各試驗(yàn)中均為最佳，試驗(yàn)得到的營養(yǎng)物基準(zhǔn)最優(yōu)值與單因素變量試驗(yàn)結(jié)果最優(yōu)值相一致，因此，初步確定了中東部湖區(qū)的營養(yǎng)物基準(zhǔn)值:TP濃度為0.036 mg/L;TN濃度為0.72 mg/L;Chl-a濃度為3.6 mg/m3。

4 結(jié)論

(1)在單因素試驗(yàn)中，通過比較大型溞的出生率和存活率，在其他因素不變時(shí)，確定了各單因素的最優(yōu)值:TP濃度為0.036 mg/L，TN濃度為0.72 mg/L，Chl-a濃度為3.6 mg/m3和pH為7.5。

(2)通過中東部湖區(qū)營養(yǎng)物推薦值水質(zhì)條件模擬試驗(yàn)，分析各試驗(yàn)組大型溞的出生率和存活率得出，E2組大型溞的存活發(fā)育狀況優(yōu)于E1和E3組，初步確定了中東部湖區(qū)的營養(yǎng)物基準(zhǔn)值:TP濃度為0.036 mg/L;TN濃度為0.72 mg/L;Chl-a濃度為3.6 mg/m3。

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