兒童慢性乙肝肝組織病理與相關(guān)標志物的研究

雷曉燕 王三萍 孫永紅 袁 宏

中國屬HBV 感染高流行區(qū)，一般人群的HBsAg 陽性率為9.09%，在圍生期和嬰幼兒時期感染HBV 者中，分別有90%和25% ～30%將發(fā)展成慢性感染［1］，兒童慢性乙肝起病隱匿，無明顯臨床表現(xiàn)，且隨兒童年齡增長，肝纖維化程度逐漸加重。肝活檢為目前了解肝臟炎癥狀況及纖維化程度的金指標，但不易被家長接受，故探討無創(chuàng)且有診斷價值的指標具有重要意義。國內(nèi)外肝組織損害程度判斷的無創(chuàng)性檢查指標在成人中已做了大量的研究，4 項肝纖維化血清標志物，如血清透明質(zhì)酸(HA)、層黏連蛋白(LN)、Ⅲ型前膠原(PC Ⅲ)和Ⅳ型膠原(CⅣ)為較敏感的反映肝損害程度的指標，肝纖維化的發(fā)生與病毒數(shù)量或病毒復(fù)制強弱無關(guān)。在兒科領(lǐng)域相關(guān)研究很少，本研究前期結(jié)果顯示HBV 基因型和HBV 核內(nèi)共價閉合環(huán)狀DNA (HBV cccDNA)，與乙肝的活動性、嚴重程度和病毒復(fù)制水平有一定關(guān)系。本文以肝活檢作為反映肝臟炎癥狀況及纖維化程度的金指標，考察HBsAg 攜帶組和慢性乙肝組，HBV cccDNA 陽性與陰性，HBV 不同基因型，4 項肝纖維化血清標志物與肝炎癥活動度和纖維化的相關(guān)性，以了解上述指標在乙肝診斷、治療和預(yù)后中的價值。

1 方法

1.1 病例納入標準 ①2008 年4 月至2011 年8 月于甘肅省人民醫(yī)院兒科和蘭州大學(xué)第一醫(yī)院感染科門診就診和住院的乙肝及HBV 攜帶患兒;②HBV-DNA 陽性;③就診前未行抗病毒治療。

1.2 病例排除標準 ①其他肝炎病毒感染、自身免疫性肝病、藥物性肝損害和酒精性肝損害等患兒;②就診后根據(jù)病情需要進行肝穿刺，但患兒及其家長不同意進行肝穿刺，因而無法判斷肝纖維化程度和炎癥活動度的患兒。

1.3 對照組納入標準 在甘肅省人民醫(yī)院健康查體、年齡1 ～15 歲的兒童，無肝脾腫大、黃疸、肝炎接觸史，并排除心、腎疾病，肝功能正常，HBsAg 陰性。

1.4 診斷標準 ①乙肝:符合2011 年《病毒性肝炎防治方案》中慢性乙肝的診斷標準［1］;②HBV 病毒攜帶:是指感染了HBV，沒有肝炎癥狀和體征，肝功能等各項檢查正常，1年內(nèi)連續(xù)隨訪3 次以上，血清ALT 和AST 均在正常范圍。

1.5 倫理與知情同意 本研究為甘肅省自然基金項目(099RJYA001)中的一部分，得到了甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會的批準。HBV DNA 陽性患兒需行肝穿刺［2］，并事先征得患兒及其家長同意。

1.6 實驗室檢測方法 肝組織病理學(xué)檢查、HBV-DNA、HBV cccDNA、生化指標檢測、HBV-DNA 基因分型方法同本文前期研究［3］。血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ檢測方法采用RIA 法檢測，試劑盒由北方免疫中心提供，嚴格按試劑盒說明書專人操作。儀器使用西安262 廠生產(chǎn)的FJ22008PS 全自動免疫計數(shù)器。

1.7 分組考慮和依據(jù) ①根據(jù)慢性乙肝診斷標準［1］，將研究對象分為HBV 攜帶組和慢性乙肝組;慢性乙肝組進一步分為輕度、中度和重度亞組。輕度亞組:病情較輕，癥狀不明顯或雖有癥狀、體征但ALT 或AST 輕度異常者(小于正常參考值2 倍);中度亞組:癥狀、體征、實驗室檢查介于輕度和重度之間;重度亞組:有明顯或持續(xù)的肝炎癥狀，如乏力、納差、腹脹等，可伴有肝病面容、肝掌及蜘蛛痣或肝脾腫大而排除其他原因，且無門靜脈高壓癥狀;實驗室檢查血清ALT 反復(fù)或持續(xù)升高，白蛋白降低或A/G 比例異常，丙種球蛋白明顯升高，凡白蛋白≤32 g·L－1、膽紅素＞85.5 μmol·L－1、凝血酶原活動度60% ～40 %，3 項檢測中有1項達上述數(shù)值者即歸為重度亞組。②依據(jù)肝內(nèi)膠原沉積對肝結(jié)構(gòu)破壞范圍、程度和對肝微循環(huán)影響的大小，將肝纖維化程度劃分為S0～S4期;根據(jù)匯管區(qū)、匯管區(qū)周圍炎癥及小葉內(nèi)炎癥程度，將肝組織炎癥活動度分為G0～G4級［1］;考慮兒童肝纖維化程度≥S2期和肝組織炎癥活動度≥G2級以上的比例較小，故肝纖維化程度分為S0、S1和S2～S4三個組，肝組織炎癥活動度分為G0、G1和G2～G4三個組。③根據(jù)血清HBV cccDNA 的檢測結(jié)果，分為HBV cccDNA 陽性組和陰性組。④根據(jù)前期相同病例HBV 基因分型的結(jié)果，分為B 基因型組和C 基因型組。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 12.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，組間均數(shù)比較采用方差分析;計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 46 例患兒進入本研究(圖1)。男34 例，女12 例，年齡1 ～16 歲，平均年齡(11.8 ±3.7)歲。

2.2 慢性乙肝組和HBV 攜帶組肝纖維化血清標志物水平比較 表1 顯示，HBV 攜帶組、對照組、慢性乙肝不同嚴重程度亞組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。隨乙肝臨床分度加重，血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ呈升高趨勢，以重度亞組上升最為明顯;HBV 攜帶組HA、PCⅢ與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義;輕度亞組與對照組比較HA 升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 研究對象納入、排除及分組流程圖Fig 1 Inclusion process for children with CP

2.3 慢性乙肝臨床分度與肝炎癥活動度、纖維化分級HBV 攜帶組:G015 例(75.0%)，G14 例(20.0%)，G21 例(5.0%);S016 例(80.0%)，S13 例(15.0%)，S21 例(5.0%)。輕度乙肝亞組:G04 例(30.8%)，G17 例(53.8%)，G22 例(15.4%);S06 例(46.2%)，S17 例(53.8%)，S21 例(7.7%)。中度乙肝亞組:G02 例(25.0%)，G13 例(37.5%)，G22 例(25.0%)，G31 例(12.5%);S03 例(37.5%)，S14 例(50.0%)，S21 例(12.5%)。重度乙肝亞組:G11 例(20.0%)，G22 例(40.0%)，G32 例(40.0%);S12 例(40.0%)，S21 例(20.0%)，S32 例(40.0%)。隨著乙肝臨床分度加重，≥G2和≥S2期的構(gòu)成比呈升高趨勢。

2.4 肝纖維化血清標志物與肝炎癥活動度、纖維化分級相關(guān)性 隨肝炎癥活動度和纖維化分級增加，血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ均呈升高趨勢，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

表1 46 例乙型肝炎病毒感染患兒不同臨床分度肝纖維化血清標志物水平比較Tab 1 Levels of serum fibrosis markers with different grades of 46 HBV-DNA positive chidren with chronic hepatitis B

表2 肝炎癥活動度、纖維化與血清肝纖維化標志物的相關(guān)性Tab 2 Correlation of HA、LN、PCⅢ、CⅣlevels with serum fibrosis markers

2.5 血清HBV cccDNA 與肝炎癥活動度、纖維化分級相關(guān)性 血清HBV cccDNA 陽性組與陰性組在肝組織炎癥活動度＜G2級分別為82.9%(29/35)和81.8%(9/11)，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.963);血清HBV cccDNA 陽性組與陰性組在肝組織纖維化＜S2期分別為88.5%(31/35)和81.8%(9/11)，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2. 31，P =0.736)。

2.6 不同HBV 基因型與肝炎癥活動度、纖維化分級的相關(guān)性 46 例肝組織活檢患兒中，B 基因型17 例(36.9%)，C 基因型26 例(56.5%)，B/C 混合型2 例，非B/C 型1 例。

17 例HBV B 基因型患兒肝臟炎癥活動度G0～G2期分別為58.8%(10 例)、35.3%(6 例)和5.9%(1 例);26 例HBV C 基因型患兒G0～G3期分別為30.7%(8 例)、42.3%(11 例)、15.1%(4 例)和11.5%(3 例);兩組炎癥分級差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.38，P =0.036)。肝纖維化分級:17 例HBV B 基因型患兒S0～S2期分別為65.3%(11 例)、29.4%(5 例)和5.9%(1 例);26 例HBV C 基因型患兒S0～S3期分別為42.3%(11 例)、38.4%(10 例)、11.5%(3例)和7.7%(2 例)，兩組纖維化程度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=23.93，P=0.002)。

3 討論

近年國內(nèi)外文獻報道［4］血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ等指標可作為肝纖維化的敏感血清標志物，在臨床診斷中具有重要價值。謝士斌等［5］研究顯示HA 是反映肝纖維化最敏感的指標，可作為早期肝硬化的診斷指標，敏感度和特異度高;CⅣ在肝纖維化早期即升高，聯(lián)合檢測對肝纖維化可提高檢測率，是肝纖維化無創(chuàng)檢測的發(fā)展趨勢。國外研究表明［6］，聯(lián)合多項肝纖維化標志物可較準確預(yù)測S2～S4期肝纖維化。本研究檢測了46 例慢性乙肝患兒4 項肝纖維化血清標志物水平，隨著乙肝程度的加重，血清HA、CⅣ、LN、PCⅢ水平逐漸升高，尤其中度以上乙肝有明顯的升高，輕度亞組HA 有明顯的升高。進一步分析顯示隨著肝炎癥活動度和纖維化分級的加重，肝纖維化血清標志物水平逐漸升高，尤以G2或S2以上明顯。HBV 攜帶組HA、PCⅢ與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。以上結(jié)果表明血清HA、ⅣC、LN、PCⅢ水平與慢性肝炎發(fā)展的階段性以及肝纖維化程度一致，與江冬梅等［7］研究基本一致。慢性肝炎早期，基質(zhì)合成和降解代謝處于相對平衡狀態(tài)，尚無造成細胞外基質(zhì)在肝臟中沉積，缺乏客觀評價指標，但血清HA、CⅣ和LN 水平有一定程度的增高。但隨著慢性乙肝嚴重程度加重，血清HA、CⅣ、LN 持續(xù)高水平增加，說明肝纖維化血清標志物可更早反映肝臟損害程度。

傳統(tǒng)的觀點認為，ALT 水平升高是肝臟存在壞死炎癥的標志，而ALT 正常的HBV 感染者，則無或僅有輕度的肝組織學(xué)炎癥，并對抗病毒藥物不敏感。但最近有研究表明，部分ALT 水平正常的慢性HBV 攜帶者肝活檢時，仍可存在顯著的肝組織壞死炎癥和纖維化［8，9］。本研究顯示HBV攜帶者ALT 正常，20 例行肝組織活檢，其中5 例存在G1～G2級炎癥改變，4 例存在S1～S2期纖維化。且HBV 攜帶組血清HA、PCⅢ較對照組有不同程度增高，可能與HBV 攜帶者病毒復(fù)制有關(guān)，雖然ALT 水平正常，但病理活檢提示部分病例存在肝組織炎癥和纖維化，可能是導(dǎo)致肝纖維化血清標志物輕度升高的原因。結(jié)合肝纖維化血清標志物及ALT 等指標綜合判斷更具有意義。

HBV 基因型分布呈一定的地域性，東南亞地區(qū)慢性HBV 感染者以B、C 基因型為主，但流行主導(dǎo)基因型各地存在一定差異。在中國HBV 基因型以B、C 型為主，北方地區(qū)以C 型為主，南方以B 型為主，國內(nèi)外研究顯示HBV 基因型與臨床表現(xiàn)、預(yù)后、治療應(yīng)答均有一定關(guān)系，提示不同基因型具有不同的致病性，在以B、C 基因型為優(yōu)勢的地區(qū)，C 基因型具有較強的致病能力，預(yù)后差。C 基因型在嚴重的肝病以及原發(fā)性肝癌的患者中所占比例顯著高于其他基因型。慢性乙肝患者HBV 基因型中C 型比例明顯高于B 型與B/C 型，且肝臟病理變化較B 基因型與B/C 基因型嚴重［10］。本研究顯示C 基因型組肝炎癥活動度及纖維化程度較B 基因型組更嚴重，提示HBV 基因B、C 分型與肝組織病理改變有關(guān)，故HBV 基因型測定對判斷肝損害的程度，疾病嚴重程度，指導(dǎo)治療及評估預(yù)后具有重要價值。

ccc DNA 的存在是肝細胞內(nèi)持續(xù)HBV 感染的特征。本課題組前期研究提示124 例患兒HBV DNA 均為陽性，隨著病情加重，HBV cccDNA 檢出率增加，提示HBV cccDNA 可反映臨床嚴重程度［3］。本研究顯示，HBV cccDNA 與肝纖維化、炎癥活動度無顯著的相關(guān)性。慢性乙肝患兒肝臟損傷為病毒長期復(fù)制引發(fā)的針對病毒抗原的一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)［11］。肝臟損傷受病毒復(fù)制水平、宿主免疫功能、免疫遺傳的異質(zhì)性、非特異性炎癥應(yīng)答等因素的影響。肝纖維化的程度、肝細胞壞死程度與肝臟炎癥持續(xù)時間有關(guān)，盡管HBV 的復(fù)制不能直接、完全反映肝臟損害及炎癥程度，但可導(dǎo)致肝組織炎癥，可能與肝組織炎癥及纖維化具有間接關(guān)系。

總之，目前單一指標較難反映乙肝的炎癥活動度及纖維化程度，血清HBV cccDNA 水平與其無顯著的相關(guān)性，血清HA、LN、PCⅢ和CⅣ，HBV 基因分型與肝炎癥活動度、纖維化程度有較好的相關(guān)性，臨床可結(jié)合病毒復(fù)制水平、ALT、肝纖維化血清標志物及HBV 基因分型綜合判斷肝損害程度，以確定治療時機。

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