阿侖膦酸鈉與左旋精氨酸治療骨質(zhì)疏松大鼠的實(shí)驗(yàn)研究*

郭 宏 劉洪臣 顧 斌 黎曉暉 周和平 孫建合 黃靖香 汪愛(ài)媛 王 晶

隨著人口老齡化的加快，骨質(zhì)疏松不僅威脅老年人特別是絕經(jīng)后婦女的健康，而且已成為嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題。骨質(zhì)疏松癥同許多牙科疾病密切相關(guān)，如牙周病的發(fā)生，發(fā)展及治療；義齒修復(fù)的設(shè)計(jì)與療效；正畸治療；種植義齒修復(fù)等等。骨質(zhì)疏松癥已引起多學(xué)科醫(yī)生的高度重視，對(duì)于此癥的治療，雙膦酸鹽類藥物是研究最全面，療效最確切，應(yīng)用面最廣的品種，可用于各種類型的骨質(zhì)疏松癥治療，其第三代阿侖膦酸鈉和利塞膦酸鈉等已被證實(shí)是理想的最有潛力的防治骨質(zhì)疏松癥首選藥物之一。但由于其胃腸道反應(yīng)較大，長(zhǎng)期使用存在過(guò)度抑制骨轉(zhuǎn)換的危險(xiǎn)，新的更安全高效的治療骨質(zhì)疏松的藥物仍在研制中。另外，雙膦酸鹽類藥物與其它藥物的聯(lián)合應(yīng)用，也是目前研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)選擇阿侖膦酸鈉以及前期研究篩選的左旋精氨酸(10mg/kg)，對(duì)已鑒定為建模成功的骨質(zhì)疏松大鼠單獨(dú)或聯(lián)合用藥，觀察療效，為臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1.材料方法

1.1材料

1.1.1主要實(shí)驗(yàn)試劑 ALN(A lendronate)阿侖膦酸鈉(Merck Sharp&Dohm e(Italy)S.P.A.)；L-A rg(L-A rginine)左旋精氨酸(Sigma)；滅菌注射用水；10%中性福爾馬林。

1.1.2主要實(shí)驗(yàn)儀器 美國(guó)通用公司M icroCT(M icro-computerized tomography)掃描機(jī)；德國(guó)Leica公司骨組織計(jì)量學(xué)測(cè)試儀；美國(guó)公司生物力學(xué)測(cè)試儀；骨組織切片機(jī)。

1.2方法

1.2.1藥品配制 1.ALN 70mg溶解于滅菌注射用水100m l中，濃度為0.7m g/m l。參照Merck Sharp公司治療人類骨質(zhì)疏松癥的有效劑量、人與動(dòng)物給藥劑量的換算公式以及其他學(xué)者針對(duì)大鼠試驗(yàn)的有效劑量，本實(shí)驗(yàn)選擇70mg/kg,2次/周，皮下給藥。

L-A rg 2.5g溶解于滅菌注射用水100m l中，濃度為25mg/m l。

1.2.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組給藥 將32只OVX大鼠，8只Sham大鼠，分成Sham組、OVX組、OVX給藥組。給予不同藥物：ALN、L-A rg、ALN＋L-A rg。ALN組：皮下注射ALN，1.5mg/mg，2天/周。L-A rg組：L-A rg10mg/kg，5天/周。ALN+L-A rg組：皮下注射ALN，1.5mg/mg，2/周；以及L-A rg10m g/kg，5天/周。Sham組和OVX組皮下注射生理鹽水。給藥時(shí)間4周。

1.2.3標(biāo)本取材、固定 3%戊巴比妥鈉(40-50mg/kg)腹腔注射麻醉，眼球后取血，離心，分離血清，凍存。脫頸處死，立即取大鼠一側(cè)股骨、脛骨，去凈軟組織后，將骨標(biāo)本置入10%中性福爾馬林液中固定。

1.2.4外周血生物化學(xué)檢驗(yàn) 血標(biāo)本送解放軍總醫(yī)院生化科檢測(cè)鈣，磷，堿性磷酸酶及骨鈣素等。

1.2.5 M icroCT檢查 美國(guó)通用公司GEeXp lore Locus M icroCT掃描機(jī)：voltage 80V，current 450μA， num ber of view s 400， exposure tim e 2000ms，binmode1×1(分辨率)27μm。

(1)脛骨近心干骺端興趣區(qū)進(jìn)行360°連續(xù)斷層掃描500層。

(2)脛骨近心干骺端選取約1.8×1.5×1.4mm3區(qū)域進(jìn)行三維重建，分辨率27μm，灰度閾值為1040。

(3)存儲(chǔ)脛骨近心干骺端松質(zhì)骨三維體視計(jì)量學(xué)參數(shù)和骨密度參數(shù)。

1.2.6脫鈣骨組織病理學(xué)檢查 ①制備脛骨骨組織脫鈣切片；②HE染色；③Masson’s三色法染色。光學(xué)顯微鏡下觀察五組切片的脛骨近心干骺端松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)、形態(tài)。主要觀察區(qū)域?yàn)樯L(zhǎng)板下方約1mm處的次級(jí)海綿骨。

1.2.7骨組織計(jì)量學(xué)測(cè)量 脛骨近心干骺端骨組織脫鈣切片，HE染色。應(yīng)用德國(guó)徠卡顯微系統(tǒng)有限公司Leica DM I 4000B digitalm icroscope及軟件IPP Image-Pro Express對(duì)骨組織切片進(jìn)行組織計(jì)量學(xué)觀察。該測(cè)量系統(tǒng)由一臺(tái)光學(xué)、熒光顯微鏡連接著攝像機(jī)和電腦，加上骨組織計(jì)量學(xué)軟件組成。將興趣區(qū)拍照后，圖像存入電腦；手動(dòng)測(cè)量興趣區(qū)中骨組織周長(zhǎng)和骨小梁周長(zhǎng)，自動(dòng)生成骨組織面積和骨小梁面積。

按照如下公式得出松質(zhì)骨組織計(jì)量學(xué)計(jì)算參數(shù)。

(1)骨小梁面積比(%)Tb.A r=Tb.A r/T.A r*100%

(2)骨小梁數(shù)目(1/mm2)Tb.N=(1.199/2)*(Tb.Pm/T.A r)

(3)骨小梁分離度(mm)Tb.Sp=(2000/1.199)*(T.A r-Tb.A)/Tb.Pm

比較五組計(jì)量學(xué)計(jì)算參數(shù)之間是否有差異。

1.2.8生物力學(xué)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn) 將凍存于-80℃冰箱的待測(cè)股骨于實(shí)驗(yàn)前晚上取出，在4℃冰箱過(guò)夜。應(yīng)用美國(guó)MTS858M ini Bionix生物力學(xué)試驗(yàn)機(jī)對(duì)大鼠股骨進(jìn)行三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)，跨距2.5cm，加載速度2mm/m in，勻速加載，記錄載荷－變形曲線。根據(jù)此曲線可以測(cè)得最大載荷、最大撓度、彈性載荷、彈性撓度和能量吸收。于股骨斷端橫截面測(cè)得最大外徑B和最大內(nèi)徑b、最小外徑H和最小內(nèi)徑h，以及皮質(zhì)骨厚度。應(yīng)用公式可以計(jì)算出股骨的應(yīng)力和彈性模量等指標(biāo)。

長(zhǎng)骨生物力學(xué)參數(shù)計(jì)算公式：

截面慣性矩(J)(mm4)=л/64×(B×H3-b×h3)

最大應(yīng)力(N/mm2)=(最大載荷×H×跨距)/(8×慣性矩)(1:100稀釋)，保濕，4℃過(guò)夜。

(5)拿出后放37℃，30m in,PBS洗滌5m in×3次，加生物素化羊抗兔二抗，37℃，60m in，PBS洗滌5m in×3次。

(6)SABC復(fù)合物，37℃，孵育30m in，PBS洗滌5m in×3次。

(7)DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，封片。

(8)在顯微鏡下觀察IGF-1、OC蛋白表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用SPSS13.0One-W ay ANOVA方差分析，組間F檢驗(yàn)，兩兩比較t 檢驗(yàn)，P<0.05差異具有顯著性。

2.結(jié)果

2.1外周血生物化學(xué)檢驗(yàn) 檢測(cè)鈣，磷，堿性磷酸酶及骨鈣素等。

表1 不同藥物治療4周后OVX大鼠骨代謝生化指標(biāo)比較

彈性應(yīng)力(N/mm2)=(彈性載荷×H×跨距)/(8×慣性矩)。

彈性模量(E)(N/mm2)=(彈性載荷×跨距3)/(48×彈性撓度×慣性矩)。

彈性能量吸收(N.mm)=0.5×彈性載荷×彈性撓度。

比較五組最大載荷，彈性載荷，最大應(yīng)力和彈性應(yīng)力是否存在差異。

1.2.9免疫組織化學(xué)檢測(cè) 采用免疫組織化學(xué)染色對(duì)胰島素樣生長(zhǎng)因子(Insulin-like grow th factor-1,IGF-1)、OC在大鼠股骨組織中的表達(dá)進(jìn)行定位。

(1)石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3次。

(2)0.3%TritonX-100，37℃，20m in，PBS洗滌5m in×3次。

(3)5%BSA，37℃，封閉30m in。

(4)傾去封閉血清，加兔抗大鼠IGF-1、OC

如表1所示：大鼠去勢(shì)后，血清ALP和OC明顯升高。三組藥物治療后，兩項(xiàng)指標(biāo)均較OVX組降低，其中ALN+L-A rg組已低至正常值之下，且差異有顯著性；ALN組血清ALP下降，接近正常值，OC低至正常值以下；L-A rg組血清ALP下降顯著，OC較OVX組略有降低。

2.2 M icroCT檢查 脛骨M icroCT三維體視學(xué)及骨體積密度結(jié)果顯示：各項(xiàng)指標(biāo)組間存在顯著性差異。骨體積比、骨小梁數(shù)目，ALN組和L-A rg組較OVX組明顯升高，且高于Sham組，差異顯著。骨小梁厚度，ALN組接近Sham組，而L-A rg組明顯高于Sham 組。骨小梁數(shù)目，ALN組和L-A rg組較OVX組顯著減少，且低于Sham組，差異顯著；兩種藥物合用組，骨小梁分離度與OVX組無(wú)顯著性差異。骨體積密度，ALN組和L-A rg組明顯升高，特別是L-A rg組，但兩藥合用，骨密度值顯著低于單獨(dú)用藥。

表2 不同藥物治療4周后OVX大鼠MicroCT檢查

圖1 不同藥物治療4周后OVX大鼠脛骨松質(zhì)骨M icroCT三維重建比較

表3 不同藥物治療4周后OVX大鼠MicroCT檢查

2.3脫鈣骨組織病理學(xué)檢查 如圖2所示，三組給藥組的新生骨基質(zhì)較Sham組明顯增多，骨形成活躍，ALN組尤為突出。兩種藥物合用組，骨量較單獨(dú)用藥組減少，骨小梁連接性差，分離度大。

圖2 不同藥物治療后脛骨松質(zhì)骨Masson’s3色染色比較

2.4骨組織計(jì)量學(xué)測(cè)量 如表4所示，三組用藥組較OVX組骨面積比顯著升高，ALN組顯著高于Sham組，L-A rg組與Sham組無(wú)顯著性差異，合用組顯著低于Sham組。骨小梁厚度，三組均高于OVX組，與Sham組無(wú)顯著性差異。但骨小梁數(shù)目升高不明顯，三組與Sham組均有顯著性差異。用藥后，骨小梁分離度接近正常或高于正常值。

2.5生物力學(xué)三點(diǎn)彎曲試驗(yàn) 如表5圖3所示：OVX組最大應(yīng)力明顯降低，差異有顯著性，彈性應(yīng)力也降低，但差異不顯著。用藥后各項(xiàng)指標(biāo)均較OVX組升高，其中ALN組最大載荷、彈性載荷顯著性高于Sham組，最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力顯著性高于OVX組，與Sham組無(wú)顯著性差異。L-A rg組和ALN+L-A rg組，最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力雖比OVX組升高，但無(wú)顯著性差異。

表4 不同劑量L-Arg應(yīng)用4周后OVX大鼠脛骨計(jì)量學(xué)檢測(cè)指標(biāo)比較

表5 不同劑量L-Arg應(yīng)用4周后OVX大鼠股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)指標(biāo)比較

圖3 不同藥物治療后載荷、應(yīng)力比較

2.6免疫組織化學(xué)檢測(cè) GF-1免疫組化檢測(cè)顯示：OVX 組、L-A rg組IGF-1表達(dá)陰性；Sham組IGF-1有表達(dá)，主要在骨小梁表面成骨細(xì)胞聚集區(qū)；ALN組IGF-1表達(dá)陽(yáng)性。

圖4 IGF-1的免疫組化染色

圖5 骨鈣素的免疫組化染色

OC免疫組化檢測(cè)顯示，Sham 組表達(dá)陰性；OVX、ALN組有表達(dá)，主要在骨髓細(xì)胞、骨表面；L-A rg組表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性。

3.討論

本實(shí)驗(yàn)的目的是：實(shí)驗(yàn)研究ALN、L-A rg治療骨質(zhì)疏松大鼠的效果，初步探討藥物作用機(jī)理。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：ALN、L-A rg以及聯(lián)合用藥治療骨質(zhì)疏松大鼠，療效肯定但三組間有差異。單獨(dú)使用ALN或L-A rg療效好，且兩種藥物間差異不顯著。聯(lián)合用藥不能使兩種藥物的療效累加，且不如單獨(dú)用藥。聯(lián)合用藥可能過(guò)度抑制骨吸收，骨形成減少。

關(guān)于骨質(zhì)疏松癥的治療，雙膦酸鹽類藥物是研究最全面，療效最確切，應(yīng)用面最廣的品種，可用于各種類型的骨質(zhì)疏松癥治療，其第三代阿侖膦酸鈉和利塞膦酸鈉等已被證實(shí)是理想的最有潛力的防治骨質(zhì)疏松癥首選藥物之一。雙膦酸鹽可減少骨吸收，增加網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及骨量，增加骨密度，增加幅度在10%-30%。雙膦酸鹽還可降低骨轉(zhuǎn)換，改善骨小梁微結(jié)構(gòu)提高骨的質(zhì)量，最終減少骨折的發(fā)生率。雙膦酸鹽藥物的作用機(jī)理尚不完全清楚。以往研究發(fā)現(xiàn)其可能的機(jī)理有：1.干擾成熟破骨細(xì)胞的功能；2.在骨表面維持足夠的濃度梯度，直接影響破骨細(xì)胞活化啟動(dòng)的細(xì)胞間過(guò)程；3.改變使破骨細(xì)胞活化的骨基質(zhì)性質(zhì)[1-3]。上述三種機(jī)理互有聯(lián)系，均認(rèn)為雙膦酸鹽直接作用于破骨細(xì)胞。不同的雙膦酸鹽的藥理不盡相同：雙膦酸鹽與骨結(jié)合后，其作用主要由副鏈決定，阿侖膦酸鈉屬含氮類雙膦酸鹽，通過(guò)抑制焦磷酸鹽合成酶，阻止GPT酶信號(hào)蛋白的合成從而抑制破骨細(xì)胞功能，還可以改變破骨細(xì)胞的功能，包括細(xì)胞形態(tài)，間斷信號(hào)，破壞緩沖邊界等；除了抑制破骨細(xì)胞活性，含氮雙膦酸鹽還通過(guò)抑制破骨細(xì)胞募集、黏附，促進(jìn)凋亡減少細(xì)胞壽命從而減少破骨細(xì)胞的數(shù)量。另外此類藥物還通過(guò)抑制成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡從而增加成骨細(xì)胞的數(shù)量[4-7]。

觀察藥物療效的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，短期研究一般為4周，長(zhǎng)期研究為6個(gè)月。本實(shí)驗(yàn)選擇雙膦酸鹽類藥物ALN和一氧化氮供體L－A rg10mg/kg分別單獨(dú)用藥及聯(lián)合用藥治療骨質(zhì)疏松大鼠，評(píng)價(jià)三組藥物的短期治療效果，初步探討藥物的作用機(jī)制。

一氧化氮(NO)是重要的信使物質(zhì)和效應(yīng)分子，參與體內(nèi)眾多的生理和病理過(guò)程。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，NO在骨代謝及骨質(zhì)疏松癥的治療中也發(fā)揮著重要的作用。cNOS基因敲除動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，由于缺乏必需的NO，骨形成明顯缺陷，并對(duì)雌激素應(yīng)答降低。相對(duì)高濃度的NO，主要是指上調(diào)cNOS表達(dá)所產(chǎn)生的NO或由某些NO供體釋放產(chǎn)生的略高于正常濃度的NO，往往只表現(xiàn)為對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用，而對(duì)成骨細(xì)胞，非但沒(méi)有抑制作用，反而促進(jìn)其生成。研究顯示，給卵巢切除手術(shù)小鼠服用NO供體硝酸甘油，能通過(guò)抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成而有效降低小鼠骨丟失，功效與雌激素相當(dāng)。高濃度的NO，通常指iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的nmol水平NO，則會(huì)抑制成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的形成和分化。關(guān)于NO在骨代謝中的具體作用機(jī)制，目前仍不清楚。Wang等和Fan等都發(fā)現(xiàn)，NO的作用可能源于對(duì)OPG和RANKL的調(diào)節(jié)。NO能顯著增加OPG的水平并降低RANKL的表達(dá)，從而增加骨形成抑制骨吸收。也有研究發(fā)現(xiàn)，NO可通過(guò)調(diào)節(jié)堿性磷酸酶ALP調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞?，F(xiàn)已證實(shí)，NO在骨組織中發(fā)揮著重要作用，通過(guò)調(diào)節(jié)NOS表達(dá)可以調(diào)節(jié)骨代謝。因此，向骨組織中引入一定量的外源性NO，使之抑制破骨細(xì)胞骨吸收的同時(shí)，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖不影響或影響較小，有可能達(dá)到治療骨質(zhì)疏松的作用。這就為研究NO調(diào)控劑用于治療骨質(zhì)疏松提供了理論基礎(chǔ)。目前臨床上應(yīng)用的一些骨質(zhì)疏松治療藥物，如鈣劑、維生素D、雙膦酸鹽等，雖然取得了一定的療效，但由于不良反應(yīng)較多，限制了它們的應(yīng)用。而一些調(diào)控NO且具有抗骨質(zhì)疏松作用的藥物，由于具有多方面的優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)開(kāi)始嶄露頭角，越來(lái)越引起關(guān)注。胃腸道反應(yīng)是現(xiàn)有諸多治療骨質(zhì)疏松癥藥物的常見(jiàn)不良反應(yīng)，而NO在胃腸道中發(fā)揮著與PGs相似的調(diào)節(jié)粘膜完整性和粘膜血流量的作用，從而能夠保護(hù)胃腸道免受損傷[8-12]。

血清ALP、OC不僅作為鑒定大鼠骨質(zhì)疏松模型的一個(gè)重要生化指標(biāo)被選擇，在本實(shí)驗(yàn)中，同樣作為一個(gè)重要指標(biāo)以測(cè)定不同藥物治療骨質(zhì)疏松的效果。ALN使OVX大鼠ALP、OC值顯著減少，骨轉(zhuǎn)換降低，表現(xiàn)為抑制骨吸收；L-A rg10mg/kg降低ALP作用強(qiáng)，顯著低于Sham組，但OC值降低不明顯，與OVX大鼠無(wú)顯著性差異，顯著高于Sham組，提示在抑制骨吸收的同時(shí)促進(jìn)骨形成；ALN和L-A rg10mg/kg聯(lián)合用藥，降低ALP、OC值明顯，顯著低于Sham組，表現(xiàn)為過(guò)度抑制骨轉(zhuǎn)換。三組給藥組均呈現(xiàn)低血鈣，血磷異常，提示：ALN和L-A rg治療大鼠骨質(zhì)疏松癥，應(yīng)注意補(bǔ)鈣。

M icroCT三維圖像清晰顯示三組藥物治療后，ALN組、L-A rg組骨小梁致密，骨量顯著增加，高于Sham組；L-A rg組比ALN組效果更顯著，骨小梁排列更致密，分離度很??；兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用，骨小梁排列不均勻，骨量比OVX組增加，但顯著小于分別給藥的兩組。存儲(chǔ)松質(zhì)骨三維體視計(jì)量學(xué)參數(shù)和骨密度參數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析：各項(xiàng)指標(biāo)組間存在顯著性差異；骨體積比、骨小梁數(shù)目，ALN組和L-A rg組較OVX組明顯升高，且顯著高于Sham組；骨小梁厚度，ALN組接近Sham組，而L-A rg組明顯高于Sham 組。聯(lián)合用藥組，骨小梁體積比、厚度、分離度與OVX組比無(wú)顯著性差異，骨小梁數(shù)目顯著高于OVX組。骨體積密度，ALN組和L-A rg組顯著高于Sham組，L-A rg組骨體積密度值尤其高，但兩藥合用，骨密度值顯著高于OVX組，但顯著低于單獨(dú)用藥組和Sham組。提示：?jiǎn)为?dú)應(yīng)用ALN和L-A rg治療大鼠骨質(zhì)疏松，骨量明顯增加，骨小梁結(jié)構(gòu)更致密；聯(lián)合用藥雖有一定療效，但不如單獨(dú)用藥組。兩種藥物可能競(jìng)爭(zhēng)作用靶點(diǎn)，過(guò)度抑制骨轉(zhuǎn)換，不適合聯(lián)合應(yīng)用。

脫鈣骨組織切片檢查可以精細(xì)觀察骨小梁形態(tài)和結(jié)構(gòu)的改變，三組給藥組的新生骨基質(zhì)較Sham組明顯增多，骨形成活躍，ALN組尤為突出。聯(lián)合用藥組，骨量較單獨(dú)用藥組明顯減少，骨小梁連接性差，分離度大。

上述不同檢測(cè)方法所得結(jié)果一致性好，相互印證，相互補(bǔ)充。骨組織切片計(jì)量學(xué)結(jié)果再次驗(yàn)證上述結(jié)果。

研究骨量變化的最終目的在于研究骨骼力學(xué)強(qiáng)度的變化和再負(fù)荷時(shí)骨折發(fā)生的可能性大小。彈性負(fù)荷和最大負(fù)荷是反映骨質(zhì)結(jié)構(gòu)力學(xué)特性的有效指標(biāo)，主要受骨尺寸大小和幾何形狀的影響。彈性載荷是骨骼在彈性變形階段所能承受的最大載荷。如果骨骼的彈性載荷值變小，表明骨骼在外力負(fù)荷的作用下更容易發(fā)生塑性變形，產(chǎn)生不可逆的損傷。最大載荷是骨骼所能承受的極限載荷，如果外力大于最大載荷，骨骼則發(fā)生骨折。ALN、L-A rg能顯著提高股骨干的最大載荷，說(shuō)明股骨干抵抗外力負(fù)荷的能力提高，塑性變形和骨折的發(fā)生率下降。骨材料力學(xué)特性反映骨質(zhì)組成成分及其空間結(jié)構(gòu)變化對(duì)骨力學(xué)特性的影響。最大應(yīng)力主要受骨骼有機(jī)相質(zhì)量的影響，彈性應(yīng)力主要受骨骼無(wú)機(jī)相質(zhì)量的影響[13-15]。ALN組大鼠股骨干的最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力顯著高于OVX組，與Sham 組無(wú)顯著性差異，提示ALN組大鼠股骨的有機(jī)相和無(wú)機(jī)相的質(zhì)量有所改善，股骨干的材料強(qiáng)度顯著提高。L-A rg組最大應(yīng)力、彈性應(yīng)力與Sham、ALN組比均無(wú)顯著性差異，提示L-A rg改善股骨生物力學(xué)性能的作用與ALN組相當(dāng)。骨的力學(xué)強(qiáng)度取決于骨的尺寸大小、幾何參數(shù)和材料強(qiáng)度，換句話說(shuō)就是，骨的力學(xué)強(qiáng)度決定于骨量的多少和骨量的分布及構(gòu)造。大鼠去除雙側(cè)卵巢后，股骨的骨量減少、材料強(qiáng)度下降。理想的防治措施應(yīng)該是增加骨量的同時(shí)提高材料強(qiáng)度，或者是增加骨量的同時(shí)不損傷材料強(qiáng)度。本研究表明，阿侖膦酸鈉在不改變骨的幾何參數(shù)的情況下，通過(guò)提高骨組織的材料強(qiáng)度而提高骨的力學(xué)強(qiáng)度。骨骼的材料強(qiáng)度決定于單位體積內(nèi)骨量的多少和骨質(zhì)的排列方式[16-18]。ALN、L-A rg提高骨質(zhì)疏松大鼠骨組織材料強(qiáng)度的機(jī)制可能與以下幾個(gè)因素有關(guān)：1.提高單位體積內(nèi)的骨量2.改善骨基質(zhì)的排列結(jié)構(gòu)。骨材料力學(xué)強(qiáng)度的提高可能與骨基質(zhì)的礦化程度升高、礦鹽的分布更加均勻、骨基質(zhì)的排列結(jié)構(gòu)得到改善有關(guān)。

細(xì)胞因子是一類由多種細(xì)胞產(chǎn)生的極微量的、具有廣譜生物學(xué)活性的小分子多肽。在造血、免疫細(xì)胞的發(fā)育分化及免疫應(yīng)答、創(chuàng)傷愈合和再生以及某些細(xì)胞的激活過(guò)程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。它既不屬于免疫球蛋白，也不屬于激素[95]。細(xì)胞因子分子量較小，在天然免疫和特異性免疫中發(fā)揮作用，其生物活性很強(qiáng)，可由多種不同細(xì)胞類型產(chǎn)生，細(xì)胞因子分泌是個(gè)自限性過(guò)程，作用方式有自分泌作用(Autocrineaction)，即某類細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子可直接作用于該細(xì)胞自身；旁分泌作用(Paracrine action)，即某類細(xì)胞釋放出的細(xì)胞因子可作用于鄰近的其它細(xì)胞。細(xì)胞因子必須與細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合，才能發(fā)揮作用，具有多重調(diào)節(jié)作用，細(xì)胞因子之間具有相互作用。生長(zhǎng)因子中對(duì)骨組織最有影響力的是IGF-1，在肝臟中合成后與載體蛋白結(jié)合進(jìn)入血循環(huán)。IGF-1是由70個(gè)氨基酸組成的具有內(nèi)分泌、自分泌和旁分泌性的單鏈多肽。血液中的IGF-1主要由人的肝細(xì)胞合成和釋放，成骨細(xì)胞等也能合成IGF-1。IGF-1具有類似胰島素的代謝作用；在骨發(fā)育和重建過(guò)程中，IGF-1還是骨生長(zhǎng)重要的自分泌或旁分泌的調(diào)節(jié)者，用轉(zhuǎn)基因小鼠研究IGF-1基因過(guò)度表達(dá)和破壞表明IGF-1在產(chǎn)后對(duì)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)起重要作用。IGF-1在一生中廣泛表達(dá)以維持分化的細(xì)胞活性，在生長(zhǎng)和組織修復(fù)時(shí)表達(dá)增加。由于對(duì)IGF-1，IGF-1受體和IGF-BPs的基因結(jié)構(gòu)及對(duì)IGF-1作用的認(rèn)識(shí)，IGF-1對(duì)臨床疾病治療方面潛在的使用價(jià)值正在被認(rèn)識(shí)和進(jìn)一步研究。在骨質(zhì)疏松中的治療作用：研究表明，血清IGF-1水平和骨礦物質(zhì)含量密切相關(guān)，IGF-1水平高者，椎體、股骨頸及腕部的骨密度升高。原發(fā)性骨質(zhì)疏松的病人用外源性GH及IGF-1治療，骨形成增加，但骨量變化較小，這可能與IGF-1同時(shí)刺激骨形成和骨吸收有關(guān)[19-23]。

本實(shí)驗(yàn)IGF-1免疫組化檢測(cè)顯示：OVX組、L-A rg組IGF-1表達(dá)陰性；Sham組IGF-1有表達(dá)，主要在骨小梁表面成骨細(xì)胞聚集區(qū)；ALN組IGF-1表達(dá)陽(yáng)性。提示ALN治療骨質(zhì)疏松大鼠，提高骨量、改善骨結(jié)構(gòu)，其作用機(jī)制可能有IGF-1參與。OC免疫組化檢測(cè)顯示： Sham 組表達(dá)陰性；OVX、ALN組有表達(dá)，主要在骨髓細(xì)胞、骨表面； L-A rg組表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，提示L-A rg促進(jìn)骨形成、顯著提高骨礦沉積率。ALN和L-A rg治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制，還需深入研究。相關(guān)蛋白組學(xué)及分子生物學(xué)的研究正在進(jìn)行中。

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