柑橘內(nèi)生放線菌CR20的鑒定與拮抗活性

胡秀榮，黃振東，蒲占湑，杜丹超，陳國慶，鹿連明

(浙江省柑橘研究所，浙江臺州 318020)

柑橘青、綠霉病是柑橘類果品貯運期間發(fā)生最普遍、危害最嚴重的侵染性病害［1］，其病原菌為青霉亞屬的2種不同真菌。這2種病原菌通?？赏瑫r侵染危害柑橘果實，且具有較強的侵染性和擴散能力。受病菌感染的果實通常可在1～2周時間內(nèi)全果腐爛，同時病果上產(chǎn)生大量的分生孢子向四周擴散侵染危害其他果實。因此，柑橘青、綠霉病對儲運期柑橘造成了極大的危害。據(jù)統(tǒng)計，僅由于這2種病的感染，柑橘采后損失率即可高達30% ～50%［2］。

目前主要通過化學殺菌劑如咪鮮胺、抑霉唑和百可得等來防治柑橘青、綠霉病。但這些化學藥劑的長期大量使用，不僅使環(huán)境污染和果品中農(nóng)藥殘留等問題日漸突出，而且易誘導病菌產(chǎn)生抗藥性，使其對病害的實際防治效果大為下降。隨著人們生活質(zhì)量的提高，對農(nóng)藥殘留等食品安全問題愈來愈重視。于是，尋求安全、無毒、高效的控制柑橘類果品采后腐爛的新方法成為當務之急，而利用拮抗微生物防治采后病害有望成為代替化學藥劑的一種安全、無毒及有效的新方法［3］。

黃巖被作為世界寬皮橘的始祖地，有著2 300多年的栽培歷史，擁有180多個柑橘品種，在栽培時間較長的橘園土壤中勢必存在著豐富的根際微生物，如能加以利用，篩選有益的生防菌株，對于植物病害的生物防治有著重要的意義。本研究擬于黃巖地區(qū)栽培時間較長的橘園中采集不同品種的柑橘根部樣品，從中分離內(nèi)生放線菌，以期篩選獲得對柑橘青霉病和綠霉病具有較好抑制效果的拮抗菌株，進一步研究拮抗菌株對柑橘果實采后的防病效果并探討其應用前景。

1 材料與方法

1.1 柑橘內(nèi)生放線菌的分離

1.1.1 樣品的采集

在黃巖地區(qū)本地早、椪柑、溫州蜜柑、槾桔、甜橙5個不同品種的柑橘園內(nèi)，采集柑橘植株根部樣品，每個品種10份，用于微生物的分離。

1.1.2 分離培養(yǎng)基

配制高氏合成1號培養(yǎng)基，成分如下:可溶性淀粉20 g，硝酸鉀1 g，磷酸氫二鉀0.5 g，硫酸鎂0.5 g，氯化鈉0.5 g，硫酸亞鐵0.01 g，重鉻酸鉀0.05 g，瓊脂20 g，純凈水1 000 mL，pH值7.2～7.4，于高壓滅菌鍋中滅菌后備用。

1.1.3 內(nèi)生放線菌的分離

將采集的柑橘根用自來水沖洗干凈，用99%乙醇處理1 min，3%次氯酸鈉處理5 min，再用99%乙醇處理30 s，最后用滅菌水沖洗3次。滅過菌的根用無菌剪刀在無菌操作臺上剪成1 cm的小段，置于分離培養(yǎng)基表面。之后將培養(yǎng)皿倒置于28℃微生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～6周，待放線菌長出，挑取菌絲進行轉接純化，純化培養(yǎng)的菌株再接種到含分離培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)，然后放于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫?］。

1.2 具抑菌活性的內(nèi)生放線菌的篩選

1.2.1 指示菌平板的制備

柑橘青、綠霉病的病原菌由本實驗室從患病的柑橘果實上分離并保存。將保存的2種病原菌轉接于PDA培養(yǎng)基平板上，置于28℃的微生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌落產(chǎn)生孢子后，往培養(yǎng)皿內(nèi)加入10 mL無菌水收集孢子，用無菌紗布過濾后，用無菌水調(diào)整孢子懸浮液濃度至104個孢子·mL-1，用移液器吸取20 μL孢子懸浮液均勻涂布于PDA平板上待用。

1.2.2 具拮抗活性菌株的篩選

采用挖塊法測定內(nèi)生放線菌的生物活性:將分離獲得的內(nèi)生放線菌接種于高氏合成1號培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)5 d后，在有菌生長處用打孔器取直徑5 mm的菌餅，置于接種有指示菌的平板中央，然后于28℃的微生物培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后觀察菌餅周圍透明抑菌圈的有無和大小，據(jù)此判定內(nèi)生放線菌的抑菌活性［4］。

1.3 菌株CR20發(fā)酵液對采后柑橘的防病效果

1.3.1 菌株CR20發(fā)酵液的制備

將菌株CR20接入高氏合成1號液體培養(yǎng)基(250 mL錐形瓶100 mL培養(yǎng)基)中，于28℃恒溫搖床中200 r·min-1振蕩培養(yǎng)7 d后，將培養(yǎng)物分裝于離心管中，置于10 000 r·min-1的高速離心機中離心5 min，收集上清液，最后利用過濾除菌裝置使上清液透過細菌過濾膜去除其中的孢子，收集濾液即為菌株CR20的發(fā)酵液［5］。

1.3.2 菌株CR20對病害的防效測定

取溫州蜜柑的新鮮果實，用解剖刀在果實腰部刺一傷口 (3 mm×3 mm)，在傷口處滴入15 μL菌株CR20發(fā)酵液，同時以滴加高氏合成1號液體培養(yǎng)基的果實為陰性對照，滴加咪鮮胺藥液 (濃度為200 mg·mL-1)的果實為陽性對照，處理后的果實置于塑料盒內(nèi)，于室溫放置24 h，再分別接種濃度為104個孢子·mL-1的柑橘青霉菌和綠霉菌的孢子懸浮液，用保鮮袋密封塑料盒后放置于28℃下保濕培養(yǎng)，在接種后的第7，14天分別統(tǒng)計發(fā)病率并計算防效。每次實驗處理30個果實，重復3次。

1.4 菌株CR20的形態(tài)學特征觀察

1.4.1 菌株CR20的菌絲和孢子形態(tài)觀察

制備菌株CR20的孢子懸浮液，吸取20 μL滴加在高氏合成1號培養(yǎng)基平板上，用無菌三角棒涂布均勻后，將滅菌的蓋玻片斜插入平板內(nèi)，每皿4片，放于28℃培養(yǎng)，在培養(yǎng)1，7和21 d后分別取出蓋玻片用細胞壁染色法染色 (1%磷鉬酸3～5 min，再用1%甲基綠染5 min)，無菌水沖洗后，將蓋玻片自然風干，在油鏡下觀察［4］。

1.4.2 菌株CR20在不同培養(yǎng)基上的生長特性

采用國際通用的5種培養(yǎng)基，包括2種合成培養(yǎng)基:ISP-4和ISP-5;2種有機培養(yǎng)基:ISP-3和ISP-2;1種產(chǎn)黑色素培養(yǎng)基:ISP-6。將菌株CR20接種到以上培養(yǎng)基上，并至于28℃恒溫培養(yǎng)，接種后3～4周，觀察菌株CR20的氣生菌絲、基內(nèi)菌絲的生長情況及可溶性色素的產(chǎn)生情況［4］。

1.5 菌株CR20的生理生化特性的測定

用于菌株生理生化特性測定的試驗如碳源利用、黑色素產(chǎn)生、H2S產(chǎn)生、七葉苷利用、纖維素利用、明膠液化、淀粉水解、牛奶凝固及凍化、纖維素水解、硝酸鹽還原等參照文獻［4］進行。

1.6 菌株CR20的PCR擴增及序列分析

1.6.1 放線菌總DNA的提取

取于高氏合成1號液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～5 d的CR20的菌液，分裝于無菌離心管中，10 000 rpm·min-1離心10 min后棄上清液，收集菌體沉淀并用無菌濾紙吸干多余水分后，稱取0.1～0.2 g菌體于無菌研缽中;加入少量PVP后用液氮研磨成粉末;之后參照王凡等［6］的方法利用CTAB法提取DNA，最后提取的DNA沉淀溶解于10～20 μL TE(含RNase 50 mg·L-1)中并放置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6.2 放線菌16S rDNA的PCR擴增

以提取的總DNA為模板，以細菌通用引物27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和1492R:5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'擴增放線菌16S rDNA，PCR 反應體系為:10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上 下 游 引 物 (10 μmol· L-1) 各1.5 μL，Taq DNA 聚合酶0.2 μL，DNA 模板1 μL，無菌水補足至總體積25 μL。反應條件為:94℃5 min;94℃ 1 min，55℃1 min，72℃ 2 min，35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物上樣于含有GelRed染料的瓊脂糖凝膠中電泳，并于凝膠成像系統(tǒng)中觀察拍照。

1.6.3 PCR產(chǎn)物測序及序列分析

于瓊脂糖凝膠上割取目的條帶，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物送交上海Invitrogen公司測序，測序結果整理后，利用NCBI Blast進行在線比對，查找Genbank數(shù)據(jù)庫中與之同源性較高的序列，通過 Mega4.1軟件中的Neighbor joining方法構建系統(tǒng)發(fā)育樹，在構建系統(tǒng)發(fā)育樹時進行自舉檢驗，重復抽樣1 000次，隨機種子數(shù)為64 238顆。

2 結果與分析

2.1 內(nèi)生放線菌的分離

從采集的50份柑橘根部樣品中分離獲得內(nèi)生放線菌共42株，其中鏈霉菌屬Streptomyces放線菌占70%以上，其他一些則屬于鏈輪絲菌屬Streptoverticillium、小單孢菌屬Micromonospora及一些尚未確定到屬的放線菌種類。同時發(fā)現(xiàn)不同柑橘品種根部內(nèi)生防線菌種群數(shù)量有差別，其中本地早蜜橘內(nèi)生放線菌數(shù)量明顯高于其他，種植時間較長的老橘園中柑橘根部內(nèi)生放線菌數(shù)量也明顯較高，推測老橘園土壤中可能富集更多的微生物。

2.2 具抑菌活性菌株的篩選

通過抑菌實驗，從42株分離獲得的內(nèi)生放線菌中篩選出1株可同時對柑橘青霉菌和綠霉菌有抑菌活性的菌株，編號為CR20，該菌株較其他菌株對柑橘青、綠霉菌具有更為顯著的抑制效果，其抑菌圈直徑分別可達35和41 mm。

2.3 菌株CR20發(fā)酵液柑橘采后保鮮試驗

從表1看出，接種7 d后，CR20發(fā)酵液對青霉病菌的防效達到100%，與咪鮮胺效果相當，對綠霉病的防效達到88%，稍低于咪鮮胺的防效;接種14 d后，拮抗菌株CR20發(fā)酵液對青霉病菌的防效為55%，對綠霉病的防效為49%，均低于咪鮮胺防效。

表1 CR20菌株發(fā)酵液對柑橘果實采后病害防效

2.4 菌株CR20的形態(tài)特征

2.4.1 形態(tài)特征

菌株CR20在高氏合成1號培養(yǎng)基上生長茂盛，氣生菌絲為粉紅色，基內(nèi)菌絲為黃色，單個菌落表面有氣孔 (圖1)。在顯微鏡下可觀察到其氣生菌絲多分枝，孢子絲較直，孢子表面光滑，呈橢圓形至圓柱形。

圖1 CR20在高氏合成1號培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征

2.4.2 在不同培養(yǎng)基上的生長特性

菌株CR20在供試的6種培養(yǎng)基上生長情況見表2。在ISP-3和ISP-2這2種有機培養(yǎng)基上均可良好生長;在ISP-4和ISP-5這2種合成培養(yǎng)基上長勢相差較大，在ISP-4生長良好，而在ISP-5上生長貧乏;在ISP-6黑色素培養(yǎng)基上生長貧乏，且有黑色素生成。

表2 放線菌CR20菌株的培養(yǎng)特征

2.5 菌株CR20的生理生化特性

菌株CR20可利用蔗糖、半乳糖、葡萄糖、甘露醇作為碳源，而不能利用果糖、肌醇、棉子糖、鼠李糖和阿拉伯糖?？墒古Ｄ棠滩㈦嘶梢岳闷呷~苷及產(chǎn)生黑色素等 (表3)。

表3 放線菌CR20菌株的生理生化特征

2.6 菌株CR20 16S rRNA的PCR擴增及系統(tǒng)發(fā)育樹構建

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，可觀察到大小為1 500 bp左右的目的條帶，與預期結果一致(圖2)。測序結果經(jīng)Blast比對分析發(fā)現(xiàn)，所測序列與Genbank中鏈霉菌屬的多個種均具有較高的同源性。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示 (圖3)，所分離菌株CR20與Streptomyces cinnamonensis和Streptomyces virginiae具有極近的親緣關系，其16S rRNA序列相似性可達100%。結合該菌種的形態(tài)學特征和生理生化特性，將菌株CR20初步鑒定為鏈霉菌屬的弗吉尼亞鏈霉菌 (Streptomyces virginiae)。

圖2 CR20的16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳圖譜

圖3 基于16S rDNA的菌株CR20與相關菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 小結和討論

植物內(nèi)生放線菌是一類新的生防微生物資源，在植物病蟲害的防治中具有很大的應用潛力。內(nèi)生放線菌作為內(nèi)生菌的重要類群，是較新的研究領域，鏈霉菌屬 (Streptomyces)少部分為稀有放線菌。從42株內(nèi)生放線菌中篩選出一株有價值的生防菌株CR20，經(jīng)鑒定初步確定為弗吉尼亞鏈霉菌(Streptomyces virginiae)。在利用內(nèi)生菌對柑橘青綠霉病菌的防治研究上，李輝等［7］從廣東果園土壤中分離獲得了一株吸水類群鏈霉菌 (Streptomyces hygroscopicus)，試驗結果表明，該菌株對柑橘綠霉病菌具有較強的拮抗活性。弗吉尼亞鏈霉菌作為拮抗菌株用于對病原菌的抑制前人也已有報道。如Hala M.Rifaat等［8］從埃及土壤中分離獲得弗吉尼亞鏈霉菌的HM3菌株，其對多種革蘭氏陰性和陽性細菌、酵母菌、真菌有較高的殺菌活性。卞光凱等［9］從紅豆杉根際土壤中分離獲得了一株弗吉尼亞鏈霉菌，研究表明，該菌株對植物病原菌可可球二孢菌具有明顯的抑菌活性。本研究所分離獲得的弗吉尼亞鏈霉菌菌株CR20對柑橘青綠霉病菌均具有較強的拮抗作用，其實際防效雖不及化學農(nóng)藥咪鮮胺，但可考慮通過對菌株進行改良或發(fā)酵條件進行優(yōu)化等，提高該菌株的實際應用效果。另外，本研究用于分離菌株的材料為柑橘根部樣品，所用分離培養(yǎng)基為單一的高氏合成1號培養(yǎng)基，這可能在很大程度上限制了對具有更好拮抗活性的微生物資源的篩選獲得。因此，在今后的研究中，應充分利用黃巖老柑橘產(chǎn)區(qū)的資源優(yōu)勢，采用多種分離培養(yǎng)基及培養(yǎng)策略以篩選獲得具有更好活性的生防菌株。

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