用Candida lipolytica脂肪酶手性轉(zhuǎn)酯拆分農(nóng)藥中間體rac-1-苯乙醇

范衛(wèi)東，范永仙，陳小龍

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 生物與環(huán)境工程學(xué)院 發(fā)酵工程研究所，浙江 杭州 310014;2.浙江天新藥業(yè)有限公司，浙江 天臺(tái) 317200)

隨著生命科學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，人們已充分認(rèn)識(shí)并開始重視手性藥物異構(gòu)體在生物體內(nèi)代謝、藥理作用、臨床效果和毒副作用的差異［1］。研究表明，以對映體純化合物給藥比其外消旋物療效更好、更安全［2］。因此，研究和分離手性化合物具有重要的學(xué)術(shù)意義和實(shí)用價(jià)值。光活性醇是精細(xì)化學(xué)品和藥物合成的重要中間體，在農(nóng)藥、醫(yī)藥和化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用［3］。其制備可以通過化學(xué)法或生物法拆分來獲得。由于生物法 (生物催化和生物轉(zhuǎn)化)拆分具有高效、反應(yīng)條件溫和、高手性選擇性、對環(huán)境友好等原因，已引起廣泛關(guān)注［4-8］。1-苯乙醇是重要的有機(jī)化合物，可作為手性中間體被廣泛地應(yīng)用于手性藥物或天然產(chǎn)物的合成［9］。由此可見，發(fā)展高效的不對稱合成方法來合成1-苯乙醇具有十分重要的意義。目前，利用脂肪酶高度的立體選擇性，在有機(jī)溶劑中進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化手性拆分制備單一手性醇 (酯)倍受人們的關(guān)注，特別是手性1-苯乙醇［10-12］。但所用的脂肪酶基本上是Novozym 435(Candida antarctica lipase B，CALB)，而利用其他來源脂肪酶來拆分手性醇比較少。本文比較了CALB和部分其他脂肪酶拆分1-苯乙醇，并使用C．lipolytica脂肪酶手性轉(zhuǎn)酯拆分rac-1-苯乙醇制備 (S)-1-苯乙醇，優(yōu)化了脂肪酶在有機(jī)相中手性拆分1-苯乙醇的條件。

1 材料與方法

1.1 脂肪酶及試劑

C．lipolytica脂肪酶 (北京凱泰新世紀(jì)生物技術(shù)有限公司)，Novozym 435(Novozymes)，豬胰脂肪酶 (Sigma-Aldrich)，擴(kuò)展青霉脂肪酶 (福建龍馬生化廠)，黑曲霉脂肪酶 (深圳市綠微康生物工程有限公司)，rac-1-苯乙醇和乙酸乙烯酯 (南京康滿林化工實(shí)業(yè)有限公司和江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司);所有其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)

如圖1所示，脂肪酶轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的底物為rac-1-苯乙醇和乙酸乙烯酯，經(jīng) C．lipolytica脂肪酶轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)，得到 (S)-1-苯乙醇、 (R)乙酸-1-苯乙酯和乙醛。

具體操作如下:取0.02 mol·L-1(12.2 μL)1-苯乙醇，0.1 mol·L-1(46 μL)乙酸乙烯酯。以乙酸乙烯酯作溶劑，反應(yīng)體系5 mL，10 mg C．lipolytica脂肪酶，置于30℃，150 r· min-1的搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)。

1.3 產(chǎn)物的分離與檢測

圖1 脂肪酶轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)

轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)每隔一定時(shí)間取樣，然后在樣品中加入一定比例的乙酸乙酯，振蕩萃取30 min，離心(12 000 r·min-1，5 min，4℃)分離，取上層有機(jī)溶液，用無水 Na2SO4干燥。產(chǎn)物乙酸-1-苯乙酯和未反應(yīng)完全的底物1-苯乙醇用SP-6890型氣相色譜儀 (山東魯南瑞虹化工儀器有限公司，裝有手性毛 細(xì) 管 柱 Cyclodex-B，30 m×0.250 mm ×0.25 mm，F(xiàn)ID檢測器)分析。色譜條件:柱溫使用程序升溫，初溫85℃維持3 min，升溫速率15℃·min-1，終溫140℃維持3 min;進(jìn)樣器氣化溫度和FID檢測溫度分別為240℃和250℃;載氣N2， 流 量 3.0 mL·min-1， 分 流 比 50∶1， 樣 量0.4 μL，使用面積歸一化法分析。

轉(zhuǎn)化率/%=(初始底物峰面積-剩余底物峰面積)/初始底物峰面積×100。

初始底物峰面積=剩余底物峰面積+生成產(chǎn)物所需的底物的峰面積。

1-苯乙醇對映體過剩值 (e．e．值)/%=(S-1-苯乙醇的峰面積 -R-1-苯乙醇的峰面積)/(S-1-苯乙醇的峰面積 +R-1-苯乙醇的峰面積)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同來源脂肪酶拆分1-苯乙醇

取 0.02 mol·L-1(12.2 μL)1-苯 乙 醇，0.1 mol·L-1(46 μL)乙酸乙烯酯，乙酸乙烯酯作 溶 劑， 反 應(yīng) 體 系 5 mL， 搖 床 30℃，150 r·min-1。

由圖2可以看出，5種脂肪酶都有拆分能力。Novozym 435可將底物完全拆分，其次是假絲酵母脂肪酶，168 h時(shí)底物e．e．值達(dá)到19.01%，轉(zhuǎn)化率15.97%。但目前對Novozym 435的研究已經(jīng)比較成熟，而對假絲酵母脂肪酶的催化拆分條件研究較少，所以本文采用假絲酵母脂肪酶作進(jìn)一步的研究。

2.2 不同溶劑對反應(yīng)的影響

圖2 不同來源脂肪酶對酯轉(zhuǎn)化的影響

各種溶劑的log P值和對脂肪酶轉(zhuǎn)酯化的影響分別如表1和圖3所示。表1和圖3可以看出，溶劑的疏水性系數(shù)對轉(zhuǎn)化率有一定的影響。除了正己烷以外，疏水性系數(shù)大于2.5的溶劑，168 h后轉(zhuǎn)化率均達(dá)到30%以上;正庚烷的轉(zhuǎn)化率最高為49.75%，1-苯乙醇e．e．值達(dá)到99.02%。故選擇正庚烷為溶劑。

表1 有機(jī)溶劑的log P

2.3 加酶量對反應(yīng)的影響

如圖4所示，隨著加酶量的增加 (5～20 mg)，底物的轉(zhuǎn)化率穩(wěn)步上升，72 h時(shí)轉(zhuǎn)化率從37.40%增加到50.00%，反應(yīng)速率明顯提高。進(jìn)一步增加酶量，72 h時(shí)，30 mg轉(zhuǎn)化率為43.21%，40 mg為48.30%，提高不明顯甚至有所下降。所以，從加快反應(yīng)速率和節(jié)約脂肪酶兩方面綜合考慮，最佳加酶量為20 mg。經(jīng)過酶量的優(yōu)化，反應(yīng)時(shí)間從之前的168 h大幅縮短到72 h。

圖3 有機(jī)溶劑反應(yīng)的影響

圖4 脂肪酶加酶量對轉(zhuǎn)化率的影響

2.4 反應(yīng)體系水活度對反應(yīng)的影響

在酶促反應(yīng)中，水活度對保持酶的活性和酶反應(yīng)速率非常重要。實(shí)驗(yàn)取20 mg C．lipolytica脂肪酶， 0.02 mol·L-1(12.2 μL)1-苯 乙 醇，0.1 mol·L-1(46 μL)乙酸乙烯酯，正庚烷作溶劑，加入不同含結(jié)晶水的無機(jī)鹽來維持水活度搖床溫度30℃，轉(zhuǎn)速150 r· min-1(圖5-6)。

圖5 水活度對轉(zhuǎn)化率的影響

LiCl·H2O(Aw=0.023)水活度過低，脂肪酶失水而失活，轉(zhuǎn)化率只有4.54%;Na4P2O7·7H2O(Aw=0.47)、ZnSO4·7H2O(Aw=0.62)、Na2HPO4·12H2O(Aw=0.85)等水活度過高，影響了酶的均相分布。當(dāng)水活度為0.35(CuSO4·5H2O)時(shí)，轉(zhuǎn)化率最高。

2.5 溫度對反應(yīng)的影響

圖6 水活度對1-苯乙醇e．e．值的影響

酶反應(yīng)溫度既影響反應(yīng)速率，同時(shí)也影響酶活性。溫度越高，反應(yīng)速度越快，酶失活越快。實(shí)驗(yàn)取 0.02 mol·L-1(12.2 μL)1-苯 乙 醇，0.1 mol·L-1(46 μL) 乙 酸 乙 烯 酯，20 mg C．lipolytica脂肪酶，用正庚烷作溶劑，反應(yīng)體系5 mL，水活度0.35。

25～45℃時(shí)，轉(zhuǎn)化率、1-苯乙醇 e．e．值和反應(yīng)速率 (圖7-8)均隨溫度升高而上升，96 h轉(zhuǎn)化率從44.73%上升到49.86%，1-苯乙醇 e．e．值從80.93%上升到99.44%，45℃下僅48 h轉(zhuǎn)化率就達(dá)到49.84%。當(dāng)溫度繼續(xù)上升時(shí)，轉(zhuǎn)化率和1-苯乙醇e．e．值開始下降，至55℃，96 h時(shí)僅剩43.84%。這與文獻(xiàn)［11-12］中描述的C．lipolytica脂肪酶在50～60℃失活一致。綜合考慮，溫度選擇45℃較為合適。

圖7 溫度對轉(zhuǎn)化率的影響

2.6 底物濃度對反應(yīng)的影響

1-苯 乙 醇 濃 度 分 別 為 0.02，0.04，0.06，0.08，0.10 mol·L-1，乙酸乙烯酯濃度對應(yīng)為0.1，0.2， 0.3， 0.4， 0.5 mol·L-1時(shí)， 放 入45℃，150 r·min-1的搖床中反應(yīng)。

隨著 1-苯乙醇濃度從0.02 mol·L-1上升到0.08 mol·L-1，72 h時(shí)的轉(zhuǎn)化率一直維持在49.82% ～49.87%之間，1-苯乙醇 e．e．值也很高，但進(jìn)一步提高 1-苯乙醇濃度為0.1 mol·L-1時(shí)，轉(zhuǎn)化率明顯下降至45.82%，1-苯乙醇 e．e．值也只有88.88%。所以0.08 mol·L-11-苯乙醇和0.4 mol·L-1乙酸乙烯酯為較合適的底物濃度 (圖9-10)。

圖8 溫度對1-苯乙醇e．e．值的影響

圖9 底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響

圖10 底物濃度對1-苯乙醇e．e．值的影響

3 小結(jié)

綜上可知，利用國產(chǎn)的C．lipolytica脂肪酶手性轉(zhuǎn)酯拆分rac-1-苯乙醇制備 (S)-1-苯乙醇是可行的，較佳反應(yīng)工藝為:反應(yīng)體系5 mL，正庚烷為溶劑，加酶量為20 mg，水活度為0.35，反應(yīng)溫度45℃，rac-1-苯乙醇濃度為0.08 mol·L-1，乙酸乙烯酯為0.4 mol·L-1。經(jīng)過優(yōu)化，轉(zhuǎn)化率從15.97%上升到49.88%，(S)-1-苯乙醇 e．e．值

由于目前對C．lipolytica脂肪酶手性轉(zhuǎn)酯拆分rac-1-苯乙醇制備 (S)-1-苯乙醇研究比較少，對其酶動(dòng)力學(xué)及動(dòng)態(tài)拆分動(dòng)力學(xué)等還有待進(jìn)一步研究。

［1］ Anirban G，Rajiv K.Efficient heterogeneous catalytic systems for enantioselective hydrogenation of prochiral carbonyl compounds［J］.J Catal，2004，228(2):386-396.

［2］ Vetere V，F(xiàn)araoni M B，Santori G F，et al.New approach toward the synthesis of asymmetric heterogeneous catalysts for hydrogenation reactions ［J］.J Catal，2004，226 (2):457-461.

［3］ Chaubey A， Parshad，Gupta P. Arthrobactersp. lipase immobilization for preparation of enantiopure masked β-amino alcohols［J］.Bioorg Med Chem，2009，17(1):29-34.

［4］ Hudlicky T，Reed J W.Applications of biotransformations and biocatalysis to complexity generation in organic synthesis ［J］.Chem Soc Rev，2009，38(11):3117-3132.

［5］ Tao J H，Xu J H.Biocatalysis in development of green pharmaceutical processes［J］.Cur Opin Chem Biolog，2009，13(1):43-50.

［6］ Woodley J M.Biocatalysis for pharmaceutical intermediates:the future is now ［J］.Trends Biotechnol， 2008，26 (6):321-327.

［7］ Patel R N.Synthesis of chiral pharmaceutical intermediates by biocatalysis［J］.Coordin Chem Rev，2008，252(5-7):659-701.

［8］ Ran N Q，Zhao L S，Chen Z M，et al.Recent applications of biocatalysis in developing green chemistry for chemical synthesis at the industrial scale［J］.Green Chem，2008，10(4):361-372.

［9］ Suan C L， SarmidiM R. Immobilised lipase-catalysed resolution of(R，S)-1-phenylethanol in recirculated packed bed reactor［J］.J Mol Catal B:Enzym，2004，28(2-3):111-119.

［10］ Benaissi K，Poliakoff M，Thomas N R.Dynamic kinetic resolution of rac-1-phenylethanol in supercritical carbon dioxide［J］.Green Chem，2009，11(5):617-621.

［11］ De los Rios A P，Hernandez-Fernandez F J，Tomas-Alonso F，et al.Biocatalytic kinetic resolution of rac-1-phenylethanol and rac-2-pentanol in hexane medium:ACYL donor and water content effects ［J］.Can J Chem Eng，2010，88(3):442-446.

［12］ Ou L，Xu Y，Ludwig D，et al.Chemoenzymatic deracemization of chiral secondary alcohols:Process optimization for production of(R)-1-indanol and(R)-1-phenylethanol［J］.Org Proc Res Develop，2008，12(2):192-195.