神經(jīng)管畸形患者鋅指蛋白ZIC2 基因編碼區(qū)罕見突變的分子遺傳分析

武聳荔 趙彥程 李 紅 楊雪艷 王紅艷 陳 瑛

神經(jīng)管畸形(NTDs)是一種由于胚胎發(fā)育早期因神經(jīng)管不閉合或閉合不完全所造成的常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)出生缺陷［1］，由遺傳和環(huán)境因素共同作用［2～4］。目前國內(nèi)外多集中于與神經(jīng)管發(fā)育相關(guān)基因的突變研究［5～8］，隨著首次在NTDs 患者中發(fā)現(xiàn)3 個VANGL1 基因特有的雜合性錯義突變［5］，隨后篩查發(fā)現(xiàn)了FUZZY 基因在3 例NTDs 患者中特有的雜合性錯義突變［8］，這些研究均提供了人類神經(jīng)發(fā)育相關(guān)基因突變可能會導致NTDs 發(fā)生的證據(jù)。

ZIC2 是ZIC 鋅指家族5 個成員之一。ZIC 家族基因編碼鋅指轉(zhuǎn)移因子，其結(jié)構(gòu)上包含進化上高度保守的5 個串聯(lián)C2H2鋅指結(jié)構(gòu)［9］。ZIC2 編碼的轉(zhuǎn)移因子在神經(jīng)發(fā)育過程中起著極其重要的作用，參與神經(jīng)管和神經(jīng)嵴的形成［10］。小鼠Zic2 基因敲除或Zic2 表達量下降會導致NTDs 產(chǎn)生，表型為前腦裂畸形和脊柱裂［11］。在人群中，ZIC2 雜合基因突變，即13q32 區(qū)域雜合性缺失會導致前腦裂畸形［12］。由于ZIC2 進化上保守，同時在小鼠神經(jīng)管閉合中起著重要作用，而小鼠神經(jīng)管發(fā)生的機制與人類極為相似，因此ZIC2 基因突變可能會引發(fā)人類NTDs。有系列研究在人類NTDs 患者中進行了ZIC2 基因突變篩查，但并未發(fā)現(xiàn)任何致病性基因突變或與NTDs 相關(guān)的SNP［13～15］。然而上述結(jié)果均來自對歐美人群的篩查，迄今缺乏中國NTDs 人群的篩查結(jié)果。另一方面，既往報道大多以脊柱裂存活患者為研究對象，但若ZIC2 基因為致死性突變，則攜帶該突變的個體就難以發(fā)育至成熟?；谝陨峡紤]，本研究在擴大樣本量的基礎(chǔ)上，征集因嚴重NTDs 死亡或流產(chǎn)的中國人群胎兒DNA 樣本，對ZIC2 外顯子進行突變篩查。

1 方法

1.1 NTDs 樣本來源 與文獻［6］的樣本相同，由2 部分組成:①山西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院和山西長治醫(yī)學院提供的NTDs 胎兒臍帶血抽提的DNA 樣本142 份;②江蘇省蘇州市立醫(yī)院母子健康研究中心提供的NTDs 胎兒臍帶血樣本21 份。所有樣本均經(jīng)孕期B 超確診，部分樣本同時經(jīng)病理學解剖證實為NTDs。均為有明顯NTDs 癥狀同時不伴有其他重大出生缺陷(如先天性心臟病)的胎兒。

1.2 對照樣本來源 由3 部分組成:①山西醫(yī)科大學和山西長治醫(yī)學院提供的正常生產(chǎn)健康胎兒臍帶血樣本96 份和健康成年婦女血樣192 份;②山西長治醫(yī)學院提供的健康成年男性血樣192 份;③江蘇省蘇州市立醫(yī)院提供的健康成年人血樣96 份。所有對照樣本由醫(yī)院進行常規(guī)體檢，確認無NTDs、先天性心臟病、智力低下、精神分裂癥、糖尿病、高血壓和癌癥等出生缺陷和重大疾病。

1.3 倫理學 本研究經(jīng)復旦大學生命科學院倫理委員會批準，胎兒由其父母簽署知情同意書，成人由其本人簽署知情同意書后進入本研究。

1.4 ZIC2 基因突變篩查

1.4.1 DNA 提取 使用傳統(tǒng)酚-氯仿法抽提DNA。蛋白酶K 購自Sigma 公司，乙醇、酚、氯仿、異戊醇、碳酸氫鈉等試劑均為上海試劑廠產(chǎn)品;抽提出的DNA 采用Thermo Scientific 公司的Nanodrop 2000 分光光度計測定DNA 濃度。

1.4.2 PCR 擴增 針對外顯子設(shè)計PCR 擴增引物，從基因組上擴增外顯子序列，引物序列見表1，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。PCR 使用TAKARA 公司產(chǎn)品，包括HSTaq 酶、反應緩沖液、dNTP，以及提供的相應體系和擴增條件。ZIC2 Exon3 序列GC 含量較高，采用LATaq 酶(TAKARA 公司)擴增。

1.4.3 ZIC2 外顯子區(qū)域的突變篩查 取PCR 擴增產(chǎn)物進行測序。采用美國ABI 公司的Bigdye 試劑盒和3730 遺傳分析儀進行檢測。結(jié)果采用Seqman 軟件分析。測序發(fā)現(xiàn)的突變進行反向測序驗證，并對NTDs 組中發(fā)現(xiàn)的突變在對照組中測序，驗證是否為NTDs 特有的突變。

表1 ZIC2 基因編碼區(qū)PCR 擴增引物序列Tab 1 Primers for amplification of ZIC2 coding region

2 結(jié)果

通過對NTDs 163 份胎兒DNAs 標本進行ZIC2 編碼區(qū)測序，發(fā)現(xiàn)一個同義突變c.1140G ＞A(圖1)，未發(fā)現(xiàn)錯義突變或重復缺失。同義突變c.1140G ＞A 位于第2 外顯子(圖2)，為1 例妊娠期37 周診斷為枕部腦膜腦膨出的女性胎兒。KEGG 數(shù)據(jù)庫分析ZIC2 結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)該同義突變位于ZIC2 的一個C2H2鋅指結(jié)構(gòu)中，該同義突變在對照組中進行基因分型未檢測到相同突變。

圖1 NTDs 病例中發(fā)現(xiàn)的同義突變c.1140G ＞A 測序圖Fig 1 Sequencing result highlighting the mutation c.1140G＞A in case

圖2 NTDs 病例中發(fā)現(xiàn)的突變在ZIC2 中位置Fig 2 Location of ZIC2 rare mutation identified in NTDs cases

3 討論

ZIC2 位于染色體13q32，其氨基酸序列高度保守。ZIC家族參與哺乳動物胚胎發(fā)生時期一系列發(fā)育過程，包括早期神經(jīng)格局、神經(jīng)嵴發(fā)育、小腦發(fā)育和左右對稱等［10］。在早期發(fā)育期ZIC 家族基因功能有重疊，但不同基因突變產(chǎn)生不同表型［11］。已有大量動物實驗表明ZIC2 參與神經(jīng)發(fā)育過程，ZIC2 基因敲除會出現(xiàn)NTDs 表型［12，16，17］。小鼠和人中發(fā)現(xiàn)Zic2 突變會造成前腦裂畸形、脊柱裂、神經(jīng)形成延遲和神經(jīng)嵴發(fā)育延遲［13］。Zic2 純合突變小鼠胚胎缺失背外側(cè)鉸鏈點(DLHP)不能形成閉合神經(jīng)管最終導致嚴重的脊柱裂，尤其是脊柱后端［16］。人類中也發(fā)現(xiàn)ZIC2 雜合基因突變，即13q32 區(qū)域雜合性缺失會導致前腦裂畸形［12］。目前在西方人群中完成的針對ZIC2 基因突變與NTDs 的相關(guān)性研究中，并未在ZIC2 中發(fā)現(xiàn)NTDs 患者特有的可以改變氨基酸序列的罕見基因突變［13，14］。Brown等［14］在173 例有西班牙裔種族背景的NTDs 患者中進行ZIC2 突變篩查，其中95%病例患有腰骶脊柱裂，5%病例患有腦膨出或其他類型NTDs，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)可導致讀碼框改變的突變，卻發(fā)現(xiàn)第1 外顯子中存在CAC 重復多態(tài)(c.718－720dupCAC)與NTDs 發(fā)生相關(guān)。但后續(xù)針對該位點在西班牙人群和南美人群中的深入研究結(jié)果并不支持該多態(tài)性位點與NTDs 發(fā)生相關(guān)［15，18］。此外在來自荷蘭的NTDs 人群研究中也沒有發(fā)現(xiàn)該多態(tài)性位點的存在，但該項研究在1 例男性脊柱裂患者ZIC2 第1 外顯子發(fā)現(xiàn)1 個丙氨酸密碼子缺失(c.94－96delGCG)，該突變遺傳自患者未患病的母親和外祖母［13］。

本研究NTDs 樣本均為因嚴重NTDs 而流產(chǎn)的胎兒，研究發(fā)現(xiàn)與既往歐洲人群樣本的研究結(jié)果一致，并未在ZIC2中發(fā)現(xiàn)NTDs 患者特有的可以改變氨基酸序列的罕見基因突變，同時也未檢測到c.718－720dupCAC 多態(tài)性位點和c.94－96delGCG 突變位點，進一步說明了ZIC2 蛋白序列的保守性和功能重要性。在NTDs 人群中發(fā)現(xiàn)的眾多專屬罕見突變及其功能研究表明這些罕見突變可能是造成NTDs 的原因［5～8］。本研究發(fā)現(xiàn)一個位于C2H2鋅指結(jié)構(gòu)的精氨酸同義突變，由于沒有父母樣本不能判斷是否為新發(fā)突變，但在正常對照組中測序結(jié)果顯示該同義突變是NTDs特異性的突變位點。雖然同義突變不會改變氨基酸序列，但是可能會影響ZIC2 蛋白正常生理功能的行使，甚至對其翻譯效率造成影響，因此該位點潛在的功能效應尚需進一步驗證。

本研究是首次在中國人群中進行與NTDs 相關(guān)的ZIC2基因突變篩查，與既往歐美人群中篩查ZIC2 基因突變研究不同的是，本研究采用的病例DNA 樣本來自極端嚴重NTDs 的流產(chǎn)胎兒，旨在找到可能與NTDs 發(fā)生關(guān)系更密切、致病效力更強的致命性突變。與來自其他人群的研究結(jié)果類似，本研究在嚴重NTDs 病例中并未找到ZIC2 基因錯義突變。

綜上所述，來自不同種族NTDs 人群的研究結(jié)果表明ZIC2 基因未檢測到編碼區(qū)錯義突變?？紤]到小鼠中Zic2基因敲除或者突變導致的各種NTDs 表型，推測有可能ZIC2 基因錯義突變將導致更早期的人體胚胎發(fā)育障礙，可能是早期胚胎自然流產(chǎn)的原因之一;因此在發(fā)育后期(孕15 周后)或者NTDs 存活患兒中檢測不到ZIC2 突變。只有在NTDs 病例中確認ZIC2 基因的啟動子、內(nèi)含子、3'UTR甚至基因拷貝數(shù)有無變異后，才能夠全面確認ZIC2 基因與人群NTDs 發(fā)生的關(guān)聯(lián)關(guān)系。

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